摘""要：由死體營(yíng)養(yǎng)型病菌（necrotrophic"pathogen）灰葡萄孢菌（Botrytis"cinerea）侵染引起的灰霉病是番茄生產(chǎn)上的常見病害，可導(dǎo)致番茄大面積減產(chǎn)甚至絕收。蔗糖分解代謝在植物抗病中發(fā)揮著重要作用，不僅可為植物防御反應(yīng)提供碳骨架和能量，還可通過(guò)信號(hào)途徑調(diào)控抗病基因的表達(dá)。研究表明，分解蔗糖的細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶（cell"wall"invertase，"CWIN）可增強(qiáng)植物對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)型病害的抗性。然而，目前尚無(wú)CWIN對(duì)番茄灰霉病抗性影響的相關(guān)研究。本研究以CWIN活性上調(diào)的轉(zhuǎn)基因番茄（RNAi/R）及野生型番茄（WT/W）為材料，對(duì)其葉片進(jìn)行灰霉菌（Bc）離體接種，研究CWIN對(duì)番茄灰霉病抗性的影響，同時(shí)對(duì)接種后12、60"h的葉片進(jìn)行取樣，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序初步闡明CWIN調(diào)控番茄灰霉病抗性的分子機(jī)制。結(jié)果表明：（1）提高番茄CWIN活性可增強(qiáng)番茄葉片對(duì)灰霉病菌的抗性。（2）KEGG注釋表明，接種12"h的DEGs（W-Bc-12"h-vs-R-Bc-12"h）共獲得5個(gè)顯著性富集通路，包括次生代謝物生物合成（biosynthesis"of"secondary"metabolites）、代謝途徑（metabolic"pathways）、DNA復(fù)制（DNA"replication）、淀粉和蔗糖代謝（starch"and"sucrose"metabolism）以及甾族化合物生物合成（steroid"biosynthesis）；接種60"h的DEGs（W-Bc-60"h-vs-R-Bc-60"h）則未發(fā)現(xiàn)顯著性富集通路，表明接種早期是CWIN調(diào)控番茄抗病性的關(guān)鍵時(shí)期。（3）植物-病原菌互作圖分析表明，參與超敏反應(yīng)和防御相關(guān)基因誘導(dǎo)的富含亮氨酸重復(fù)（LRR）受體類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因FLS2和熱激蛋白基因HSP90在接種后的RNAi葉片中上調(diào)，其可能是CWIN增強(qiáng)番茄抗病性機(jī)制中的重要基因。（4）植物激素信號(hào)通路和MapMan作圖分析表明，接種后RNAi番茄的抗病激素茉莉酸（JA）和乙烯（ET）信號(hào)途徑上調(diào)，同時(shí)水楊酸（SA）信號(hào)途徑減弱，表明其可能共同作用提高RNAi番茄的抗病性。此外，接種后RNAi番茄葉片的生長(zhǎng)促進(jìn)激素生長(zhǎng)素（IAA）和細(xì)胞分裂素（CTK）信號(hào)途徑增強(qiáng)，而衰老促進(jìn)激素脫落酸（ABA）信號(hào)途徑減弱，這樣可以抑制病菌侵染期間細(xì)胞的死亡，從而阻止死體營(yíng)養(yǎng)型病菌灰霉病菌從死亡寄主細(xì)胞上獲得必要的養(yǎng)分用于侵染。此外，MapMan作圖還揭示接種后RNAi番茄葉片在細(xì)胞壁增厚、蛋白水解、活性氧（氧化還原狀態(tài)和過(guò)氧化物酶）、次生代謝物方面也得到極大的加強(qiáng)，這些途徑均有助于提高番茄的抗病性。綜上，提高CWIN活性可增強(qiáng)番茄灰霉病抗性，轉(zhuǎn)錄組分析不僅驗(yàn)證已有的CWIN抗病分子機(jī)制，如細(xì)胞壁加厚、活性氧積累和超敏反應(yīng)（HR）、抗病激素積累（SA和JA/ET）、病程相關(guān)蛋白（如HSP和PR）和次生代謝物的合成（如植物毒素和多酚等）等，而且還挖掘出一些新的CWIN抗病機(jī)制，包括生長(zhǎng)促進(jìn)激素（IAA和CTK）和衰老促進(jìn)激素（ABA）信號(hào)途徑和蛋白水解途徑。研究結(jié)果可為下一步利用基因工程、分子育種等現(xiàn)代生物技術(shù)手段提高番茄灰霉病抗性提供理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶；灰霉菌（Botrytis"cinerea）；番茄；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；抗病基因中圖分類號(hào)：S436.412.13""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Transcriptome"Analysis"of"CWIN-mediated"Tomato"Response"to"the"Infection"of"Botrytis"cinerea

FU"Lanping1，3，"XIN"Shuli2，"LIU"Yonghua1，3*，"ZHU"Guopeng1，3*

1."School"of"Horticulture，"Hainan"University"/"Key"Laboratory"for"Quality"Regulation"of"Tropical"Horticultural"Crops"of"Hainan"Province，"Haikou，"Hainan"570228，"China;"2."Agricultural"Service"Center"of"Baoting，"Baoting，"Hainan"572316，"China;"3."Sanya"Nanfan"Research"Institute，"Hainan"University，"Sanya，"Hainan"572022，"China

