摘""要：大?？Х仁侵匾倪z傳種質(zhì)資源和風(fēng)景園林植物，在我國(guó)部分地區(qū)有少量種植?？Х忍烤也∈怯绊懣Х壬L(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的重要真菌病害。本研究對(duì)感染炭疽病的大粒種咖啡葉片采用組織分離法進(jìn)行分離，純化后進(jìn)行組織培養(yǎng)，利用柯赫氏法則驗(yàn)證其致病性，結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征和多基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定；用菌落生長(zhǎng)速率法對(duì)10種藥劑進(jìn)行抑菌率測(cè)定。分離純化獲得4個(gè)真菌純培養(yǎng)菌株，通過科赫氏法則實(shí)驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)，菌株KFTJ01是導(dǎo)致大粒種咖啡炭疽病的病原菌。采用PCR擴(kuò)增成功獲得菌株KFTJ01的rDNA-ITS、CAL和Tub2基因序列，其長(zhǎng)度分別為554、489、706"bp。分別上傳到NCBI"GenBank進(jìn)行blastn比對(duì)。結(jié)果表明，菌株KFTJ01與卡哈瓦刺盤孢（Colletotrichum"kahawae）菌株WZ-135（MN856281.1）、CREADC-ER2212（MT409131.1）和YMTJ4（MK569149.1）的相似率分別達(dá)99.62%、100%、100%。用KFTJ01菌株和下載的刺盤孢屬同源種菌株的3個(gè)DNA序列構(gòu)建系統(tǒng)演化樹，菌株KFTJ01與卡哈瓦刺盤孢（C."kahawae）聚集于同一分枝上（可信度為98%），因此將菌株KFTJ01鑒定為卡哈瓦刺盤孢。這是我國(guó)的一個(gè)檢疫對(duì)象物種，在咖啡類作物上尚未報(bào)道，應(yīng)引起高度重視。殺菌劑篩選試驗(yàn)結(jié)果顯示，70%甲基硫菌靈WP和25%甲硫·乙唑醇SA可完全抑制KFTJ01的生長(zhǎng)（抑菌率均為100%），抑菌中濃度（EC50）分別為0.0607、0.0809"mg/mL，表明這2種藥劑對(duì)抑制病菌非常經(jīng)濟(jì)有效。由此可見，引起大粒種咖啡炭疽病的病原菌為卡哈瓦刺盤孢，這是在我國(guó)報(bào)道的一種新記錄咖啡炭疽病病原菌；甲硫·乙唑醇和甲基硫菌靈對(duì)病原菌具有很好的抑菌效果。本研究結(jié)果可為大?？Х忍烤也〉臏?zhǔn)確診斷和防控提供重要參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：大?？Х?；炭疽??；卡哈瓦刺盤孢；多基因序列分析；殺菌劑"中圖分類號(hào)：S435.712""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Morphological"and"Molecular"Identification"of"Colletotrichum"kahawae"Causing"Anthracnose"of"Coffea"liberica"and"Fungicide"Selection"for"the"Disease"Management

LI"Xuejun1，"REN"Yuan1，3*，"CHEN"Hongmei1，"QU"Peng1，"DU"Huabo1，"HE"Pengbo2**，"TAN"Wanzhong1，4**

1."College"of"Tropic"Crop，"Yunnan"Agricultural"University，"Pu’er，"Yunnan"655099，"China;"2."College"of"Plant"Protection，"Yunnan"Agricultural"University，"Kunming，"Yunnan"650100，"China;"3."Yunnan"Yanshan"Craneberry"Agriculture"Co.，"Ltd.，"Wenshan，"Yunan"663100，"China;"4."West"Yunnan"University，"Lincang，"Yunnan"677000，"China

Abstract："The"present"work"was"conducted"to"identify"the"pathogen"causing"anthracnose"of"Liberica"coffee"（Coffea"liberica）"plants"and"to"screen"fungicides"against"the"disease"pathogen."The"leaves"of"C."liberica"with"anthracnose"symptoms"were"sampled"from"fields"for"fungal"isolation"and"purification."Four"pure"fungal"isolates"were"obtained"and"only"KFTJ01"was"verified"pathogenic"to"the"coffee"leaves"by"tests"following"Koch’s"Postulates."The"rDNA-ITS"sequence"（554"bp），"beta-tubulin"gene"（tub2）"and"calmodulin"gene"（CAL）"were"successfully"amplified"via"PCR"from"genomic"DNA"of"KFTJ01"and"sequenced."Blastn"analysis"of"the"the"three"DNA"sequences"showed"that"KFTJ01"was"identical"to"the"strain"WZ-135"（99.62%，"MN856281），"CREADC-ER2212"（100%，"MT409131）"and"YMTJ4"（100%，"MK569149）"of"Colletotrichum"kahawae."KFTJ01"was"also"clustered"with"C."kahawae"WZ-135"strain"on"the"same"end-branch"of"the"phylogenic"tree"（bootstrap"confidence"is"98%）."Therefore，"the"pathogen"of"Liberica"coffee"was"identified"as"C."kahawae"which"is"a"quarantine"species"and"has"never"been"recorded"in"China."Fungicide"selection"experiments"showed"that"among"the"10"chemicals，"methionine-acetazolyl"and"methyl"thiobacillam"almost"completely"（100%）"suppressed"the"colony"growth"of"KFTJ01."The"median"effective"concentration"calculated"from"the"functions"was"0.0607"mg/mL"and"0.0809"mg/mL，"respectively，"indicating"that"both"the"chemicals"were"very"effective"against"the"anthracnose"pathogen."The"results"are"important"references"for"the"field"diagnosis"of"the"coffee"plant"anthracnose"and"for"controlling"the"disease"epidemics.

