摘""要：檳榔是海南省重要的熱帶經(jīng)濟作物，由植原體侵染引起的檳榔黃化?。╝reca"palm"yellow"leaf"disease，"YLD）是當前我國檳榔生產(chǎn)上的一種毀滅性病害。為了建立精準高效的檳榔黃化植原體檢測方法，本研究基于檳榔黃化植原體16S"rDNA基因，設計并合成特異性引物AMf/AMr和探針AM-Prode，使用該方法進行準確性、敏感性、特異性及重復性測試，并在其他植物的植原體病害進行檢測。結(jié)果顯示：本檢測方法能夠準確的檢測出陽性樣品，健康樣品無擴增曲線；在敏感性測試中，該檢測方法能檢測到1.16×101"copies/μL樣本濃度水平，其標準曲線方程為y=–3.4185x"+"43.624，擴增效率為96.12%，相關系數(shù)R2=0.9833；在特異性測試中，該檢測方法對YLD的檢測具有較好的特異性，檳榔、檳榔其他病害病原及其內(nèi)生菌的基因組對本方法未造成干擾；在重復性測試中，該檢測方法對檳榔黃化病的檢測具有較好的重復性；并且該檢測方法可對苦楝黃化病、細圓藤叢枝病及辣椒黃化病等8種植原體病害進行檢測，對植原體的檢測具有一定的通用性。本檢測方法的建立，有利于為檳榔黃化病的精準診斷、病原監(jiān)測及媒介昆蟲的檢測等研究提供可靠的技術手段。

關鍵詞：檳榔；檳榔黃化?。恢苍w；TaqMan實時熒光定量PCR；病害檢測中圖分類號：S763.7""""""文獻標志碼：A

Establishment"of"TaqMan"Probe"Real-time"Fluorescent"Quantitative"PCR"Detection"Method"for"Areca"Palm"Yellow"Leaf"Phytoplasma

LIN"Zhaowei，"MENG"Xiuli，"TANG"Qinghua，"NIU"Xiaoqing，"SONG"Weiwei*

Coconut"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Hainan"Innovation"Center"of"Academician"Team，"Wenchang，"Hainan"571339，"China

Abstract："Areca"palm"is"an"important"tropical"economic"crop"in"Hainan"Province."Areca"palm"yellow"leaf"disease"（YLD）"caused"by"phytoplasma"infection"is"a"devastating"disease"in"the"production"of"arecanbsp;in"China."In"order"to"establish"an"accurate"and"efficient"detection"method"for"areca"palm"yellow"leaf"phytoplasma，"this"study"designed"and"synthesized"specific"primers"AMf/AMr"and"AM-Prode"based"on"the"16S"rDNA"gene"of"areca"palm"yellow"leaf"phytoplasma."The"method"was"used"to"test"the"accuracy，"sensitivity，"specificity"and"repeatability，"and"to"detect"phytoplasma"diseases"in"other"plants."The"method"could"accurately"detect"the"positive"samples，"and"the"healthy"samples"had"no"amplification"curve."In"the"sensitivity"test，"the"method"could"detect"the"sample"concentration"level"of"1.16×101"copies/μL，"and"the"standard"curve"equation"was"y=–3.4185x+43.624，"the"amplification"efficiency"was"96.12%，"and"the"correlation"coefficient"R2=0.9833."In"the"specificity"test，"the"method"had"good"specificity"for"the"detection"of"YLD，"and"the"genomes"of"areca，"other"disease"pathogens"and"the"endophytes"did"not"interfere"with"the"method."In"the"repeatability"test，"the"method"had"good"repeatability"for"the"detection"of"YLD."The"detection"method"could"be"used"to"detect"8"phytoplasma"diseases"such"as"chinaberry"yellow"leaf"disease，"‘Pericampylus"glaucus’"witches'"broom"disease"and"pepper"yellow"leaf"disease"and"the"detection"of"phytoplasma"has"certain"universality."The"establishment"of"detection"method"is"conducive"to"providing"reliable"technical"means"for"the"accurate"diagnosis"of"YLD，"pathogen"monitoring"and"vector"insect"detection.