Abstract："Grey"mold"is"a"common"disease"in"tomato"production"caused"by"Botrytis"cinerea，"a"necrotrophic"pathogen，"which"often"leads"to"dramatic"reduction"of"tomato"yield."Sucrose"catabolism"plays"an"important"role"in"plant"defense"against"pathogen"infection"by"providing"carbon"skeleton"and"energy"for"plant"defense"responses"and/or"regulating"the"expression"of"defense-related"genes"throughnbsp;signaling"pathway."Previous"studies"have"shown"that"cell"wall"invertase"（CWIN），"a"kind"of"sucrose-degrading"enzyme，"can"enhance"plant"resistance"to"several"necrotrophic"pathogens."However，"no"research"has"been"conducted"to"study"the"role"of"CWIN"in"tomato"resistance"to"B."cinerea."In"this"study，"wild"type"tomato"（W）"and"its"transgenic"line"（R）"with"elevated"CWIN"activity"were"used"as"materials"to"study"the"effect"of"CWIN"on"tomato"resistance"to"B."cinerea"（Bc）"via"in"vitro"inoculation."In"addition，"inoculated"leaves"were"sampled"12"h"and"60"h"post"inoculation"（hpi）"for"RNA-Seq"to"elucidate"possible"molecular"mechanisms"underlying"the"regulation"of"CWIN"to"tomato"resistance"against"B."cinerea."The"results"are"as"follows："（1）"Elevated"CWIN"activity"enhanced"tomato"resistance"to"B."cinerea;"（2）"KEGG"annotation"showed"that"DEGs"（W-Bc-12"h-vs-R-Bc-12"h）"from"12"hpi"were"significantly"enriched"in"five"pathways，"including"biosynthesis"of"secondary"metabolites，"metabolic"pathways，"DNA"replication，"starch"and"sucrose"metabolism，"and"steroid"biosynthesis;"No"significant"enrichment"pathway"was"found"for"DEGs"（W-Bc-60"h-vs-R-Bc-60"h）"from"60"hpi."（3）"By"mapping"DEGs"to"plant-pathogen"interaction"pathway，"it"was"revealed"that"the"LRR-receptor"serine/threonine-like"kinase"gene"FLS2"and"heat"shock"protein"gene"HSP90"involved"in"hypersensitive"response"and"defense-related"gene"induction"were"up-regulated"in"RNAi"leaves"after"inoculation，"indicating"the"two"genes"may"participate"in"the"regulation"of"CWIN"to"tomato"resistance"to"B."cinerea."（4）"The"analysis"of"plant"hormone"signal"transduction"pathways"and"MapMan"mapping"showed"that"the"signal"pathway"of"jasmonic"acid"（JA）"and"ethylene"（ET）"was"enhanced"in"RNAi"leaves"after"inoculation，"while"the"signal"pathway"of"salicylic"acid"（SA）"was"weakened，"indicating"that"the"hormones"might"work"together"to"improve"the"resistance"of"RNAi"tomato"to"B."cinerea."In"addition，"the"signal"transduction"of"growth-promoting"hormone"auxin"（IAA）"and"cytokinin"（CTK）"was"also"enhanced"in"RNAi"leaves"after"inoculation，"but"that"of"senescence-promoting"hormone"abscisic"acid"（ABA）"was"weakened."The"changes"in"signal"pathways"of"IAA，"CTK"and"ABA"could"inhibit"the"cell"death"in"host"during"bacterial"infection，"thus"preventing"the"necrotrophic"pathogen"B."cinerea"from"obtaining"necessary"nutrients"from"the"dead"host"cells"for"its"infection."In"addition，"MapMan"mapping"also"revealed"that"cell"wall"thickening，"proteolysis，"reactive"oxygen"species"（redox"state"and"peroxidases）"and"secondary"metabolites"were"also"greatly"enhanced"in"RNAi"leaves"after"inoculation，"which"all"contribute"to"improving"the"disease"resistance"of"tomato."In"conclusion，"this"study"showed"that"elevated"CWIN"activity"enhanced"tomato"resistance"to"B."cinerea."Transcriptome"analysis"not"only"verified"the"existing"molecular"mechanisms"underlying"the"regulation"of"CWIN"to"plant"resistance"to"microbial"pathogens，"such"as"cell"wall"thickening，"accumulation"of"reactive"oxygen"species"（ROS）"and"hypersensitive"response"（HR），"accumulation"of"resistance"hormones"（SA"and"JA/ET），"biosynthesis"of"pathogenesis-related"protein"（e.g."PR"and"HSP"proteins）"and"secondary"metabolites"（such"as"phytotoxins"and"phenolics），"but"also"revealed"several"possible"new"mechanisms"including"the"signal"transduction"of"growth-promoting"hormone"（IAA"and"CTK）"and"senescence-promoting"hormone"（ABA）"and"proteolysis."This"study"can"provide"theoretical"guidance"for"the"improvement"of"tomato"resistance"to"B."cinerea"by"using"modern"biotechnologies"such"as"genetic"engineering"and"molecular"breeding.

Keywords："cell"wall"invertase;"Botrytis"cinerea;"tomato;"RNA-seq;"disease"resistance"gene

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.06.006

番茄（Solanum"lycopersicum）是一種重要的蔬菜作物，在世界各地廣泛種植。近10年來(lái)我國(guó)番茄種植面積和產(chǎn)量均呈不斷上升的趨勢(shì)，2021年我國(guó)番茄產(chǎn)量達(dá)到0.68億t，約占世界總產(chǎn)量的35.8%，穩(wěn)居世界第一[1]。番茄栽培過(guò)程中常有多種病害發(fā)生，嚴(yán)重制約著番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的進(jìn)一步提升[2]。其中，番茄灰霉病是一種世界性的真菌病害，尤其是隨著保護(hù)地番茄栽培面積的逐年增加，我國(guó)番茄灰霉病的發(fā)生越來(lái)越嚴(yán)重和頻繁，經(jīng)常造成大面積減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)甚至絕收[3-4]。番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌（Botrytis"cinerea）侵染引起[5-6]，該病菌是一種廣泛分布的植物真菌病原體，在侵染植物的過(guò)程中，因發(fā)病部位會(huì)產(chǎn)生大量灰色孢子，形成灰色霉層，因此該病被稱作灰霉病[7]。

灰霉病主要為害番茄葉片、果實(shí)、花、莖、葉等部位[3-4]。盡管生物防治措施已逐漸用于番茄灰霉病的防治，但目前施用化學(xué)殺菌劑仍是防治灰霉病的主要措施[8]。一方面，化學(xué)藥劑防治灰霉病的成本非常高。如歐洲為防治作物灰霉病每年在采購(gòu)化學(xué)藥劑上的花費(fèi)高達(dá)5.4億歐元，約占世界殺菌劑市場(chǎng)總額的10%[9]。另一方面，殺菌劑不僅對(duì)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生危害，長(zhǎng)期施用所導(dǎo)致的病菌抗藥性也在一定程度上限制了殺菌劑的防治效果[10]。因此，選育抗病品種是解決番茄生產(chǎn)上灰霉病為害的有效措施之一。由于缺少抗性種質(zhì)資源，導(dǎo)致利用傳統(tǒng)育種手段進(jìn)行番茄灰霉病抗性育種受到限制。因此，有必要通過(guò)生理生化和基因工程等研究和技術(shù)手段來(lái)克服這一困難。