Keywords："Coffea"liberica;"anthracnose;"Colletotrichum"kahawae;"multigene"sequence"analysis;"fungicide

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.06.019

咖啡是世界上最普遍、最受歡迎的天然飲品之一，其對(duì)人體健康具有重要保健作用，也是經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的植物，所以在熱帶和亞熱帶國(guó)家或地區(qū)均有廣泛栽培咖啡作物[1]。大?？Х龋–offea"liberica"Bull"ex"Hiern）在我國(guó)少部分地區(qū)（廣東、海南和云南等）有較小規(guī)模的種植，但它是重要的咖啡遺傳種質(zhì)資源和園藝植物[2]。

病害是影響咖啡生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的重要因素，現(xiàn)已報(bào)道的咖啡病害主要有炭疽病、銹病、灰霉病和褐斑病等[3-4]，其中，炭疽病是咖啡種植區(qū)發(fā)生非常普遍且連年造成嚴(yán)重危害的一種重要病害[5]。引起咖啡炭疽病的病原菌種類較多，均屬于刺盤孢屬（Colletotrichum"spp.）真菌，但這些病菌絕大多數(shù)來自最廣泛栽培的小?？Х龋–offea"arabica"L.）和中?？Х龋–."canephora"Pierre"ex"Froehn），如盤長(zhǎng)孢刺盤孢（C."gloeosporioides）、卡斯特刺盤孢（C."karstii）、暹羅刺盤孢（C."siamense）、博寧刺盤孢（C."boninense）、可可刺盤孢（C."theobromicola）、果生刺盤孢（C."fructicola）、雷登刺盤孢（C."leidongense）、熱帶刺盤孢（C."tropicale）和大孢刺盤孢（C."gigasporum）等[4-7]。

由于大粒咖啡的種植范圍較有限，國(guó)內(nèi)外對(duì)該植物的病害研究較少，對(duì)大?？Х鹊奶烤也〔≡难芯可袩o報(bào)道。本課題組于2021—2022年在咖啡病蟲害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)大粒咖啡炭疽病，于是從田間大粒咖啡發(fā)病植株上采集病葉標(biāo)本進(jìn)行病原菌的分離鑒定，并在此基礎(chǔ)上篩選抑菌控病殺菌劑，旨在為該病害的進(jìn)一步研究和控制其發(fā)生為害提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""病害標(biāo)本""2021年9—10月從云南普洱地區(qū)（22°75′25″N，"101°04′29″E）不同大?？Х葓@采集典型的咖啡發(fā)病葉片樣品，用于病原菌的分離鑒定。

1.1.2""培養(yǎng)基""利用北京路橋技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato"dextrose"agar，"PDA）用于病原菌分離純化培養(yǎng)、菌種保存和殺菌劑篩選試驗(yàn)。

1.1.3""引物""用于擴(kuò)增病原真菌rDNA的轉(zhuǎn)錄間區(qū)序列（rDNA-ITS）、微管蛋白基因（Tub"2）和鈣調(diào)蛋白基因（CAL）的引物見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.4""殺菌劑""供試的10種藥劑見表2，均為目前農(nóng)作物生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用于真菌病害防治的市售殺菌劑，于2022年1月5日購(gòu)自云南景洪市楚杰農(nóng)資公司。

1.1.5""咖啡苗""從溫室大棚內(nèi)的苗床中采集健康大粒咖啡葉片，用于致病性試驗(yàn)；將播種于溫室大棚苗床內(nèi)的健康小?？Х让缫浦驳脚柙岳彛ㄖ睆?4"cm，高15"cm）腐質(zhì)土壤中，每盆栽植5株，待其充分存活后用于控病藥效試驗(yàn)。

1.2""方法

1.2.1""病害癥狀觀察""結(jié)合野外調(diào)查和采樣，于咖啡生長(zhǎng)季節(jié)定期到田間觀察（拍照）記錄咖啡炭疽病的自然發(fā)病癥狀及發(fā)展變化，并與后續(xù)室內(nèi)接種形成的病害癥狀進(jìn)行比較。

1.2.2""病原菌的分離純化""將采集的新鮮病葉用自來水清洗干凈，晾干，采用病組織分離法[10]分離純化病原菌。在病健交界處切取5"mm×5"mm的病斑組織小塊，置于體積分?jǐn)?shù)75%乙醇中消毒30"s，移入2%次氯酸鈉溶液中2"min，取出，依次放入3皿滅菌蒸餾水中清洗3次，然后利用滅菌濾紙吸干組織塊表面殘留的水分。在超凈臺(tái)上用滅菌鑷子將組織塊植入PDA平板上，置于（25±"2）℃黑暗恒溫箱中培養(yǎng)。待菌落形成后用滅菌接種針挑取邊緣菌絲體尖端，轉(zhuǎn)接至新的PDA平板中央，在恒溫箱中培養(yǎng)至形成菌落。按以上方法純化2～3次得到病原菌的純培養(yǎng)菌株，最后從純培養(yǎng)菌落邊緣挑取菌絲尖端轉(zhuǎn)接至PDA斜面培養(yǎng)基上，在恒溫箱中生長(zhǎng)4"d后保存于4"℃冰箱，備用。