Keywords："areca;"areca"palm"yellow"leaf"disease;"phytoplasma;"TaqMan"qPCR;"disease"detection

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.06.004

檳榔（Areca"catechu"L.）是棕櫚科檳榔屬多年生熱帶經(jīng)濟作物，中國的“四大南藥”之首。在我國，檳榔栽培于海南、臺灣及云南等地，其中海南省檳榔種植面積占全國總面積的95%以上，產(chǎn)量位居世界第二位[1]。目前，檳榔作為海南省重要的熱帶經(jīng)濟作物，是海南省政府重點發(fā)展的“六棵樹”之一，也是海南省中東部地區(qū)230萬農(nóng)民收入的主要經(jīng)濟來源[2]。

由植原體侵染引起的檳榔黃化?。╝reca"palm"yellow"leaf"disease，"YLD）是當前我國檳榔生產(chǎn)上的一種毀滅性病害。該病于1981年在我國的海南省屯昌縣發(fā)生為害[3]，目前已蔓延至海南省各市縣的檳榔種植區(qū)[4]。檳榔黃化病在檳榔生產(chǎn)上的為害逐年加重，輕者減產(chǎn)10%～20%，重者減產(chǎn)50%～60%，局部地區(qū)甚至毀種絕收。據(jù)不完全統(tǒng)計，每年因黃化病造成的經(jīng)濟損失高達20億元以上，嚴重影響海南省農(nóng)民脫貧致富和農(nóng)村經(jīng)濟增長[5]。

精準的病原檢測有利于對病害的診斷。TaqMan熒光定量PCR技術目前廣泛應用于臨床疾病診斷和動植物檢驗檢疫上。為了建立精準高效的檳榔黃化植原體檢測方法，本研究基于檳榔黃化植原體的16S"rDNA基因序列設計特異性引物和探針，并對該方法的準確性、敏感性、特異性及重復性進行了驗證，以期為YLD精準診斷、病原監(jiān)測及媒介昆蟲檢測的研究提供可靠的技術手段。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""供試樣品""檳榔黃化植原體DNA通過通用引物P1/P7[6]與R16F2n/R16R2[7]巢氏PCR檢測為陽性，檳榔長線形病毒1（Areca"palm"velarivirus"1，"APV1）cDNA、檳榔壞死環(huán)斑病毒（Areca"palm"necrotic"ringspot"virus，"ANRSV）cDNA分別通過RT-qPCR、RT-PCR檢測為陽性[8-9]，上述樣品由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院椰子研究所提供；檳榔炭疽菌（c."gloeosporioides）、檳榔葉片分離的內(nèi)生或致病細菌：Burkholderia"andropogonis、Pantoea"ananatis、Sphingomonas"yantingensis、Curtobacterium"albidum、Bacillus"cereus、Frondihabitans"australicus基因組DNA由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院椰子研究所提供；健康檳榔葉片樣品采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院椰子研究所檳榔苗圃；銀膠菊叢枝植原體（16SrⅡ-A亞組）、長春花小葉植原體（16SrⅠ-B亞組）DNA由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所饋贈；竹叢枝植原體（16SrI-B亞組）、苦楝黃化植原體（16SrI-B亞組）、細圓藤叢枝植原體（16SrⅠ-B亞組）、辣椒黃化植原體（16SrⅠ-B亞組）、山黃麻叢枝植原體（16SrXXXⅡ-D亞組）、花生叢枝植原體（16SrⅡ-A亞組）DNA及上述對應的健康樣品DNA由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院椰子研究所提供。

1.1.2""主要試劑與儀器""主要試劑：植物總DNA提取試劑盒、2×Taq"PCR"mix、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒及實時熒光定量PCR（探針法）試劑盒購自天根生物科技（北京）有限公司；pMDTM18-T"Vector購自TaKaRa公司；DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

主要儀器：5810R型臺式冷凍離心機，Bio-Rad"T100"PCR儀器，QuantStudio"3"Real-time定量PCR儀，超微量分光光度計Thermo"ND2000。

1.2""方法

1.2.1""引物與探針設計及合成"""根據(jù)檳榔黃化植原體16S"rDNA基因序列（GenBank登錄號：KF728948.1），利用Primer"Express"3.0軟件在該基因保守的區(qū)域設計熒光定量PCR特異性引物AMf/AMr和AM-Prode探針（表1）。合成植原體16S"rDNA基因巢氏PCR通用引物P1/P7[6]與R16F2n/R16R2[7]用于構建陽性質(zhì)粒標準品。引物與探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物采用PAGE純化，探針采用HPLC純化。