已有研究表明，蔗糖分解代謝在植物抗病中發(fā)揮著重要作用，不僅可以為植物防御反應(yīng)（如細(xì)胞壁加厚、植物毒素合成等）提供所需的碳骨架和能量，而且蔗糖及其分解產(chǎn)生的己糖（葡萄糖和果糖）還可以作為信號(hào)分子調(diào)控抗病基因的表達(dá)[11]。植物體內(nèi)有兩大類分解蔗糖的酶，即轉(zhuǎn)化酶（invertase，"INV）和蔗糖合成酶（sucrose"synthase，"Sus）。根據(jù)亞細(xì)胞定位的不同，轉(zhuǎn)化酶可進(jìn)一步細(xì)分為細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶（cell"wall"invertase，"CWIN）、液泡轉(zhuǎn)化酶（vacuolar"invertase，"VIN）和細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶（cytosolic"invertase，"CIN）[12]。

目前有關(guān)蔗糖分解代謝和植物抗病性的相關(guān)研究主要集中于CWIN。與其他3種蔗糖分解酶（VIN、CIN和Sus）不同，CWIN在質(zhì)外體空間水解蔗糖，這使CWIN在植物抗病中發(fā)揮著獨(dú)特的作用。首先，CWIN通過(guò)降低感染部位的蔗糖濃度從而促進(jìn)蔗糖沿濃度梯度從韌皮部向病菌感染部位運(yùn)輸和卸載，為植物防衛(wèi)反應(yīng)提供足夠的糖分供應(yīng)[12-14]；其次，CWIN在質(zhì)外體空間分解產(chǎn)生的己糖可以作為信號(hào)分子激活植物的防衛(wèi)反應(yīng)。研究表明，植物防御反應(yīng)的啟動(dòng)主要受質(zhì)外體空間己糖信號(hào)的調(diào)控，而不是細(xì)胞內(nèi)的己糖信號(hào)[15-16]。最后，病原菌成功侵入植物細(xì)胞之前，需要從植物的質(zhì)外體空間吸收糖分（主要是葡萄糖和果糖）來(lái)維持其生長(zhǎng)發(fā)育[17-18]。因此，CWIN還可以通過(guò)調(diào)控質(zhì)外體空間蔗糖的分解速度和己糖含量來(lái)影響病菌的生長(zhǎng)發(fā)育。已有研究表明，CWIN在植物抗病中的作用可能受病菌從植物寄主中獲取營(yíng)養(yǎng)方式的影響，即CWIN可提高植物對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)型病菌（necrotrophic"pathogens）的抗性，但會(huì)降低其對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)型病菌（biotrophic"pathogens）的抗性[11]。

然而，目前尚無(wú)CWIN對(duì)番茄灰霉病抗性影響的相關(guān)研究。由于灰霉病菌屬于死體營(yíng)養(yǎng)性病菌[19]，因此推測(cè)CWIN可提高番茄對(duì)灰霉病的抗性。前人通過(guò)RNA干擾（RNAi）技術(shù)下調(diào)番茄CWIN抑制因子基因（INVINH1）的表達(dá)可顯著提高番茄中的CWIN活性[20]。本研究以該轉(zhuǎn)基因番茄（RNAi）及其相應(yīng)的野生型番茄（WT）為材料，闡明CWIN對(duì)番茄灰霉病抗性的影響。同時(shí)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)初步揭示CWIN調(diào)控番茄灰霉病抗性的分子機(jī)制，為下一步利用基因工程、分子育種等現(xiàn)代生物技術(shù)手段提高番茄灰霉病抗性提供理論指導(dǎo)。

1""材料與方法

1.1""材料

供試的野生型番茄（WT）為新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所培育的新番2號(hào)品種。利用RNAi技術(shù)下調(diào)WT番茄中CWIN抑制因子基因INVINH1的表達(dá)，從而獲得CWIN活性上調(diào)的轉(zhuǎn)基因番茄（RNAi）[20]?；颐共【˙otrytis"cinerea）由海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院劉銅教授提供。

1.2""方法

1.2.1""番茄種植""各取30粒RNAi和WT種子，首先用70%無(wú)水乙醇浸泡并振蕩1"min。用蒸餾水清洗2遍后在0.2%"NaClO溶液中浸泡5"min，再使用蒸餾水清洗5遍。將消毒滅菌后的種子置于底部墊有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，于培養(yǎng)箱中避光恒溫（27"℃）催芽5"d。種子露白后，將種子播種于24孔穴盤內(nèi)進(jìn)行育苗，所用基質(zhì)為直徑2～6"mm的蛭石。待子葉出土后，開始澆施1/2濃度的園試配方營(yíng)養(yǎng)液。將20"d苗齡的番茄幼苗移栽至由土和生物有機(jī)肥組成的混合栽培基質(zhì)中（土肥比為3∶1），按照30"kg/667"m2的規(guī)格施入史丹利復(fù)合肥（N∶P∶K=15∶15∶15）作為基肥[21]，然后盆栽于海南大學(xué)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地溫室內(nèi)。

1.2.2""病菌接種""從移栽5周后的RNAi和WT植株從上往下選取第3、4片大小和形狀一致的復(fù)葉，用蒸餾水清洗干凈后用于灰霉菌接種試驗(yàn)[21]。灰霉菌接種方法參照LIAN等[22]的方法。首先用SMB液體培養(yǎng)基制備灰霉菌孢子懸浮液，并調(diào)整孢子終濃度至2×104個(gè)/mL，然后將葉柄嵌入含有0.8%瓊脂的培養(yǎng)皿中，并保持葉面平整；在每片葉子主脈兩側(cè)各接種3滴孢子懸浮液，每滴約5"μL；密封培養(yǎng)皿避光恒溫（23"℃）培養(yǎng)，分別于接種后12、60"h對(duì)番茄葉片進(jìn)行病情觀察并取樣。取樣時(shí)以接種部位為中心進(jìn)行打孔取樣，圓孔直徑為1"cm，共稱取0.15"g樣品，液氮速凍，置于–80"℃保存，用于后續(xù)總RNA的提取和酶活性測(cè)定。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3""酶活性測(cè)定""參照TOMLINSON等[23]的方法，采用分光光度計(jì)法測(cè)定番茄葉片中CWIN活性。