1.2.3""致病性試驗(yàn)""采用離體葉片刺傷接種法[11]，從溫室預(yù)先栽植的健康大?？Х戎仓晟喜杉】等~片，用滅菌剪刀剪成適當(dāng)大小小塊，放于培養(yǎng)皿（直徑為15"cm）中的濕濾紙上，用滅菌接種針針尖在接種點(diǎn)輕輕刺傷葉組織表面，從培養(yǎng)7"d的各菌株菌落上取5"mm×5"mm菌餅接種于刺傷點(diǎn)。每葉片中脈一側(cè)接種2個(gè)點(diǎn)，另一側(cè)不接菌作對(duì)照。每個(gè)菌株重復(fù)3葉片。接種后用濕棉球包裹葉柄基部，用適量滅菌水葉面噴霧后蓋上培養(yǎng)皿蓋，在室溫下避光保濕（RHgt;90%）24"h，然后置于培養(yǎng)箱（25"℃，RHgt;90%，11"000"Lux光照12"h/d）中培養(yǎng)14"d，定期觀察發(fā)病情況。接種48"h后移去菌塊，10"d后取發(fā)病葉片的病斑組織再分離純化其病原菌，并與原菌株形態(tài)進(jìn)行比較，根據(jù)柯赫氏法則[12]確認(rèn)致病菌株。

1.2.4""病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定""將致病菌株接種到PDA平板培養(yǎng)基上，重復(fù)5次（皿），置于（25±"2）℃恒溫箱中培養(yǎng)14"d，適時(shí)觀察、拍照、記錄菌落和菌體特征。培養(yǎng)9"d后測(cè)量各皿中的菌落大?。╩m）；12"d后用接種針從菌落上挑取菌絲和分生孢子混合物，制成臨時(shí)觀察玻片，在顯微鏡（400×）下隨機(jī)測(cè)量50個(gè)菌體（菌絲、附著胞和分生孢子）的大?。é蘭），計(jì)算平均值。根據(jù)觀察、記錄的形態(tài)特征，參考相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)致病菌株進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.5""病原菌的PCR分子鑒定""從PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)7"d的病原菌菌落上刮取菌體，用CTAB法[13]提取DNA，通過PCR分別擴(kuò)增病原菌的ITS、Tub2和CAL基因。PCR反應(yīng)體系（25"μL）為：2×Easy"Taq"PCR"SuperMix"12"μL、引物各1"μL、模板DNA"1"μL、ddH2O"10"μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4"℃預(yù)變性5"min；94"℃變性1"min，55"℃退火1"min，循環(huán)30次；最后72"℃延伸4"min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將獲得的3個(gè)DNA序列上傳到NCBI"GenBank（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行在線blastn比對(duì)，采用MEGA"6.0軟件[14]進(jìn)行系統(tǒng)演化樹分析，根據(jù)分析結(jié)果并結(jié)合形態(tài)特征確定病原菌的種名。

1.2.6""殺菌劑篩選""（1）藥劑篩選。用菌落生長(zhǎng)法[15]測(cè)試10種供試藥劑（表2）。按生產(chǎn)商推薦使用濃度的中值作為測(cè)試濃度，在超凈工作臺(tái)上用滅菌水配制各藥劑測(cè)試藥液，用移液槍取每種配制好的藥液0.3"mL于PDA平板培養(yǎng)基表面，用玻璃棒涂抹使藥液均勻分布于培養(yǎng)基表面，加入同體積的無菌水作空白對(duì)照。將5"mm×5"mm的致病菌株菌絲塊置于平板培養(yǎng)基中央；每個(gè)藥劑處理重復(fù)5皿。置于（25±2）℃恒溫箱中培養(yǎng)6"d，測(cè)量菌落半徑（cm），計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，用鄧肯氏新復(fù)極差法[16]檢驗(yàn)不同處理的差異顯著性，根據(jù)菌落半徑計(jì)算菌落面積，抑菌率=（對(duì)照菌落面積-處理菌落面積）/對(duì)照菌落面積×100%。參照李建明等[17]的方法測(cè)定抑菌率最高的2種藥劑（25%甲硫·乙唑醇和70%甲基硫菌靈）的有效抑菌中濃度（EC50）。

（2）藥劑的控病效果測(cè)試。選用上述試驗(yàn)中抑菌效果較好的4種藥劑（30%肟菌·戊唑醇、20%噻菌銅、70%甲基硫菌靈和25%甲硫·乙唑醇）進(jìn)行室內(nèi)藥劑篩選試驗(yàn)。在PDA上培養(yǎng)14"d的卡哈瓦刺盤孢KFTJ01菌株菌落上收集孢子和菌絲，用滅菌水制成混合懸浮菌液（約105個(gè)孢子/mL），噴霧接種于健康的盆栽咖啡苗，至其葉片表面均勻布滿菌液，每種藥劑重復(fù)10盆；用滅菌水噴霧作為對(duì)照。接種后隨即用黑色塑料薄膜嚴(yán)密遮蓋植株保持黑暗和高濕度24"h。然后揭掉塑料膜，在溫室大棚內(nèi)繼續(xù)放置2"d，然后用配制的不同殺菌劑藥液噴霧，每種藥劑處理6盆植株，以清水噴霧處理作為對(duì)照。噴藥處理后將植株轉(zhuǎn)移到智能人工氣候箱（25"℃，RHgt;90%，11"000"Lux光照10"h/d）中生長(zhǎng)21"d，調(diào)查植株發(fā)病情況，每個(gè)處理調(diào)查30片功能葉，記錄病葉率和每個(gè)葉片的病害嚴(yán)重度（%），用鄧肯氏新復(fù)極差法[16]檢驗(yàn)不同處理的差異顯著性，并計(jì)算各藥劑的控病效果。

2""結(jié)果與分析

2.1""病害癥狀描述

炭疽病在咖啡的各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段均可發(fā)生為害，但引起的癥狀有一定差異。在苗床育苗階段，幼苗葉片上的病斑比較規(guī)則，為圓形至橢圓形，直徑為4.2～13.6"mm；病斑中部淡灰白色，周圍褐黑色，偶爾可見病葉組織黃化形成暈圈（圖1A）。在田間，咖啡植株的葉片、枝條和果實(shí)均可被侵染發(fā)病。

