余霞霞,曾語桐,楊佳宏,吳婧,徐燕,黃寅

(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院藥學(xué)部,南京 210009;2.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院,南京 210009)

B族維生素(Vitamin B,VB)是一類水溶性維生素,主要包括維生素B1(硫胺素)(B1)、維生素B2(核黃素)(B2)、維生素B3(煙酸)(B3)、維生素B5(泛酸)(B5)、維生素B6(吡哆醇)(B6)、維生素B9(葉酸)(B9)和維生素B1(鈷胺素)(B12)等,在改善認(rèn)知障礙、調(diào)節(jié)能量代謝、維持免疫功能及促進(jìn)生長發(fā)育等方面均發(fā)揮著重要作用[1-2]。由于人體無法自行合成或合成量很少,體內(nèi)的VB主要來源于飲食[3]。在營養(yǎng)不良、藥物干擾、吸收障礙等疾病狀態(tài)下,人體需要通過片劑、口服液、注射液等形式額外補(bǔ)充VB[4]。因此,精準(zhǔn)分析血液中VB的水平對研究人類生理病理學(xué)狀態(tài)具有重要意義。

目前,常用于測定VB含量的方法有生物酶法、放射免疫分析法、分光光度法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法以及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[5-8]。其中,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法具有選擇性高、檢測限低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[9],能夠同時分離分析多種VB,尤其適用于對低含量樣品的檢測。文獻(xiàn)中已經(jīng)報道了幾種利用LC-MS/MS技術(shù)檢測VB方法,但這些研究通常只測定單個或少數(shù)幾個B族維生素,且分析的樣品基質(zhì)較為簡單,如復(fù)合片、奶粉等[10-11]。有文獻(xiàn)報道LC-MS/MS法同時測定全血中的8種VB,但該方法分析時間長達(dá)20 min,且樣本前處理過程中采用硫酸鋅去除蛋白,可能對質(zhì)譜儀造成永久性傷害[12]。為此,本研究中我們建立并驗(yàn)證了一種新的、快速簡便的LC-MS/MS方法同時測定大鼠血漿中7種VB(圖1)的含量,應(yīng)用該方法研究了健康大鼠單次灌胃VB混合溶液后的藥動學(xué)行為。

圖1 7種B族維生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of seven B vitamins

1 儀器與試藥

1.1儀器 島津LC-MS/MS 8040液質(zhì)聯(lián)用儀(日本島津公司,配備CBM-20A系統(tǒng)控制器、CTO-20AC柱溫箱、MS-8040 Triple Quad分析器和Lab Solution工作站);Centrifuge 5430R低溫冷凍高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司);電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司,感量:0.01 mg);Bioprep-24勻漿機(jī)(杭州奧盛儀器有限公司);XW-80A渦旋混合器(上海青浦西儀器廠)。

1.2試藥 維生素B1(批號:G1531060,含量≥98.0%)、維生素B3(批號:C2218561,含量≥98.0%)、維生素B6(批號:H2219511,含量≥98.0%)、維生素B9(批號:F212618,含量≥98.0%)均購于上海Aladdin公司;維生素B2(購于美國Supelco公司,批號:LRAD1072,含量≥98.0%);維生素B5(購于上海麥克林公司,批號:C12552803,含量≥98.0%);維生素B12(批號:WXBD2315V,含量≥98.0%)和內(nèi)標(biāo)2,4,5,6-氘代煙酰胺(IS,批號:EF-191,含量≥98.6%)均購于美國Merck公司。甲醇(色譜純,Merck,德國),乙腈(色譜純,Merck,德國),甲酸(色譜純,ROE Scientific INC,美國),超純水自制(Millipore,美國)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX SB-Aq column(2.1 mm×150 mm,3.5 μm);流動相由0.01%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)組成,梯度洗脫:0～1.0 min:5% B;1.0～3.0 min:5%→10% B;3.0～9.0 min:10%→90% B;9.0～10.0 min:90% B;進(jìn)樣量為3.0 μL,2次進(jìn)樣之間平衡4.0 min;流速:0.3 mL·min-1;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣器溫度:4 ℃。