1.2.4""轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析""對(duì)未接種（Mock）和接種（Bc）灰霉菌的WT（W）和RNAi（R）番茄葉片在12"h和60"h進(jìn)行取樣，每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共24個(gè)樣品，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?？俁NA的提取純化與質(zhì)量評(píng)估、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成。對(duì)下機(jī)的raw"reads利用fastp進(jìn)行質(zhì)控，過(guò)濾去除含adapter的reads、去除含N比例大于10%的reads、去除全部均為A堿基的reads、去除低質(zhì)量reads（質(zhì)量值Q≤20的堿基數(shù)占整條read的50%以上），得到clean"reads。利用HISAT2軟件對(duì)clean"reads與番茄參考基因組（ITAG4.0，"http：//www.sgn.cornell.edu）開展基于參考基因組的比對(duì)分析。按照FDRlt;0.05且|log2FC|gt;1的基因?yàn)轱@著差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選。通過(guò)廣州基迪奧生物科技有限公司提供的在線網(wǎng)站（https：//www.omicsmart."com）進(jìn)行差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析，其中KEGG通路圖是利用pathview在線網(wǎng)站（https：//pathview."uncc.edu/analysis）制成，利用MapMan軟件檢測(cè)生物脅迫過(guò)程中的差異表達(dá)基因。

1.2.5nbsp;"RNA-seq結(jié)果的qRT-PCR驗(yàn)證""以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序使用的總RNA為模板，使用諾唯贊HiScript"Ⅲ"All-in-one"RT"SuperMix"Perfect"for"qPCR（R333）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使用諾唯贊ChamQ"Universal"SYBR"qPCR"Master"Mix（Q711）試劑盒，通過(guò)德國(guó)耶拿qTOWER3G定量PCR儀定量分析基因的相對(duì)表達(dá)水平。使用NCBI"Primer-Blast工具（https：//www.ncbi.nlm.nih."gov/tools/primer-blast/）設(shè)計(jì)基因特異性引物對(duì)，以番茄a(bǔ)ctin基因作為參照基因、根據(jù)2-ΔΔCT方法計(jì)算轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)表達(dá)水平。qRT-PCR驗(yàn)證所用到的基因和引物信息見表1。

1.3""數(shù)據(jù)處理

利用Excel"2020軟件對(duì)酶活性數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖并進(jìn)行t-test分析。

2""結(jié)果與分析

2.1""WT和RNAi番茄在灰霉病抗性上的差異

將WT和RNAi番茄葉片接種灰霉病菌后，分別于接種后12、60"h觀察發(fā)病程度的差異。結(jié)果表明，接種后12"h，WT和RNAi番茄葉片均無(wú)明顯病斑（圖1A）；在接種后60"h，WT和RNAi番茄葉片均出現(xiàn)明顯病斑，但WT葉片的病斑面積明顯大于RNAi葉片（圖1A中箭頭所示）。CWIN活性測(cè)定表明，在0"h時(shí)RNAi番茄葉片的CWIN活性比WT高73%；而在接種后12、60"h，WT和RNAi的CWIN活性無(wú)顯著差異。并且隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，WT和RNAi葉片的CWIN活性均呈快速上升的趨勢(shì)（圖1B），表明接種灰霉菌可誘導(dǎo)番茄葉片CWIN活性的上升。綜上表明，RNAi番茄葉片中的高CWIN活性可提升番茄對(duì)灰霉病的抗性。

2.2""轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

對(duì)未接種（Mock）和接種（Bc）灰霉菌的WT（W）和RNAi（R）番茄葉片在12"h和60"h進(jìn)行取樣，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。將經(jīng)過(guò)質(zhì)控后的數(shù)據(jù)與番茄基因組進(jìn)行比對(duì)，其中單一比對(duì)結(jié)果的比例是65.43%～95.28%，clean"reads總數(shù)為1"047"124"488；通過(guò)對(duì)過(guò)濾后數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，各樣品Q30堿基百分比≥93.02%，GC含量為41.88%～42.47%（表2），說(shuō)明測(cè)序質(zhì)量較高，數(shù)據(jù)可信度較高。在剔除2個(gè)離群樣本后（W-Mock-"12"h-2和W-Bc-60"h-2），樣本間相關(guān)性熱圖分析表明r值均大于0.80（圖2），表明同一處理不同重復(fù)樣品間具有較好的重復(fù)性，可用于后續(xù)分析研究。

2.3""差異表達(dá)基因（DEGs）分析

按照FDRlt;0.05和|log2FC|gt;1的雙重標(biāo)準(zhǔn)來(lái)篩選顯著差異表達(dá)基因（DEG）。對(duì)番茄接種灰霉病菌前后的DEGs（R-Mock-vs-R-Bc和W-Mock-vs-"W-Bc）進(jìn)行分析（圖3A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未接種灰霉病菌番茄相比，接種12"h后WT和RNAi番茄的DEGs總數(shù)（上調(diào)和下調(diào)）分別為4個(gè)和6個(gè)，接種60"h的DEGs總數(shù)則分別為76個(gè)和163個(gè)。與接種早期相比，接種后期番茄葉片的DEGs數(shù)量更多，并且接種后（特別是60"h）RNAi番茄的DEGs數(shù)量明顯高于WT。進(jìn)一步分析表明，與未接種灰霉病菌相比，接種12"h后WT和RNAi番茄葉片上調(diào)的基因數(shù)量分別為1個(gè)和3個(gè)，接種60"h的上調(diào)基因數(shù)量分別為52個(gè)和137個(gè)。同樣，與未接種灰霉病菌相比，接種12"h后WT和RNAi番茄葉片下調(diào)的基因數(shù)量均為3個(gè)，接種60"h后的下調(diào)基因數(shù)量分別為24個(gè)和26個(gè)。表明接種病菌后，RNAi番茄上調(diào)的基因數(shù)量多于WT，而二者的下調(diào)基因數(shù)差異不大。因此，接種后WT和RNAi在上調(diào)基因數(shù)量上的差異可能是導(dǎo)致抗病性差異的主要原因。值得注意的是，WT和RNAi葉片上調(diào)DEGs和下調(diào)DEGs在接種12"h和60"h之間均無(wú)重疊，均為各自所特有的DEGs，表明番茄葉片在接種灰霉病菌早期和后期的防御機(jī)制存在較大差異。