成株葉片與幼苗上的典型病斑相似，多為圓形或橢圓形，也有呈不規(guī)則形；病斑大小差異比較大，一般單個(gè)病斑直徑為5.0～18.5"mm，中央?yún)^(qū)組織壞死呈灰白色，周圍有褐色帶或不明顯，黃色暈圈有或不明顯（圖1B～圖1D）。發(fā)病后期或老葉片上的病斑可聯(lián)合或擴(kuò)展，形成較大面積枯斑，病斑中部死亡組織會(huì)干枯掉落，形成穿孔，甚至整個(gè)葉片黃化枯死（圖1E～圖1F）。

植株分枝上較小枝條莖稈被侵染后，在樹皮表面出現(xiàn)典型的炭疽病病斑，發(fā)病嚴(yán)重植株枝條上的葉片可枯萎掉落，成為無葉片的光桿枝條（圖1G）；早期發(fā)病較嚴(yán)重的果枝上掛果減少，果實(shí)生長(zhǎng)不足而變小，提早脫落。

病害也直接侵染咖啡果實(shí)，初期在果皮上產(chǎn)生較小的水漬狀斑，以后逐漸增大呈橢圓形或梭形，由淺黃色逐漸加深呈褐色或黑褐色，明顯凹陷（圖1H）；后期病斑擴(kuò)展或聯(lián)合形成不規(guī)則斑塊，可覆蓋大部分果皮表面。發(fā)病嚴(yán)重的果枝上可見大量黑褐色果實(shí)，在潮濕條件下腐爛并在表面產(chǎn)生霉?fàn)钗?，在較干旱時(shí)變干癟，不脫落。果實(shí)發(fā)病對(duì)咖啡果產(chǎn)量和品質(zhì)的影響較大。

2.2""分離純化獲得的菌株及致病性鑒定

通過分離和純化，從大?？Х炔∪~樣品中分離獲得4個(gè)菌落形態(tài)明顯不同的純培養(yǎng)菌株。通過離體葉片微傷接種后，僅有1個(gè)菌株（命名為KFTJ01）引起侵染發(fā)病，接種48"h后菌餅下的葉組織軟化成水漬狀，7"d后形成圓形至橢圓形病斑，病斑中部棕褐色，周圍有明顯的黃色暈圈（圖2），與自然田間的典型病斑非常接近。取接種后7"d的病斑組織進(jìn)行分離純化，獲得菌落形態(tài)與KFTJ01菌株相同的純培養(yǎng)菌。另外，在相同條件下分別用其他3株純化菌接種，21"d后葉片上未見侵染發(fā)病，因此認(rèn)為這些菌株不是致病菌。根據(jù)柯赫氏法則，確認(rèn)KFTJ01菌株是引起大粒咖啡炭疽病致病的病原菌。

2.3""病原菌的形態(tài)學(xué)特征及初步鑒定

在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)7"d形成的菌落近圓形，邊緣稍呈波紋狀，直徑為73.20～80.15"mm，

生長(zhǎng)速率為10.82～11.91"mm/d，表面灰白色，氣生菌絲較發(fā)達(dá)，呈絨毛狀；10"d后菌落幾乎長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，表面灰白黑色，毛氈狀，有輪紋，菌絲顏色加深呈淺灰色，分隔，直徑為2.11～4.53"μm；絨毛狀菌絲下可見大量橙紅色的分生孢子團(tuán)；附著胞較稀少，淺褐色至棕褐色，球形或稍呈不規(guī)則形，直徑為7.84～9.27"μm；分生孢子梗不明顯；分生孢子單細(xì)胞，平直，橢圓或短棒狀，無色，兩端盾圓，大小為10.21～15.52"μm×3.84～5.03"μm（圖3）。這些特征基本與文獻(xiàn)[18-20]中記述的卡哈瓦刺盤孢（C."kahawae"G."M."Waller"amp;"P."D."Bridge）的形態(tài)特征相符，與文獻(xiàn)[8-9，"21]中描述的果生刺盤孢（C."fructicola"H."Prihastuti，"L."Cai"amp;"K."D."Hyde）和盤長(zhǎng)孢刺盤孢復(fù)合種（C."gloeosporioides"complex）的形態(tài)學(xué)特征也很接近。

2.4""菌株KFTJ01的分子鑒定

通過PCR擴(kuò)增獲得菌株KFTJ01的rDNA-"ITS、CAL和Tub2基因序列，其長(zhǎng)度分別為554、489、706"bp。上傳到NCBI"GenBank進(jìn)行blastn比對(duì)，結(jié)果表明，菌株KFTJ01與卡哈瓦刺盤孢菌株WZ-135（MN856281.1）、CREADC-"ER2212（MT409131.1）和YMTJ4（MK569149.1）的相似率分別達(dá)99.62%、100%和100%。在系統(tǒng)演化樹上菌株KFTJ01與WZ-135菌株聚集于同一分支，二者為同一個(gè)種的可信度（bootstrap"support）達(dá)98%（圖4）。由此，菌株KFTJ01被鑒定為卡哈瓦刺盤孢（C."kahawae"J."M."Waller"amp;"P."D."Bridge）。

