陳曉旭鄭亞娟王作英王應(yīng)玲趙睿杰那明慧

(1.丹東農(nóng)業(yè)科學(xué)院,遼寧 鳳城 118100; 2.遼寧省玉米育種重點實驗室,遼寧 鳳城 118100; 3.凌源市溝門子鎮(zhèn)人民政府,遼寧 凌源 122000)

遼寧丹東是全國最大的草莓生產(chǎn)和出口基地,“丹東草莓”獲國家農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志保護(hù),現(xiàn)品牌價值達(dá)77.5 億元,位居全國第一[1]。 由于草莓種植區(qū)土壤連作情況嚴(yán)重,重茬地增多導(dǎo)致草莓根腐病發(fā)生逐年加重,是制約丹東草莓發(fā)展的重要因素之一[2]。 雖有研究表明,引起草莓根腐病的主要病原菌包括立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、草莓疫霉(Strawberryphytophthora)及大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)等20 余種土傳病原真菌,但目前丹東地區(qū)草莓根腐病致病菌種類尚未報道[3～7]。因此,準(zhǔn)確鑒定引起丹東地區(qū)草莓根腐病的致原菌,對該病害的防治及抗病育種工作具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試草莓病株采集于2021 年丹東東港、丹東鳳城等地草莓種植基地,共采集10 份。

1.2 致病菌的分離純化

采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行致病菌的分離:使用無菌水對病樣進(jìn)行清洗晾干后,對發(fā)病部位橫切0.5 cm 小段,取病健交界處縱向切薄塊,75%酒精消毒30 s,無菌水洗滌2 次,1%次氯酸鈉浸泡3 min,無菌水洗滌3 次,無菌干燥濾紙吸干病樣表面的水分。 置于PDA 平板28 ℃倒置培養(yǎng)。

純化:待分離平板長出菌落后,取菌落邊緣新生菌絲置新的PDA 平板上進(jìn)行培養(yǎng),反復(fù)進(jìn)行操作,直至平板菌落一致,分離菌株純化完畢。

1.3 分離菌株致病性測定

使用干熱滅菌處理的基質(zhì)盆栽培養(yǎng)脫毒草莓苗,分離菌株使用PD 培養(yǎng)基28 ℃、150 r/min 培養(yǎng)5～7 d,菌液打碎稀釋后對健康草莓植株進(jìn)行接種。

接種:上述菌液稀釋至含孢子5×107個/ml以備接種,使用注射器針頭對健康草莓苗根部做傷口處理,取菌液5 ～10 ml 澆灌在莖附近土壤表面,保濕培養(yǎng)。 接種無菌水做為對照處理,每處理接種5 株草莓苗。

1.4 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

采用魏景超的真菌鑒定方法對病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定,將病原菌平板4 ℃處理7 d 后,室溫放置30 min,挑取少量菌絲懸浮于滴加無菌水的載玻片上,用高倍鏡觀察病原菌分生孢子形態(tài)。 從病原菌的菌絲、菌絲分枝、孢子等形態(tài)特征來進(jìn)行分類鑒定。

1.5 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

取適量純化的病原菌菌絲,采用CTAB 法提取菌絲基因組DNA。 借助真菌ITS 區(qū)域通用引物(ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’;ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和鐮刀菌延伸因子-1α 蛋白(elongation factor 1α,EF-1α)特異性 引 物 ( TEF1-αF: 5 ’-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3’; TEF1-αR: 5 ’-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3’)對分離菌株的ITS 序列和TEF-1α 序列進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物送由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。 測序結(jié)果經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對。 選取與病原菌EF-1α 序列同源性高的菌株序列,利用MEGA 4.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 生物學(xué)特性研究

1.6.1 溫度 依據(jù)實際棚內(nèi)環(huán)境分別設(shè)置5、10、15、20、25、30、35 ℃共7 個溫度梯度,采用PDA 平板培養(yǎng)致病菌株,每處理重復(fù)5 次。 十字交叉法測量菌落直徑,并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.6.2 不同pH 值 依據(jù)實際棚內(nèi)土壤pH 值設(shè)置5、6、7、8、9 共5 個pH 梯度,用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基酸堿度,配制成不同pH 值的培養(yǎng)基,制成平板25 ℃下恒溫培養(yǎng)致病菌株,每處理重復(fù)5 次。 十字交叉法測量菌落直徑,并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.6.3 光照 設(shè)置3 種處理:24 h 全光照、24 h全黑暗、12 h 光照12 h 黑暗。 采用PDA 平板培養(yǎng)致病菌株,每處理重復(fù)5 次。 十字交叉法測量菌落直徑,并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間發(fā)病癥狀

2021 年在丹東鳳城地區(qū)、東港地區(qū)通過草莓病害調(diào)查發(fā)現(xiàn),發(fā)病植株葉片枯黃萎蔫,根系表面呈黑色,側(cè)根不定根少或無,莖基部橫切,可見中心至邊緣處呈赤褐色。