總體來(lái)看，在2個(gè)取樣時(shí)期中，共有169個(gè)基因在R-Mock-vs-R-Bc中差異表達(dá)，80個(gè)基因在W-Mock-vs-W-Bc中差異表達(dá)（圖3B），表明灰霉病菌對(duì)RNAi番茄基因表達(dá)的影響大于WT番茄。并且R-Mock-vs-R-Bc的DEGs和W-Mock-"vs-W-Bc的DEGs之間重疊的數(shù)量非常少，其中W-Mock-60"h-vs-W-Bc-60"h和R-Mock-60"h-vs-R-"Bc-60"h的DEGs之間僅有19個(gè)共同的DEGs，而W-Mock-60"h-vs-W-Bc-60"h和R-Mock-12"h-vs-R-"Bc-12"h的DEGs之間則僅有1個(gè)共同的DEG，表明RNAi番茄接種灰霉病菌后出現(xiàn)大量未重疊的DEGs（R-Mock-vs-R-Bc）可能是增強(qiáng)番茄對(duì)灰霉病抗性的重要基因。

為進(jìn)一步發(fā)掘?qū)е翿NAi抗病性增強(qiáng)的DEGs，對(duì)接種灰霉病菌后WT和RNAi番茄之間的DEGs進(jìn)行分析（W-Bc-vs-R-Bc）（圖4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與接種后12"h和60"h的WT相比，RNAi番茄上調(diào)的基因分別有406個(gè)和362個(gè)，下調(diào)的基因分別有183個(gè)和112個(gè)（圖4A）。與接種后期（60"h）相比，接種早期（12"h）的DEGs總數(shù)更多，接種12"h和60"h，DEGs數(shù)量分別為589個(gè)和474個(gè)；并且接種后12"h和60"h，上調(diào)的DEGs數(shù)量均明顯高于下調(diào)DEGs數(shù)量，其中大部分為每個(gè)時(shí)期所特有的DEGs，只有85個(gè)為共同的DEGs（圖4B），表明RNAi番茄葉片在接種灰霉病菌早期和后期的防御機(jī)制存在較大差異。綜上，接種灰霉病菌后WT和RNAi對(duì)比（W-Bc-vs-"R-Bc）得到的DEGs數(shù)量（圖4）高于WT接種前后對(duì)比（W-Mock-vs-W-Bc）和RNAi接種前后對(duì)比（R-Mock-vs-R-Bc）得到的DEGs總數(shù)（圖3）。因此，后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組分析僅聚焦于接種灰霉病菌后WT和RNAi對(duì)比（W-Bc-vs-R-Bc）得到的DEGs。

2.4""差異表達(dá)基因的GO富集分析

利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)上述589個(gè)W-Bc-12"h-vs-"R-Bc-12"h的DEGs和474個(gè)W-Bc-60"h-vs-R-Bc-"60"h的DEGs進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)12"h和60"h的DEGs分別分布在三大類功能注釋中的39個(gè)和46個(gè)類別。其中，12"h的DEGs在生物學(xué)過(guò)程（biological"process，"BP）、分子功能（molecular"function，"MF）和細(xì)胞組分（cellular"component，"CC）中分別有20個(gè)、8個(gè)和11個(gè)類別（圖5A），而60"h的DEGs在上述三大類功能注釋中分別有21個(gè)、11個(gè)和14個(gè)類別（圖5B）。因此，接種12"h和60"h的DEGs均主要集中于BP，其次是CC，第三為MF。進(jìn)一步分析表明，接種12"h的BP包括代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、單生物過(guò)程、應(yīng)激反應(yīng)等詞條，MF包括催化活性、粘合、轉(zhuǎn)運(yùn)活性和核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性等詞條，CC包括細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞器和膜等詞條。值得注意的是，盡管接種60"h和12"h的DEGs在三大類功能注釋中的詞條種類和數(shù)目存在一定的差異，但接種60"h的DEGs在三大類功能注釋中的前5個(gè)詞條和接種12"h的完全一致，表明CWIN在接種灰霉病菌早期和后期調(diào)控番茄抗病性的機(jī)理存在一定的相似性。

2.5""差異表達(dá)基因的KEGG注釋和MapMan圖

在生物體內(nèi)，不同蛋白相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能，基于Pathway的分析有助于更進(jìn)一步了解DEG的生物學(xué)功能，KEGG是有關(guān)Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)[24]。將2.3中的DEGs在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Pathway注釋發(fā)現(xiàn)，W-Bc-12"h-vs-R-Bc-12"h的DEGs共富集到85個(gè)通路，其中只有5個(gè)顯著性富集的通路（圖6A），包括次生代謝物生物合成（biosynthesis"of"secondary"metabolites）、代謝途徑（metabolic"pathways）、DNA復(fù)制（DNA"replication）、淀粉和蔗糖代謝（starch"and"sucrose"metabolism）以及甾族化合物生物合成（steroid"biosynthesis）；W-Bc-60"h-vs-R-"Bc-60"h的DEGs共富集到74個(gè)通路，但未發(fā)現(xiàn)顯著性富集的通路（圖6B），排名前五的通路分別是次生代謝物生物合成、光合生物碳固定（carbon"fixation"in"photosynthetic"organisms）、氮代謝（nitrogen"metabolism）、其他多糖降解（other"glycan"degradation）和過(guò)氧化物酶體（peroxisome）。因此，KEGG分析表明，與CWIN增強(qiáng)番茄對(duì)灰霉病抗性密切相關(guān)的通路主要存在于接種早期（12"h），且最顯著富集的通路是次生代謝物生物合成，而在接種后期（60"h）則無(wú)顯著富集的通路。