1.2.2""DNA提取""取樣品葉片0.1"g，參照植物總DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取，并于–20"℃保存。

1.2.3""實時熒光定量PCR驗證引物和探針的準確性""使用引物AMf/AMr和探針AM-Prode對5份經(jīng)巢氏PCR擴增測序的陽性樣品進行實時熒光定量PCR，健康檳榔樣品作為陰性對照，無菌無酶ddH2O作為空白對照。反應體系：2×SuperReal"PreMix（Probe）10"μL，正、反向引物（10"μmol/L）各0.6"μL，熒光探針（10"μmol/L）0.4"μL，DNA模板2"μL，50×ROX"Reference"Dye*3"0.2"μL，加ddH2O至20"μL。反應程序：95"℃預變性15"min；95"℃變性3"s，60"℃退火/延伸30"s，45個循環(huán)。

1.2.4""陽性質(zhì)粒標準品的制備""使用第一步引物P1/P7與第二步引物R16F2n/R16R2，以陽性檳榔黃化病樣品的DNA為模板，健康檳榔樣品DNA陰性對照，ddH2O為空白對照進行巢式PCR，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下目的條帶，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行目的條帶純化，純化后產(chǎn)物連接到"pMDTM18-T"Vector，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞中，篩選并提取陽性克隆子的質(zhì)粒，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序正確的質(zhì)粒使用超微量分光光度計測定濃度，置于–20"℃保存?zhèn)溆?。運用SHIRIMA等[10]的方法計算重組質(zhì)粒中的拷貝數(shù)，重組質(zhì)?？截悢?shù)（copies/μL）=（NA×C）/（109×重組質(zhì)粒堿基對數(shù)×660"dalton/bp）。其中NA為阿伏伽德羅常數(shù)，6.02×1023；C為重組質(zhì)粒的濃度（ng/μL）。最終計算得到重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)為1.16×1010"copies/μL。熒光定量PCR反應體系及程序參照1.2.3，巢式PCR反應體系及程序參照林兆威等[11]的方法。

1.2.5""敏感性測試與標準曲線的建立""以陽性質(zhì)粒標準品為初始模板，梯度稀釋出濃度依次為1.16×107、1.16×106、1.16×105、1.16×104、1.16×103、1.16×102、1.16×101、1.16×100"copies/μL。以此8個梯度濃度陽性質(zhì)粒標準品為模板，健康檳榔樣品為陰性對照，進行實時熒光定量PCR，反應體系及程序參照1.2.3。得到動力學擴增曲線和PCR擴增循環(huán)閾值（Ct）。運用Excelnbsp;2020軟件，以Ct值為縱坐標，10為底質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)值為橫坐標繪制標準曲線，獲得回歸直線方程，并計算該組體系的擴增效率：擴增效率（%）=10（–1/斜率）–1。

1.2.6""特異性測試""以檳榔黃化植原體的DNA為陽性對照（CK+），健康檳榔DNA為陰性對照（CK–），ANRSV、APV1的cDNA，檳榔炭疽菌、Burkholderia"andropogonis、Pantoea"ananatis、Sphingomonas"yantingensis、Curtobacterium"albidum、Bacillus"cereus、Frondihabitans"australicus的DNA為模板進行實時熒光定量PCR，檢測其特異性，反應體系和程序參照1.2.3。

1.2.7""重復性測試""選取1.16×105、1.16×104、1.16×103"copies/μL三個濃度的陽性質(zhì)粒標準品為模板，進行實時熒光定量PCR檢測，每個濃度重復3次，共檢測3次，進行組內(nèi)重復性試驗，計算Ct值的變異系數(shù)。同時，將上述濃度的陽性質(zhì)粒標準品于–20"℃保存3、6、9"d，以相同反應條件重復進行組間試驗，計算Ct值的變異系數(shù)，驗證該方法的重復性。反應體系和程序參照1.2.3。