2.5""殺菌劑對(duì)菌株KFTJ01的抑菌及控病作用

2.5.1""不同藥劑的抑菌作用""對(duì)供試的10種藥劑進(jìn)行藥效測(cè)試結(jié)果表明，供試藥劑對(duì)病原菌株KFTJ01均有顯著的抑制作用（Plt;0.01），但不同藥劑的抑菌效果有一定差異。其中，80%代森錳鋅WP和12.5%四氟醚唑WP的抑菌效果較差，抑菌率低于84%；而25%甲硫·乙唑醇SA、70%甲基硫菌靈WP、20%噻菌銅SA和30%肟菌·戊唑醇SA的抑菌效果均較好，抑菌率達(dá)99%～100%；其他4種藥劑的抑菌率也較高，在92.56%～97.37%之間（表3）。另外，70%甲基硫菌靈WP和30%肟菌·戊唑醇SA對(duì)病原菌KFTJ01的有效抑菌中濃度（EC50）分別為0.0607"mg/mL和0.0809"mg/mL。由此可見，這2種殺菌劑的有效抑菌中濃度很低，表明該藥劑對(duì)病原菌的藥效非常好。

2.5.2""4種藥劑的控病作用""對(duì)抑菌效果較好的4種藥劑進(jìn)行盆栽防治效果研究，結(jié)果顯示，對(duì)照咖啡苗發(fā)病嚴(yán)重，病葉率和病害嚴(yán)重度分別為97.3%和27.6%；4種殺菌劑對(duì)咖啡炭疽病的控病效果都很好，藥劑處理后病葉率降低至17%以下，植株整體上保持健康，僅少數(shù)葉片上可見少量的小病斑，病害嚴(yán)重度降低到5%以下，炭疽病控制率達(dá)到85%～90%（表4）。

3""討論

咖啡炭疽病在全世界咖啡種植國(guó)家和地區(qū)均廣泛發(fā)生和為害，是與咖啡銹病齊名的咖啡重要流行性病害，由刺盤孢屬（Colletotrichum"spp.）真菌侵染所致，但引起咖啡炭疽病的病原菌種類因產(chǎn)地和咖啡種類不同而存在很大差異。CRISTQBAL-MARTINEZ等[6]鑒定出墨西哥小?？Х龋–offea"arabica）的葉片、枝條和漿果上有大孢刺盤孢（C."gigasporum）、盤長(zhǎng)孢刺盤孢（C."gloeosporioides）、卡斯特刺盤孢（C."karstii）和暹羅刺盤孢（C."siamense）；FREITAS等[7]在巴西小?？Х群椭辛？Х龋–."canephora）上首次發(fā)現(xiàn)博寧刺盤孢（C."boninense）侵染，另外還記錄到咖啡刺盤孢（C."coffeanum）和可可刺盤孢（C."theobromicola）。在我國(guó)，CAO等[5]報(bào)道海南省的小?？Х群椭辛？Х忍烤也【袃?nèi)生刺盤孢（C."endophytica）、果生刺盤孢（C."fructicola）、雷登刺盤孢（C."leidongense）、暹羅刺盤孢、熱帶刺盤孢（C."tropicale）、卡斯特刺盤孢和大孢刺盤孢；徐丹丹等[4]從廣東小粒咖啡炭疽病葉片上鑒定出果生刺盤孢、暹羅刺盤孢和芭蕉生刺盤孢（C."musicola）；另外，陸英等[22]從海南和云南的小粒咖啡病害標(biāo)樣中分離鑒定出8種刺盤孢，其中包含了尖孢刺盤孢（C."acutatum）和短孢刺盤孢（C."brevisporum）。大?？Х鹊奶烤也≡趪?guó)內(nèi)尚無報(bào)道。本研究結(jié)果表明，大?？Х忍烤也∈怯煽ü叽瘫P孢（C."kahawae）侵染所致。

卡哈瓦刺盤孢是在非洲咖啡（小?？Х龋┊a(chǎn)區(qū)廣泛發(fā)生分布和為害的“咖啡漿果病”（coffee"berry"disease，"CBD）的病原菌，原名為“咖啡刺盤孢”（C."coffeanum），EMANA[23]和DERSOA等[24]曾將其與盤長(zhǎng)孢刺盤孢（C."gloeosporioides）等同為同一個(gè)種；但不少學(xué)者則認(rèn)為“咖啡刺盤孢”這個(gè)定名不正規(guī)也不符合實(shí)際情況，其應(yīng)用可能使人們產(chǎn)生一定的誤會(huì)，所以WALLER等[20]根據(jù)其特殊的形態(tài)特征將其重新命名為“卡哈瓦刺盤孢”（C."kahawae）。由于該菌為害咖啡果實(shí)，對(duì)咖啡產(chǎn)量和品質(zhì)具有嚴(yán)重的影響，而且在我國(guó)咖啡上尚無報(bào)道，因此將其列入我國(guó)的植物檢疫對(duì)象微生物物種[25]，且全國(guó)植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)頒布了其檢疫鑒定標(biāo)準(zhǔn)（GB/T"40457—2021）[26]。然而，近年來在貴州的油茶[27]、陜西和山東的海棠等作物[28]上發(fā)現(xiàn)了卡哈瓦刺盤孢。本研究鑒定出引起云南普洱地區(qū)大?？Х热~部炭疽病的病原菌為卡哈瓦刺盤孢，這是在大?？Х壬闲掳l(fā)現(xiàn)的炭疽病及其病原菌，也是我國(guó)在咖啡屬植物上首次記載該病菌的為害，應(yīng)當(dāng)引起國(guó)內(nèi)咖啡種植業(yè)及有關(guān)方面的高度重視。