為進(jìn)一步鑒定出與灰霉病抗病性密切相關(guān)的DEGs，嘗試將所有DEGs整合到植物-病原菌互作中（圖7）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種后12"h和60"h的DEGs主要富集到4個(gè)通路中，包括超敏反應(yīng)（hypersensitive"response）、細(xì)胞壁增強(qiáng)（cell"wall"reinforcement）、氣孔關(guān)閉（stomatal"closure）和防御相關(guān)基因誘導(dǎo)（defense-related"gene"induction）。與WT相比，接種12"h的RNAi番茄的超敏反應(yīng)和胞壁增強(qiáng)通路中的的鈣依賴蛋白激酶基因CDPK（Solyc02g083850.3）以及防御相關(guān)基因誘導(dǎo)通路中的基因Pti5（Solyc02g077370.1）、Rd19（Solyc01g110110.3）和PR1（Solyc01g106605.1、Solyc01g106620.2和Solyc09g007010.1），其表達(dá)下調(diào)，而同時(shí)參與超敏反應(yīng)和防御相關(guān)基因誘導(dǎo)通路的基因FLS2（Solyc02g072440.4）表達(dá)上調(diào)。接種60"h時(shí)，RNAi番茄中與超敏反應(yīng)有關(guān)的熱激蛋白基因HSP90（Solyc07g047790.3）表達(dá)上調(diào)，而氣孔關(guān)閉和細(xì)胞壁增強(qiáng)基因CaLM/CML（Solyc03g118810.1）、防御相關(guān)基因誘導(dǎo)基因Rd19（Solyc01g110110.3）則表達(dá)下調(diào)。綜上，所有1063個(gè)DEGs中僅有9個(gè)基因富集到植物-病原菌互作通路中，表明這些基因可能在CWIN增強(qiáng)番茄對(duì)灰霉病抗性過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

植物激素（如水楊酸和茉莉酸等）在植物抗病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[25]。通過(guò)將相關(guān)DEGs整合到植物激素信號(hào)通路中（圖8），發(fā)現(xiàn)與WT相比，接種灰霉病菌后RNAi番茄的1個(gè)生長(zhǎng)素內(nèi)向轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因Aux1（Solyc10g055260.2，"auxin"influx"carrier）和5個(gè)生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白基因Aux/"IAA（Solyc01g097290.4、Solyc06g053830.3、Solyc08g021820.3、Solyc09g083280.3、Solyc09g"083290.3，"auxin-responsive"protein）、2個(gè)生長(zhǎng)素響應(yīng)基因GH3（Solyc07g054580.3、Solyc10g008520.3，"auxin"responsive"GH3"gene"family）的表達(dá)均上調(diào)，只有1個(gè)生長(zhǎng)素響應(yīng)因子基因ARF（Solyc04g"081240.2，"auxin"response"factor）的表達(dá)下調(diào)，但ARF是生長(zhǎng)素信號(hào)途徑中的負(fù)調(diào)控因子[26-27]。

和生長(zhǎng)素信號(hào)途徑類似，接種灰霉病菌后RNAi番茄的細(xì)胞分裂素信號(hào)途徑也呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，包括2個(gè)細(xì)胞分裂素受體基因CRE1（Solyc04g008110.3、Solyc04g008110.3，"cytokinin"receptor）、2個(gè)AHP基因（Solyc01g098400.3、Solyc08g066350.2，"histidine-containing"phosphotransfer"protein）和1個(gè)A-ARR基因（Solyc05"g006420.3，"two-component"response"regulator"ARR-A"family）的表達(dá)均上調(diào)。此外，乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的1個(gè)EIN3基因（Solyc01g006650.2，"ethylene-insensitive"protein"3）和1個(gè)乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因ERF1/2（Solyc05g051180.3，"ethylene-"responsive"transcription"factornbsp;1）的表達(dá)同樣上調(diào)。

方框被分成2個(gè)部分，左側(cè)表示W(wǎng)-Bc-12"h-vs-R-Bc-12"h，右側(cè)表示W(wǎng)-Bc-60"h-vs-R-Bc-60"h?；疑蚧驘o(wú)顏色填充框表示沒有為該KO（KEGG"Ontology）項(xiàng)分配DEG。顏色漸變代表log2倍率，紅色代表上調(diào)，綠色代表下調(diào)。

值得注意的是，RNAi番茄的脫落酸信號(hào)途徑的1個(gè)PP2C基因（Solyc07g040990.4，"protein"phosphatase"2C）的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，這可能會(huì)導(dǎo)致病菌侵染期間氣孔關(guān)閉受阻，這與植物病原菌互作通路分析（圖7）得到的結(jié)果相同。最后，水楊酸信號(hào)途徑上游的1個(gè)TGA基因（Solyc05g"009660.4，"transcription"factor）的表達(dá)上升，但下游3個(gè)PR-1基因（Solyc01g106605.1、Solyc01g"106620.2、Solyc09g007010.1，"pathogenesis-related"protein"1）的表達(dá)下降，表明RNAi番茄葉片中的水楊酸信號(hào)途徑總體呈減弱的趨勢(shì)?？傮w而言，與WT相比，接種后RNAi番茄葉片中的生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、乙烯信號(hào)途徑增強(qiáng)，而脫落酸和水楊酸信號(hào)途徑則減弱。

為進(jìn)一步鑒定番茄對(duì)灰霉病抗性相關(guān)的DEGs，利用MapMan軟件對(duì)上述DEGs進(jìn)行生物脅迫相關(guān)基因分析（圖9）。在激素信號(hào)方面，RNAi番茄在生長(zhǎng)素和乙烯信號(hào)途徑方面得到增強(qiáng)，在脫落酸信號(hào)途徑上減弱，這和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路圖的分析結(jié)果一致。此外，MapMan圖還揭示出RNAi番茄在油菜素內(nèi)酯和茉莉酸途徑上也得到增強(qiáng)，而這2種激素信號(hào)途徑的增強(qiáng)也有助于提高植物的抗病性[25]。

此外，RNAi番茄在細(xì)胞壁合成、蛋白水解、氧化還原狀態(tài)、過(guò)氧化物酶、抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、次生代謝物方面也得到極大的加強(qiáng)，特別是次生代謝物相關(guān)基因的上調(diào)與KEGG分析結(jié)果一致（圖6）。值得注意的是，和植物抗病密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子MAPK和WRKY出現(xiàn)下調(diào)或者未富集到的情況，這和前人的研究結(jié)果[28]并不相同，表明MAPK和WRKY并未參與防御反應(yīng)，CWIN對(duì)番茄灰霉病抗性的調(diào)控具有其特有的機(jī)制。

2.6""RNA-seq數(shù)據(jù)的qRT-PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，選取10個(gè)DEGs（表1），并使用與RNA-seq相同的總RNA進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)。結(jié)果表明，qRT-PCR相對(duì)表達(dá)量的對(duì)數(shù)值與RNA-seq分析的log2FC趨勢(shì)一致（圖10），表明本研究的RNA-seq數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