1.2.8""不同植物植原體上的檢測""對銀膠菊叢枝植原體、竹叢枝植原體、長春花小葉植原體、苦楝黃化植原體、細圓藤叢枝植原體、辣椒黃化植原體、山黃麻叢枝植原體及花生叢枝植原體等8種不同植物的植原體DNA進行實時熒光定量PCR檢測，對應的8種植物健康樣品DNA為陰性對照，無酶無菌ddH2O為空白對照，反應體系和程序參照1.2.3。

2""結(jié)果與分析

2.1""實時熒光定量PCR驗證引物和探針的準確性

使用引物AMf/AMr和探針AM-Prode對陽性樣品、健康檳榔樣品進行TaqMan"qPCR。如圖1所示，陽性樣品均出現(xiàn)“S”形擴增曲線，且曲線平滑，而陰性樣品和空白對照未出現(xiàn)擴增曲線，說明該熒光定量PCR的引物/探針組合能檢測到檳榔黃化植原體，可進一步驗證該引物/探針組合其他特性。

2.2""敏感性測試與標準曲線的建立

將構建好的陽性質(zhì)粒標準品濃度按10的倍數(shù)逐級稀釋，以8個梯度濃度陽性質(zhì)粒為模板，健康檳榔樣品為陰性對照，進行TaqMan"qPCR，并利用Ct值與質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)構建標準曲線。結(jié)果表明，該引物/探針組合能檢測到1.16×101"copies/μL樣本濃度水平（圖2），標準曲線顯示，Ct值與拷貝數(shù)的對數(shù)呈線性關系，其標準曲線方程為y=-3.4185x+43.624，擴增效率為96.12%，相關系數(shù)R2=0.9833（圖3）。

2.3""特異性測試

使用檳榔黃化植原體和檳榔中主要的病害病原及內(nèi)生菌進行TaqMan"qPCR特異性驗證，結(jié)果如圖4所示，僅YLD出現(xiàn)擴增曲線，健康檳榔、APV1、ANRSV、檳榔炭疽菌、B."andropogonis、P."ananatis、S."yantingensis、C."albidum、B."cereus、F."australicus均未出現(xiàn)擴增曲線，說明該檢測方法對YLD的檢測具有較好的特異性，檳榔、檳榔其他病害病原及其內(nèi)生菌的基因組對本方法未造成干擾。

2.4""重復性測試

選取濃度為1.16×105、1.16×104、1.16×103"copies/μL的陽性標準品為模板，進行TaqMan"qPCR檢測，分別驗證該方法的組內(nèi)和組間的重復性，結(jié)果如表2所示，組內(nèi)變異系數(shù)小于1%，組間變異系數(shù)小于2%，該方法對YLD的檢測具有較好的重復性。

2.5""不同植物植原體上的檢測

如圖5所示，供試的銀膠菊叢枝植原體、竹叢枝植原體、長春花小葉植原體、苦楝黃化植原體、細圓藤叢枝植原體、辣椒黃化植原體、山黃麻叢枝植原體及花生叢枝植原體通過該TaqMan"qPCR方法檢測均為植原體陽性，而對應的健康樣品無擴增曲線，說明本方法對植原體的檢測具有一定的通用性，可用于檢測上述植原體病害。