對(duì)刺盤孢屬真菌的描述和鑒定一般采用菌落和分生孢子的形態(tài)特征[9，"21]，但近年來很多研究中均包含了附著胞的形態(tài)，附著胞一般采用載玻片培養(yǎng)法觀察[15，"28]。本研究中采用洋蔥表皮培養(yǎng)法，即從新鮮的洋蔥鱗片上撕下內(nèi)表皮，將其置于真菌的分生孢子懸浮液（孢子濃度約106個(gè)/mL）中浸10"s，然后平鋪于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于培養(yǎng)皿中的濕濾紙上，加蓋，于25"℃恒溫箱中黑暗保濕培養(yǎng)24～48"h后，即可在顯微鏡下清晰地觀察到病菌分生孢子萌發(fā)形成的菌絲和產(chǎn)生的附著胞。該方法簡(jiǎn)便，使用的洋蔥材料廉價(jià)并易于獲得；與載玻片培養(yǎng)法相比，試驗(yàn)所需時(shí)間短，分生孢子更快萌發(fā)形成芽管，產(chǎn)生的附著胞更均勻一致。因此，洋蔥表皮培養(yǎng)法是優(yōu)于載玻片培養(yǎng)法的培養(yǎng)刺盤孢菌產(chǎn)生附著胞的一種新方法。

根據(jù)生產(chǎn)需求，安全合理地使用高效低毒殺菌劑仍然是目前植物病害綜合防治中不可或缺的重要方法。對(duì)于植物炭疽病，已經(jīng)有很多關(guān)于殺菌劑篩選研究及在生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的報(bào)道[29-32]，市場(chǎng)上也有很多標(biāo)明專門用于防控炭疽病的藥劑種類。然而，引起炭疽病的刺盤孢屬真菌種類很多，一種殺菌劑對(duì)不同種類病菌引起的炭疽病的防效可能存在較大的差異。本研究測(cè)試了10種主要?dú)⒕鷦?duì)卡哈瓦刺盤孢菌株KFTJ01的抑菌效果，70%甲基硫菌靈WP和25%甲硫·乙唑醇SA可以完全抑制該病菌的生長(zhǎng)，而30%肟菌·戊唑醇SA和20%噻菌銅SA的抑菌率也達(dá)到99%。這4種殺菌劑對(duì)大?？Х忍烤也〉目刂谱饔镁鶚O顯著，控病率達(dá)到85%以上，因此可以將這些藥劑應(yīng)用于咖啡炭疽病的綜合防治中，在咖啡種植實(shí)踐中合理應(yīng)用。

綜上所述，引起大粒種咖啡炭疽病的病原菌為卡哈瓦刺盤孢（C."kahawae），是我國(guó)重要的檢疫性對(duì)象物種，也是我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)的咖啡炭疽病的病原菌新記錄種；70%甲基硫菌靈WP、25%甲硫·乙唑醇SA、30%肟菌·戊唑醇SA和20%噻菌銅SA對(duì)病原菌的抑制作用和對(duì)炭疽病的控病效果均較強(qiáng)。研究結(jié)果可為大粒咖啡炭疽病的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，也為該病害的診斷鑒定和綜合防治提供重要參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]"張捷華，"張毅."云南省咖啡產(chǎn)業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力現(xiàn)狀分析及提升對(duì)策探究[J]."農(nóng)村經(jīng)濟(jì)與科技，"2020，"31（3）："186-188.ZHANG"J"H，"ZHANG"Y."Analysis"of"the"competitiveness"of"coffee"industry"in"Yunnan"province"and"exploration"of"promotion"countermeasures[J]."Rural"Economy"and"Science-Technology，"2020，nbsp;31（3）："186-188."（"in"Chinese）

[2]"黃家雄，"李貴平，"楊世貴."咖啡種類及優(yōu)良品種簡(jiǎn)介[J]."農(nóng)村實(shí)用技術(shù)，"2009（1）："42-43."HUANG"J"X，"LI"G"P，"YANG"S"G."Introduction"of"coffee"types"and"excellent"varieties[J]."Practical"Rural"Technology，"2009（1）："42-43."（in"Chinese）

[3]"楊曌."咖啡主要病蟲害的癥狀識(shí)別與防治措施探討[J]."農(nóng)業(yè)開發(fā)與裝備，"2017（1）："146-147.YANG"Z."Discussion"on"the"symptom"idenon"and"control"measures"of"the"main"diseases"and"insect"pests"in"coffee[J]."Agricultural"Development"amp;"Equipment，"2017（1）："146-147."（in"Chinese）

[4]"徐丹丹，"石力允，"張羽，"林澤勉，"姜子德，"喬方."廣東咖啡炭疽病病原菌初步鑒定及防治藥劑篩選[J]."廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，"2021，"48（2）："100-107."XU"D"D，"SHI"L"Y，"ZHANG"Y，"LIN"Z"M，"JIANG"Z"D，"QIAO"F."Pathogen"identification"of"anthracnose"disease"on"Coffea"arabica"in"Guangdong"province"and"screening"of"fungicides[J]."Guangdong"Agricultural"Sciences，"2021，"48（2）："100-107."（in"Chinese）

[5]"CAO"X"R，"XU"X"M，"CHE"H"Y，"WEST"J"S，"LUO"D"Q."Characteristics"and"distribution"of"Colletotrichum"species"in"coffee"plantations"in"Hainan，"China[J]."Plant"Pathology，"2019，"68（6）："1146-1156.

[6]"CRISTQBAL-MARTINEZ"A"L，"YANEZ-MORAJES"M"D，"SEGURA-LEON"O，"HERNáNDEZ-ANGUIANO"A"M."Diversity"of"Colletotrichum"species"in"coffee"（Coffea"arabica）"plantations"in"Mexico[J]."European"Journal"of"Plant"Pathology，"2017，"147（3）："605-614.

[7]"FREITAS"R"L，"MACIEL-ZAMBOLIME"E，"ZAMBOLIM"L，"LELIS"D"T，"CAIXETA"E"T."Colletotrichum"boninense"causing"anthracnose"on"coffee"trees"in"Brazil[J]."Plant"Disease，"2013，"97（9）："1255.