3""討論"

已有研究表明，CWIN可提高植物對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)型病菌的抗性，但會(huì)降低植物對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)型病菌的抗性[11]。如超表達(dá)CWIN基因的水稻對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌病菌Xanthomonas"oryzae"pv."oryzae和真菌病菌Magnaporthe"oryzae的抗性均明顯增強(qiáng)[29]。通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制煙草中CWIN的表達(dá)則導(dǎo)致植株對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)型卵菌病原菌Phytophthora"nicotianae的抗性降低[30]。與此相反，CWIN可降低植物對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)型病菌的抗性。如番茄CWIN基因LIN8的沉默不僅未降低番茄植株的抗性，反而增加了其對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌病菌Xanthomonas"campestris"pv."vesicatoria的抗性[31]。同樣，通過(guò)超表達(dá)CWIN抑制因子的方法降低CWIN的活性導(dǎo)致擬南芥對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)型真菌病菌Plasmodiophora"brassicae抗性增加[32]?；颐共∈欠焉a(chǎn)中常見的病害，灰霉病菌屬于死體營(yíng)養(yǎng)性病菌[19]，推測(cè)CWIN活性的升高會(huì)增強(qiáng)番茄對(duì)灰霉病的抗性。通過(guò)灰霉病菌離體接種試驗(yàn)研究表明，提高CWIN活性確實(shí)可顯著增強(qiáng)番茄對(duì)灰霉病的抗性。對(duì)番茄葉片CWIN活性的測(cè)定表明，接種0"h，RNAi番茄葉片的CWIN活性顯著高于WT。接種12、60"h后，2種基因型番茄葉片的CWIN活性受灰霉菌的誘導(dǎo)均呈快速上升趨勢(shì)，導(dǎo)致CWIN活性在RNAi和WT上的差異消失。因此，RNAi和WT的抗病性差異主要是由于接種早期的CWIN活性差異導(dǎo)致的。此結(jié)果和前人研究結(jié)果[33-34]一致，即接種病菌后CWIN活性上升早有利于提高植物的抗病性，而CWIN活性上升晚則不利于增強(qiáng)其抗病性。

對(duì)2種基因型番茄接種和未接種灰霉菌12、60"h的葉片進(jìn)行取樣和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后，分別對(duì)接種前后番茄的DEGs（W-Mock-vs-W-Bc和R-Mock-vs-R-Bc）及其接種后2種基因型番茄的DEGs（W-Bc-vs-R-Bc）進(jìn)行分析，分析結(jié)果均顯示：接種12、60"h的DEGs之間的重疊數(shù)量非常少，這表明番茄葉片在接種早期和接種后期的防御反應(yīng)存在較大差異。不同的是前者分析表明，接種后期（60"h）番茄葉片的DEGs數(shù)量大幅高于接種早期（12"h），而后者分析表明，接種早期（12"h）DEGs總數(shù)明顯高于接種后期（60"h）?？紤]到接種早期是病菌侵染的關(guān)鍵時(shí)期且2種基因型番茄的CWIN活性差異僅存在于接種早期，因此對(duì)接種早期更多數(shù)量的DEGs分析有助于闡明CWIN調(diào)控灰霉病抗性的分子機(jī)制并挖掘關(guān)鍵抗病基因。據(jù)此后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組分析僅聚焦于W-Bc-vs-R-Bc分析得到的DEGs。

對(duì)DEGs（W-Bc-vs-R-Bc）的KEGG注釋表明，接種灰霉病菌12"h的DEGs共富集到85個(gè)通路上，其中只有5個(gè)顯著性富集的通路，包括次生代謝物生物合成（biosynthesis"of"secondary"metabolites）、代謝途徑（metabolic"pathways）、DNA復(fù)制（DNA"replication）、淀粉和蔗糖代謝（starch"and"sucrose"metabolism）以及甾族化合物生物合成（steroid"biosynthesis）；雖然接種60"h的DEGs共富集到74個(gè)通路，但并未發(fā)現(xiàn)顯著性富集的通路。KEGG注釋表明，與CWIN增強(qiáng)番茄對(duì)灰霉病抗性密切相關(guān)的DEGs可能主要存在于接種早期，這與接種后12"h比60"h具有更多數(shù)量的DEGs分析結(jié)果一致。

上述KEGG注釋雖然發(fā)現(xiàn)5個(gè)DEGs顯著富集的通路，但這些通路中的基因并不是均與植物的抗病性相關(guān)，因此繼續(xù)進(jìn)行植物-病原菌互作圖分析，以鑒定出和番茄抗病性密切相關(guān)的基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有9個(gè)DEGs富集到4類通路中，其中值得關(guān)注的是同時(shí)參與超敏反應(yīng)和防御相關(guān)基因誘導(dǎo)的基因FLS2（Solyc02g072440.4）以及參與與超敏反應(yīng)有關(guān)的熱激蛋白基因HSP90（Solyc07g047790.3），與接種后的WT相比，這2個(gè)基因在接種后的RNAi番茄中均顯著上調(diào)。研究表明，F(xiàn)LS2是富含亮氨酸重復(fù)（LRR）受體類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（LRR-receptor"serine/"threonine-like"kinase），是植物的先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，構(gòu)成植物防御病原微生物感染的第一道防線，同時(shí)對(duì)系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）的激活也有重要的影響[35-36]。此外，超敏反應(yīng)是植物抵抗病菌侵染最有效和最直接的抗性反應(yīng)之一[37]，而HSP90基因作為超敏反應(yīng)的下游成分，可通過(guò)激活植物的超敏反應(yīng)來(lái)提高植物的抗病性[38]。因此，F(xiàn)LS2和HSP90這2個(gè)基因可能是CWIN增強(qiáng)番茄對(duì)灰霉病抗性途徑中的重要基因。

植物激素如水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）在植物抗病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[25]。通過(guò)繼續(xù)將相關(guān)DEGs整合到植物激素信號(hào)通路中，發(fā)現(xiàn)與WT相比，接種灰霉病菌后RNAi番茄的生長(zhǎng)素（IAA）、細(xì)胞分裂素（CTK）和乙烯（ET）信號(hào)途徑增強(qiáng)，而脫落酸（ABA）和SA信號(hào)途徑則減弱。生物脅迫相關(guān)基因的MapMan作圖分析也部分驗(yàn)證了上述結(jié)果，即接種灰霉病菌后RNAi番茄在IAA和ET信號(hào)途徑得到增強(qiáng)，而ABA信號(hào)途徑減弱。此外，MapMan作圖還發(fā)現(xiàn)RNAi番茄在油菜素內(nèi)酯（BR）和茉莉酸（JA）途徑上也得到增強(qiáng)。