3""討論

在大多數(shù)植原體病害的檢測中，常用巢氏PCR通用引物P1/P7[6]與R16F2n/R16R2[7]，并將R16F2n/R16R2擴增的全長序列進行虛擬限制性片段長度多態(tài)性（restriction"fragment"lengthpolymorphism，"RFLP）分析作為植原體鑒定的重要依據(jù)之一。由于上述巢氏PCR通用引物的敏感性較低，不利于低濃度病原的檢測，因此，在植原體檢測中常建立適用于該作物、該病害的檢測技術。鹿鵬鵬等[12]基于16S"rDNA基因建立了劍麻紫色卷葉病相關植原體單管巢式PCR檢測方法，該檢測技術最低檢測限濃度為≥1"fg/μL；韓劍等[13]基于16S"rDNA基因建立了棗瘋病植原體TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法，該方法敏感性達60"copies/μL；張榮躍等[14]基于Sec"A基因建立了甘蔗白葉病植原體PCR檢測方法，該方法敏感性達50"fg/μL。不同的病原檢測方法均具有優(yōu)缺點，考慮方法的敏感性、特異性及重復性等問題的同時，也應考慮檢測成本。如巢氏PCR檢測成本低，但敏感性相對較低，熒光定量PCR檢測所需設備昂貴，但敏感性較高。因此，針對不同作物、不同種類病原及其病害發(fā)病特點采取適宜的檢測技術。如病原濃度高的植原體病害，可采取低成本的巢氏PCR檢測技術即可完成絕大多數(shù)的檢測需求。檳榔黃化病植原體具有分布不均勻[15]、濃度含量低的特點，因此所需敏感性較高的檢測方法。目前，國內(nèi)檳榔黃化植原體檢測主要有巢氏PCR[16]、環(huán)介導等溫擴增（loop"mediated"isothermal"amplification，"LAMP）[17]、實時熒光定量PCR[15]及微滴式數(shù)字PCR（droplet"digital"PCR，"ddPCR）[18]等方法。巢氏PCR檢測方法受限于敏感性的原因，因此未能在YLD檢測中大量使用。國內(nèi)檳榔黃化病LAMP檢測技術的敏感性為200"ag/μL[17]，實時熒光定量PCR檢測方法的敏感性為1.16×104"copies/μL[15]，而本研究建立的TaqMannbsp;qPCR敏感性達1.16×101"copies/μL（換算為50"ag/μL），敏感性高于上述2個檢測方法。微滴式數(shù)字PCR敏感性達0.07"copies/μL[18]，且樣本含量可絕對定量，但成本高、儀器設備昂貴，由于條件受限，目前尚未大量使用。

本檢測方法所需的引物和探針對檳榔黃化植原體具有高度特異性，才能避免非特異性擴增，而檳榔黃化植原體16S"rDNA基因與部分檳榔葉綠體基因組序列同源性較高。因此，本試驗在檳榔黃化植原體16S"rDNA基因保守區(qū)域，且與檳榔葉綠體基因組特異的位置設計引物和探針，經(jīng)大量篩選，獲得特異性引物AMf/AMr和探針AM-Prode。經(jīng)測試，該檢測方法具有較好的敏感性、特異性及重復性，滿足于日常的檳榔黃化植原體檢測。并且將該方法應用于苦楝黃化病、細圓藤叢枝病及辣椒黃化病等其他8種植原體病害中，能夠區(qū)別健康和感病材料，說明本方法適用于其他植物植原體的檢測，具有一定的通用性，可用于對其他植物植原體病害或疑似檳榔黃化病中間寄主進行初步診斷。

在應用方面，該方法實現(xiàn)了海南省17個市縣的926分樣品的黃化病檢測，研究結(jié)果明確了植原體為海南省檳榔病理性黃化的主要病原之一[4]；并對檳榔種苗和檳榔采摘工具進行了檢測，實現(xiàn)了一直以來由于種苗植原體含量較低造成檢測難的問題[19]；在其他植物植原體病害的應用方面，對葉下珠黃化和叢枝癥狀樣本進行初步的診斷，并發(fā)現(xiàn)葉下珠為植原體侵染的新寄主[11]。目前，該技術在本課題組已應用于植原體含量較低的疑似檳榔黃化病媒介昆蟲的檢測。

參考文獻

[1]"楊連珍，"劉小香，"李增平."世界檳榔生產(chǎn)現(xiàn)狀及生產(chǎn)技術研究[J]."世界農(nóng)業(yè)，"2018（7）："121-128.YANG"L"Z，"LIU"X"X，"LI"Z"P."Prodection"and"planting"techniques"of"areca"nut[J]."World"Agriculture，"2018（7）："121-128."（in"Chinese）

[2]"傅琪彥，"符秀娟，"林麗珍，"丁兆建."海南省檳榔產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及對策[J]."鄉(xiāng)村科技，"2021，"12（9）："27-28，"32.FU"Q"Y，"FU"X"J，"LIN"L"Z，"DING"Z"J."Development"status"and"countermeasures"of"areca"nut"industry"in"Hainan"province[J]."Rural"Science"and"Technology，"2021，12（9）："27-28，"32."（in"Chinese）

[3]"趙健生."檳榔黃化病調(diào)查報告[J]."熱帶作物科技，"1985（1）："64-69.ZHAO"J"S."Investigation"report"on"areca"palm"yellow"leaf"disease[J]."Tropical"Crop"Technology，"1985（1）："64-69."（in"Chinese）