[8]"RABHA"A"J，"NAGLOT"A，"SHARMA"G"D，"GOGOI"H"K，"GUPTA"V"K，"SHREEMALI"D"D，"VEER"V."Morphological"and"molecular"diversity"of"endophytic"Colletotrichum"gloeosporioides"from"tea"plant，"Camellia"sinensis"（L.）"O."Kuntze"of"Assam，"India[J]."Journal"of"Genetic"Engineering"and"Biotechnology，"2016，"14（1）："181-187.

[9]"LU"Q"H，"WANG"Y"C，"LI"N"N，"NI"D"J，"YANG"Y"J，"WANG"X"C."Differences"in"the"characteristics"and"pathogenicity"of"Colletotrichum"camelliae"and"C."fructicola"isolated"from"the"tea"plant"[Camellia"sinensis"（L.）"O."Kuntze][J]."Frontiers"Microbiology，"2018，"9（9）："3060.

[10]"張珊，"朱自萍，"何鵬搏，"李詠梅，"何鵬飛，"陳倩，"?，|，"吳毅歆，"劉迎龍，"譚萬忠，"何月秋."云南省玉米白斑病病原菌鑒定與品種田間抗性評(píng)價(jià)[J]."植物保護(hù)學(xué)報(bào)，"2022，"49（3）："840-847.ZHANG"S，"ZHU"Z"P，"HE"P"B，"LI"Y"M，"HE"P"F，"CHEN"Q，"CHANG"W，"WU"Y"X，"LIU"Y"L，"TAN"W"Z，"HE"Y"Q."Identification"of"the"pathogen"causing"maize"white"spot"and"field"evaluation"of"maize"cultivars"for"resistance"to"the"disease[J]."Journal"of"Plant"Protection，"2022，"49（3）："840-847."（in"Chinese）

[11]"李維峰，"何鵬搏，"張學(xué)文，"陳紅梅，"趙明雙，"杜華波，"譚萬忠."白及新病害葉枯病及其病原菌鑒定[J]."中藥材，"2022，"45（10）："2304-2308.LI"W"F，"HE"P"B，"ZHANG"X"W，"CHEN"H"M，"ZHAO"M"S，"DU"H"B，"TAN"W"Z."Identification"of"Bletilla"striata"leaf"blight"disease"and"its"pathogenic"bacteria[J]."Journal"of"Chinese"Medicinal"Materials，"2022，"45（10）："2304-2308."（in"Chinese）

[12]"GRIMES"D"J."Koch’s"postulates"then"and"now："amid"challenges，"his"principles"remain"useful"for"confirming"microbial"roles"in"diseases"and"other"processes[J]."Microbes，"2006，"1（5）："223-228.

[13]"WHITE"T"J，"BRUNS"T，"LEE"S，"TAYLOR"J"W."Amplification"and"direct"sequencing"of"fungal"ribosomal"RNA"genes"for"phylogenetics[M]//INNIS"M"A，"GELF"D"H，"SNINSKY"J"J，"WHITE"T"J."PCR"protocols："a"guide"to"methods"and"applications."New"York："Academic"Press，"1990："315-322.

[14]"TAMURA"K，"STECHER"G，"PETERSON"D，"FILIPSKI"A，"KUMAR"S."MEGA6："molecular"evolutionary"genetics"analysis"version"6.0[J]."Molecular"Biology"and"Evolution，"2013，"30（12）："1012725-1012729.

[15]"鞏佳莉."我國(guó)咖啡炭疽病的病原菌鑒定及化學(xué)藥劑篩選研究[D]."南京："南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，"2020."GONG"J"L."Study"on"the"pathogen"identification"and"chemical"agent"screening"of"coffee"anthrax"in"China[D]."Nanjing："Nanjing"Agricultural"University，"2020."（in"Chinese）

[16]"STEEL"R"G"D，"TORRIE"J"H."Duncan’s"new"multiple"range"test[M]."Principles"and"Procedures"of"Statistics，"McGraw-"Hill"New"York，"1980："187-188.

[17]"李建明，"歐曉明，"裴暉，"何蓮，"雷滿香."Excel在殺菌劑復(fù)配研究中的應(yīng)用[J]."世界農(nóng)藥，"2013，"35（4）："34-36，"39.LI"J"M，"OU"X"M，"FEI"H，"HE"L，"LEI"M"X."Application"of"Excel"in"pesticides"mixtures[J]."World"Pesticide，"2013，"35（4）："34-36，"39."（in"Chinese）

[18]"MANUEL"L，"TALHINHASnbsp;P，"VáRZEA"V，"NEVES-"MARTINS"J."Characterization"of"Colletotrichum"kahawae"isolates"causing"coffee"berry"disease"in"Angola[J]."Journal"of"Phytopathology，"2010，"158（4）："310-313.

[19]"PRIHASTUTI"H，"MCKENZIE"E"H"C，"HYDE"K"D，"CAI"L，"HYDE"E"H"C"A."Characterization"of"Colletrichum"species"associated"with"coffee"berries"in"northern"Thailand[J]."Fungal"Diversity，"2009，"39："89-109.

[20]"WALLER"J"M，"BRIDGE"P"D，"BLACK"R，"HAKIZA"G."Characterization"of"the"coffee"berry"disease"pathogen，"Colletotrichum"kahawae"sp."nov.[J]."Mycological"Research，"1993，"97（8）："989-994.

[21]"FUENTES-ARAGóN"D，"JUáREZ-VáZQUEZ"S"B，"VARGAS-HERNáNDEZ"M，"SILVA-ROJAS"H"V."Colletotrichum"fructicola，"a"member"of"Colletotrichum"gloeosporioides"sensu"lato，"is"the"causal"agent"of"anthracnose"and"soft"rot"in"avocado"fruits"cv."“Hass”[J]."Mycobiology，"2018，"46（2）："92-100.