植物激素在廣義上也屬于次生代謝物，因此該結(jié)果和KEGG注釋得到結(jié)果一致，即次生代謝物生物合成是富集到的顯著性最高的通路。在植物激素中，SA和JA/ET因其在植物抗病中的重要作用而被稱作抗病相關(guān)激素，其中SA可增強(qiáng)植物對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)型病菌（如Pst"DC3000）的抗性，而JA/ET可增強(qiáng)植物對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)型病菌（如灰霉病菌）的抗性，且SA和JA/ET之間存在拮抗作用[25，"39]。因此，接種灰霉病菌后RNAi番茄中JA和ET信號(hào)途徑的上調(diào)可增加番茄對(duì)灰霉病的抗性，同時(shí)SA信號(hào)途徑的減弱也可進(jìn)一步增強(qiáng)JA/ET信號(hào)途徑的作用。IAA和CTK被稱作生長(zhǎng)促進(jìn)激素，而ABA屬于衰老促進(jìn)激素[40]。接種后，RNAi番茄葉片中的IAA和CTK信號(hào)途徑增強(qiáng)，而ABA信號(hào)途徑減弱，這樣可以抑制病菌侵染期間細(xì)胞的死亡，從而阻止灰霉病菌從死亡細(xì)胞上獲得必要的養(yǎng)分供應(yīng)用于侵染番茄。雖然在正常生長(zhǎng)發(fā)育條件下，乙烯也屬于衰老相關(guān)激素，但在病菌脅迫下，乙烯信號(hào)途徑的主要作用是增強(qiáng)植物的抗病性[25，"40]?？傊?，CWIN轉(zhuǎn)化酶可通過(guò)調(diào)控植物激素信號(hào)途徑來(lái)增強(qiáng)番茄對(duì)灰霉病的抗性。此外，MapMan圖還揭示接種灰霉病菌后RNAi番茄在細(xì)胞壁代謝、蛋白水解、活性氧（氧化還原狀態(tài)和過(guò)氧化物酶）、次生代謝物方面也得到極大的加強(qiáng)，其中次生代謝物相關(guān)基因的上調(diào)和KEGG分析結(jié)果一致，而這些途徑也均有助于增強(qiáng)植物的抗病能力[41-42]。

以往有關(guān)CWIN調(diào)控植物抗病性的研究主要通過(guò)組織學(xué)、生理生化、qRT-PCR等方法[29-32]，尚無(wú)采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法進(jìn)行研究的報(bào)道。已有研究結(jié)果表明，CWIN主要通過(guò)激活植物防御反應(yīng)來(lái)提高植物對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)型病害的抗性，包括細(xì)胞壁加厚（如胼胝質(zhì)合成）、活性氧積累和超敏反應(yīng)（HR）、抗病激素的積累（主要是水楊酸、茉莉酸和乙烯）、病程相關(guān)蛋白（如PR蛋白）和次生代謝物的合成（如植物毒素和多酚等）、氣孔關(guān)閉等[41-42]。本研究轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果不僅部分驗(yàn)證了已有研究結(jié)果，而且還發(fā)現(xiàn)CWIN調(diào)控番茄對(duì)灰霉病的抗性新機(jī)制和新途徑。如在植物激素信號(hào)途徑方面，除了發(fā)現(xiàn)抗病激素水楊酸、茉莉酸和乙烯外，還發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和脫落酸信號(hào)途徑也參與了CWIN對(duì)植物抗病性的調(diào)控。此外，大量蛋白水解相關(guān)基因在RNAi番茄中顯著上調(diào)，鑒于灰霉病菌的致病因子包含了多種酶，如天冬氨酸蛋白酶、多聚半乳糖醛酸酶和漆酶[43-44]，同時(shí)灰霉病還可分泌大量寄主降解酶[45]。因此，RNAi番茄很可能通過(guò)上調(diào)蛋白水解相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)防御灰霉病菌的侵染。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)有些抗病機(jī)制與已有研究結(jié)果不同。首先，前人研究表明，CWIN可通過(guò)減小氣孔的開度來(lái)防治病菌通過(guò)氣孔侵染植物，從而提高植物的抗病能力[41-42]。然而，本研究表明，促進(jìn)氣孔關(guān)閉的基因CaLM/CML和PP2C的表達(dá)在RNAi番茄中下調(diào)，這可能會(huì)抑制氣孔在病原菌侵染時(shí)的關(guān)閉，從而導(dǎo)致發(fā)病加重，但實(shí)際情況卻是RNAi番茄的抗性增強(qiáng)。其原因可能是本研究在離體條件下進(jìn)行，如果植物氣孔關(guān)閉幅度過(guò)大則葉片可能會(huì)因?yàn)椴荒苓M(jìn)行正常光合作用從而導(dǎo)致葉片的糖分供應(yīng)減少，而RNAi番茄適當(dāng)增加氣孔的開度可為防御反應(yīng)提供更多的糖分供應(yīng)，從而有助于提高番茄的抗病能力。其次，與植物抗病密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子MAPK和WRKY出現(xiàn)下調(diào)或者未富集到的情況，這與前人研究結(jié)果[28]并不相同。這些證據(jù)表明，CWIN調(diào)控番茄-灰霉病菌互作的機(jī)制有其獨(dú)特之處，可能與其他植物-病菌互作體系（pathosystem）不同。

總之，本研究不僅表明提高番茄的CWIN活性可顯著增強(qiáng)番茄對(duì)灰霉病的抗性，而且通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)系統(tǒng)研究了CWIN增強(qiáng)番茄抗病性的分子機(jī)制，不僅驗(yàn)證了已有的CWIN抗病機(jī)制，而且還挖掘出一些新的CWIN抗病機(jī)制，這將為下一步利用基因工程、分子育種等現(xiàn)代生物技術(shù)手段提高番茄對(duì)灰霉病的抗性提供理論指導(dǎo)。

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