2.2 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

分離純化得到14 株菌株,形態(tài)學(xué)鑒定為同一種菌株,命名為SRR-1,菌落呈圓形、氣生菌絲白色絨狀、邊緣整齊、輪狀向外擴(kuò)展,菌落背面呈深黃色至淺黃色。 鏡檢下小型分生孢子數(shù)量較多,大多為卵形或者腎形,單孢,假頭狀著生于分生孢子梗上;大型分生孢子為馬特形,兩端鈍圓,頂孢稍彎,有隔膜,多為2 ～3 個隔;分生孢子梗為瓶狀,細(xì)長。 根據(jù)菌株形態(tài)學(xué)特征,參考Booth《鐮刀菌屬》分類系統(tǒng)進(jìn)行鑒定,初步將SRR-1 鑒定為茄腐鐮刀菌。

圖1 草莓根腐病田間癥狀

2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

提取病原菌DNA,采用真菌ITS 區(qū)域通用引物ITS1、ITS4 擴(kuò)增獲得一條600 bp 左右的片段,基因測序后經(jīng)BLAST 比對發(fā)現(xiàn),該病原菌屬于鐮刀菌屬。 使用鐮刀菌通用測序引物TEF1-αF/TEF1-αR 擴(kuò)增獲得一條700 bp 左右的片段,基因測序后經(jīng)BLAST 比對顯示該病原菌與茄腐鐮刀菌F.solani相似度達(dá)100%。 基于TEF1-α 序列構(gòu)建發(fā)育樹。

2.4 草莓根腐病病原菌的致病性

健康草莓植株接種病原菌,14 d 左右草莓葉片邊緣出現(xiàn)萎蔫,葉尖干枯,莖稈持續(xù)變紅,植株活力不足,21～48 h 后整株萎蔫,與田間癥狀表現(xiàn)一致,取根部沖洗,發(fā)現(xiàn)側(cè)根、須根變少變黑。 莖基部縱切發(fā)現(xiàn)黑褐色。 依據(jù)柯赫氏法則再次分離菌株與接種的病原菌一致,表明茄腐鐮刀菌為草莓根腐病致病菌。

2.5 溫度對菌絲生長的影響

丹東地區(qū)溫室草莓一般9 月初左右定植,持續(xù)到次年4 ～5 月,棚內(nèi)溫度基本在10 ～30 ℃之間。 因此,將接種好的菌落平板分別置于5、10、15、20、25、30、35 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 結(jié)果表明病原菌菌絲生長最適宜溫度在25 ～30 ℃。 低于15 ℃或高于35 ℃菌絲生長較慢(圖5)。

圖2 草莓根腐病致病菌的菌落形態(tài)、菌絲和分生孢子

圖3 基于ITS 序列構(gòu)建的發(fā)育樹

圖4 草莓根腐病致病菌的致病性

圖5 溫度對菌絲生長速率的影響

2.6 pH 對菌絲生長的影響

將病原菌接種于不同pH 的培養(yǎng)基中28 ℃恒溫培養(yǎng),結(jié)果表明pH 5～8 之間,菌絲均能正常生長(圖6)。

圖6 pH 值對菌絲生長速率的影響

2.7 光照條件對菌絲生長的影響

草莓根腐病致病菌株SRR-1 在24 h 黑暗條件下生長最快,其次是光暗交替環(huán)境下,菌落直徑分別為7.78 cm 和7.73 cm。 全光照下生長最慢,菌落直徑為7.47 cm(圖7)。

圖7 光照對菌絲生長速率的影響

3 結(jié)論與討論

本研究通過對丹東地區(qū)草莓根腐病病株采樣,經(jīng)組織分離得到菌株14 株,形態(tài)學(xué)鑒定為同一種菌株,柯赫式法則驗證為草莓根腐病致病菌,通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)流程,鑒定該菌株為茄腐鐮刀菌;生物學(xué)特性研究表明:茄腐鐮刀菌菌絲生長適宜溫度在25～30 ℃、最適宜酸堿度在pH 5～8、24 h 黑暗條件下菌絲生長速率最快。

草莓根腐病在國內(nèi)外有不同程度的研究報道,引起草莓根腐病的主要病原菌包括立枯絲核菌(R.solani)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)等20 余種土傳病原真菌,從而導(dǎo)致草莓根腐病藥劑防治效果不明顯。 本研究鑒定了茄腐鐮刀菌可引起草莓根腐病的發(fā)生,為丹東地區(qū)草莓根腐病防治提供有力依據(jù)。 茄腐鐮刀菌在西班牙被鑒定為引起草莓等幾種作物根腐病的病原菌[8～9],重慶地區(qū)茅蒼術(shù)根腐病的主要病原菌是茄腐鐮刀菌[10],茄腐鐮刀菌可以在土壤中長期存活從而增加病害侵染的風(fēng)險。 丹東地區(qū)草莓根腐病的主要致病菌是茄腐鐮刀菌,是否存在其他致病菌種類,還有待進(jìn)一步分離鑒定。 針對草莓根腐病病原菌茄腐鐮刀菌的高效防治藥劑篩選有待進(jìn)一步研究。 在草莓栽培過程中,要加強(qiáng)田間管理,合理調(diào)控溫濕度及土壤酸堿度,及時清理病株枯葉,病害高發(fā)期選用廣譜型藥劑做好預(yù)防工作。