[22]"陸英，"賀春萍，"吳偉懷，"梁艷瓊，"鄭金龍，"黃興，"習(xí)金根，"譚施北，"易克賢."我國(guó)咖啡炭疽病菌致病力分化[J]."西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，"2021，"34（5）："1008-1014."LU"Y，"HE"C"P，"WU"W"H，"LIANG"Y"Q，"ZHENG"J"L，"HUANG"X，"XI"J"G，"TAN"S"B，"YI"K"X."Pathogenicity"differentiation"of"coffee"anthracnose"in"China[J]."Southwest"China"Journal"of"Agricultural"Sciences，"2021，"34（5）："1008-"1014."（in"Chinese）

[23]"EMANA"B"T."Coffee"berrynbsp;disease"（Colletotrichum"kahawae）："status，"pathogenic"variability"and"reactions"of"coffee"landraces"in"Hararghe，"Eastern"Ethiopia[J]."International"Journal"of"Plant"Breeding"Crop"Science，"2015，"1（2）："18-27.

[24]"DERSOA"E，"WALLER"J."Variation"among"Colletotrichum"isolates"from"diseased"coffee"berries"in"Ethiopia[J]."Crop"Protection，"2003，"22（3）："562-565.

[25]"農(nóng)業(yè)部."中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄[EB/OL]."（2011-12-06）[2023-04-23]."http：//www.zys.moa."gov.cn/flfg/201904/t20190428_6245344.htm.Ministry"of"Agriculture."List"of"entry"plant"quarantine"pstances"ofnbsp;the"People’s"Republic"of"China[EB/OL]."（2011-"12-06）[2023-04-23]."http：//www.zys.moa.gov.cn/flfg/201904"/t20190428_6245344.htm."（in"Chinese）

[26]"全國(guó)植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)."咖啡漿果炭疽病菌檢疫鑒定方法："GB/T"40457—2021[S]."北京："中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，"2021."National"Technical"Committee"for"Standardization"of"Plant"Quarantine."Methods"for"quarantine"identification"of"anthracnose"bacteria"in"morphine"berry："GB/T"40457—2021[S]."Beijing："China"Standards"Publishing"House，"2021."（in"Chinese）

[27]"秦紹釗，"張柱亭，"王洪，"李御企."貴州油茶炭疽病Colletotrichum"kahawae病原鑒定研究[J]."現(xiàn)代園藝，"2020（4）："6-7."QIN"S"Z，"ZHANG"Z"T，"WANG"H，"LI"Y"Q."Identification"of"Colletotrichum"kahawae"pathogen"of"camellia"anthrax"in"Guizhou[J]."Contemporary"Horticulture，"2020（4）："6-7."（in"Chinese）

[28]"WATCHNOK"N."中國(guó)蘋果炭疽葉枯病菌種類多樣性研究[D]."楊凌："西北農(nóng)林科技大學(xué)，"2019.WATCHNOK"N."Species"diversity"of"Colletorichum"causing"apple"Glomerella"leaf"spot"in"China[D]."Yangling："Northwest"A"amp;"F"University，"2019."（in"Chinese）

[29]"薄鑫，"羅大成，"李海靜，"張凱浩，"劉云霞，"時(shí)春喜."6種殺菌劑對(duì)辣椒炭疽病病菌室內(nèi)毒力測(cè)定及田間藥效評(píng)價(jià)[J]."西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，"2021，"30（7）："1100-1105.BO"X，"LUO"D"C，"LI"H"J，"ZHANG"K"H，"LIU"Y"X，"SHI"C"X."Indoor"virulence"determination"and"field"efficacy"evaluation"of"pepper"anthracnose"pathogen[J]."Northwest"China"Agricultural"Journal，"2021，"30（7）："1100-1105."（in"Chinese）

[30]"姜莉莉，"孫瑞紅，"宮慶濤，"武海斌，"武沖."草莓炭疽病病原菌的分離及高效防治藥劑篩選[J]."山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，"2021，"53（6）："89-93."JIANG"L"L，"SUN"R"H，"GONG"Qnbsp;T，"WU"H"B，"WU"C."Isolation"of"strawberry"anthracnose"pathogen"and"screening"for"effective"fungicides[J]."Shandong"Agricultural"Sciences，"2021，"53（6）："89-93."（in"Chinese）

[31]"孫偉，"袁會(huì)珠，"陳淑寧."油茶炭疽病病原鑒定及綠色防治藥劑篩選[J]."中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，"2022，"38（4）："880-889."SUN"W，"YUAN"H"Z，"CHEN"S"N."Identification"of"Colletotrichum"species"associated"with"anthracnose"of"Camellia"oleifera"and"screening"of"fungicides[J]."Chinese"Journal"of"Biological"Control，"2022，"38（4）："880-889."（in"Chinese）

[32]"徐從英，"王萌，"梁曉宇，"馬騰，"楊葉，"張宇."云南西雙版納地區(qū)橡膠樹炭疽病菌的系統(tǒng)進(jìn)化分析和室內(nèi)藥劑篩選[J]."西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，"2021，"34（12）："2653-2658."XU"C"Y，"WANG"M，"LIANG"X"Y，"MA"T，"YANG"Y，"ZHANG"Y."Phylogenetic"analysis"and"fungicide"screening"for"Colletotrichum"causing"rubber"anthracnose"in"Xishuangbanna，"Yunnan[J]."Southwest"China"Agricultural"Journal，"2021，"34（12）："2653-2658."（in"Chinese）