[4]"林兆威，"唐慶華，"孟秀利，"宋薇薇，"余鳳玉，"黃山春，"牛曉慶，"覃偉權."海南省檳榔病理性黃化發(fā)生分布情況及其植原體檢測分析[J]."熱帶作物學報，"2022，"43（10）："2106-2113.LIN"Z"W，"TANG"Q"H，"MENG"X"L，"SONG"W"W，"YU"F"Y，"HUANG"S"C，"NIU"X"Q，"QIN"W"Q."Occurrence"and"distribution"of"areca"pathological"yellowing"in"Hainan，"China"and"its"phytoplasma"detection"analysis[J]."Chinese"Journal"of"Tropical"Crops，"2022，"43（10）："2106-2113."（in"Chinese）

[5]"車海彥，"曹學仁，"禤哲，"羅大全."檳榔黃化病“該防”還是“該治”[J]."中國熱帶農(nóng)業(yè)，"2018（5）："46-48.CHE"H"Y，"CAO"X"R，"XUAN"Z，"LUO"D"Q."Should"areca"palm"yellow"leaf"disease"be"prevented"or"treated[J]."China"Tropical"Agriculture，"2018（5）："46-48."（in"Chinese）

[6]"SCHNEIDER"B，"SEEMUELLER"E，"SMART"C"D，"KIRKPATRICK"B"C."Phylogenetic"classification"of"plant"pathogenic"mycoplasma-like"organisms"or"phytoplasmas[J]."Molecular"and"Diagnostic"Procedures"in"Mycoplasmology，"1995，"I："369-380.

[7]"LEE"I"M，"HAMMOND"R"W，"DAVIS"R"E，"GUNDERSEN"D"E."Universal"amplification"and"analysis"of"pathogen"16S"rDNA"for"classification"and"identification"of"mycoplasmalike"organisms[J]."Phytopathology，"1993，"83（8）："834-842.

[8]"林兆威，"牛曉慶，"唐慶華，"宋薇薇，"孟秀利，"覃偉權."檳榔隱癥病毒1型TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立[J]."熱帶作物學報，"2021，"42（11）："3087-3092.LIN"Z"W，"NIU"X"Q，"TANG"Q"H，"SONG"W"W，"MENG"X"L，"QIN"W"Q."Development"of"a"TaqMan"real-time"fluorescent"quantitative"PCR"method"for"detection"of"areca"palm"velarivirus"1[J]."Chinese"Journal"of"Tropical"Crops，"2021，"42（11）："3087-3092."（in"Chinese）

[9]"崔紅光，"楊柯."檳榔壞死環(huán)斑病毒及其檢測方法："CN110643579A[P]."2020-01-03.CUI"H"G，"YANG"K."Areca"palm"necrotic"ringspot"virus"and"its"detection"method："CN110643579A[P]."2020-01-03."（in"Chinese）

• SHIRIMA"R"R，"MAEDA"D"G，"KANJU"E，"CEASAR"G，"TIBAZARWA"F"I，"LEGG"J"P."Absolute"quantification"of"cassava"brown"streak"virus"mRNA"by"real-time"qPCR[J]."Journal"of"Virological"Methods，"2017，"245："5-13.
• 林兆威，"牛曉慶，"唐慶華，"王曄楠，"孟秀利，"宋薇薇."葉下珠黃化植原體和叢枝植原體的分子鑒定[J]."熱帶作物學報，"2024，"45（4）："864-871."LIN"Z"W，"NIU"X"Q，"TANG"Q"H，"WANG"Y"N，"MENG"X"L，"SONG"W"W."Molecular"identification"of"Phyllanthus"urinaria"yellows"phytoplasma"and"witches’-broom"Phytoplasma[J]."Chinese"Journal"of"Tropical"Crops，"2024，"45（4）："864-871."（in"Chinese）
• 鹿鵬鵬，"吳偉懷，"鄭金龍，"王桂花，"賀春萍，"林培群，"黃興，"梁艷瓊，"易克賢."劍麻紫色卷葉病相關植原體單管巢式PCR檢測技術建立與優(yōu)化[J]."農(nóng)業(yè)生物技術學報，"2021，"29（7）："1426-1434.LU"P"P，"WU"W"H，"ZHENG"J"L，"WANG"G"H，"HE"C"P，"LIN"P"Q，"HUANG"X，"LIANG"Y"Q，"YI"K"X."Establishment"and"optimization"of"single-tube"nested"PCR"detection"technique"for"phytoplasma"related"to"sisal"purple"leafroll"disease[J]."Journal"of"Agricultural"Biotechnology，"2021，"29（7）："1426-1434."（in"Chinese）
• 韓劍，"羅明，"徐金虹，"王同仁，"張祥林."棗瘋病植原體TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法的建立[J]."植物保護，"2014，"40（5）："111-116.HAN"J，"LUO"M，"XU"J"H，"WANG"T"R，"ZHANG"X"L."Establishment"of"real-time"fluorescent"quantitative"PCR"method"with"TaqMan"probe"for"detection"detection"of"jujube"witches’"broom"phytoplasma[J]."Plant"Protection，"2014，"40（5）："111-116."（in"Chinese）

[14]"張榮躍，"馬永德，"李婕，"王曉燕，"單紅麗，"李銀煳，"黃應昆."甘蔗白葉病植原PCR檢測方法的建立與應用[J]."甘蔗糖業(yè)，"2023，"52（1）："21-25.ZHANG"R"Y，"MA"Y"D，"LI"J，"WANG"X"Y，"SHAN"H"L，"LI"Y"H，"HUANG"Y"K."The"establishment"and"application"of"a"PCR"method"for"sugarcane"white"leaf"phytoplasma"detection[J]."Sugarcane"and"Canesugar，"2023，"52（1）："21-25."（in"Chinese）

[15]"車海彥."海南省植原體病害多樣性調(diào)查及檳榔黃化病植原體的分子檢測技術研究[D]."楊凌："西北農(nóng)林科技大學，"2010.CHE"H"Y."Diversity"of"phytoplasma"disease"and"molecular"detection"of"phytoplasma"associated"with"arecanut"yellow"leaf"in"Hainan"province"[D]."Yangling："Northwest"Aamp;F"University，"2010."（in"Chinese）

[16]"孟秀利，"唐慶華，"林兆威，"牛曉慶，"劉博，"宋薇薇."開發(fā)高效引物檢測檳榔黃化病葉片及種果內(nèi)植原體[J]."分子植物育種，"2022，"20（14）："4624-4633."MENG"X"L，"TANG"Q"H，"LIN"Z"W，"NIU"X"Q，"LIU"B，"SONG"W"W."Development"of"high-efficiency"primers"to"detect"phytoplasmas"in"leaves"and"OLD"fruits"of"areca"palms"infected"with"yellow"leaf"disease[J]."Molecular"Plant"Breeding，"2022，"20（14）："4624-4633."（in"Chinese）

[17]"YU"S"S，"CHE"H"Y，"WANG"S"J，"LIN"C"L，"LIN"M"X，"SONG"W"W，"TANG"Q"H，"YAN"W，"QIN"W"Q."Rapid"and"efficient"detection"ofnbsp;16SrI"group"areca"palm"yellow"leaf"phytoplasma"in"China"by"loop-mediated"isothermal"amplification[J]."The"Plant"Pathology"Journal，"2020，"36（5）："459-467.

[18]"YU"S"S，"ZHANG"X"C，"SONG"W"W，"QIN"W"Q."Accurate"and"sensitive"detection"of"areca"palm"yellow"leaf"phytoplasma"in"China"by"droplet"digital"PCR"targeting"tuf"gene"sequence[J]."Annals"of"Applied"Biology，"2022，"181（2）："152-159.

[19]"林兆威，"宋薇薇，"唐慶華，"牛曉慶，"王宇航，孟秀利."檳榔種苗和采摘工具的植原體檢測[J]."熱帶農(nóng)業(yè)科學，"2022，"42（11）："68-72.LIN"Z"W，"SONG"W"W，"TANG"Q"H，"NIU"X"Q，"WANG"Y"H，"MENG"X"L."Phytoplasma"detection"of"areca"palm"seedling"and"picking"tool[J]."Chinese"Journal"of"Tropical"Agriculture，"2022，"42（11）："68-72."（in"Chinese）