2.2質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(electric spray ion source,ESI);正離子多反應(yīng)選擇監(jiān)測(multi reaction selection monitoring,MRM)掃描方式采集數(shù)據(jù);電噴霧電壓4.5 kV;加熱塊溫度:400 ℃;脫溶劑管溫度:250 ℃;霧化氣(氮?dú)?速率:3 L·min-1;干燥氣(氮?dú)?速率:15 L·min-1。各待測物MRM參數(shù)、線性及范圍等信息見表1。

表1 7種B族維生素的MRM參數(shù)、線性范圍 Tab.1 MRM parameters,linearity and range of seven B vitamins

2.3溶液配制 精密稱取適量每種化合物溶解在合適溶劑中(維生素B1、維生素B3、維生素B5、維生素B6、維生素B12、2,4,5,6-氘代煙酰胺對照品溶于甲醇,維生素B2和維生素B9對照品溶于0.1 mol·L-1NaOH甲醇溶液)分別配制成濃度為1.0 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。儲備液配制均在紅光下操作,儲存于-20 ℃冰箱備用,臨用時用初始流動相稀釋至合適的濃度制備工作溶液。

2.4空白生物基質(zhì)制備 取正常大鼠血漿,按照1.5 mL：75 mg比例加入活性炭,置室溫下振蕩(12 000 r·min-1)吸附共48 h,24 h時更換1次活性炭,吸附結(jié)束后,14 000 r·min-1離心10 min,棄去活性炭,合并上清液,得空白介質(zhì)并置-80 ℃冰箱保存。

2.5血漿樣本前處理 取1.5 mL干凈離心管,精密加入內(nèi)標(biāo)工作液(5 μg·mL-1)10 μL,室溫解凍后的大鼠血漿50 μL,甲醇溶液200 μL,渦旋混勻3 min,4 ℃,14 000 r·min-1離心10 min,轉(zhuǎn)移上清液至干凈離心管中,4 ℃,14 000 r·min-1再次離心10 min,轉(zhuǎn)移80 μL上清液至液相小瓶用于LC-MS/MS檢測。

2.6選擇性實(shí)驗(yàn) 取6個不同來源的大鼠空白血漿,每個血漿樣本均分為2份,一份按“2.5節(jié)”處理且不加內(nèi)標(biāo),另一份先加入VB混合液10 μL制成定量下限(lower limit of quantitation,LLOQ)水平的質(zhì)控樣品,再按“2.5節(jié)”處理。結(jié)果表明,待分析物及內(nèi)標(biāo)的保留時間處的內(nèi)源性物質(zhì)響應(yīng)均未超過定量下限的10%和內(nèi)標(biāo)的5%(圖2),證明該方法的選擇性良好。

圖2 大鼠空白血漿和加樣血漿(最低檢測限)中7種B族維生素的提取離子流圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of seven B vitamins in blank and spiked (LLOQ) of rat plasma

2.7線性和范圍 分別精密吸取各儲備液適量,用初始流動相(0.01%甲酸水溶液：甲醇=95：5)稀釋制得系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。精密量取10 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液,按“2.5節(jié)”處理樣品后進(jìn)樣分析。以VB和內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo),各VB理論濃度為橫坐標(biāo),采用加權(quán)(1/C2)最小二乘法進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明(表1),所有VB均具有良好的線性關(guān)系(r2>0.992 2)且具有較寬的定量范圍。各VB的LLOQ為7.5～300 ng·mL-1,定量上限1 000～20 000 ng·mL-1。

2.8精密度和準(zhǔn)確度 精密吸取含7種VB的混合工作溶液10 μL制備LLOQ、低、中、高質(zhì)控樣品,在不同天制備3個分析批,進(jìn)樣分析后記錄各VB和內(nèi)標(biāo)的峰面積。根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度,得到批內(nèi)(5個重復(fù))和批間(3個分析批,各5個重復(fù))的精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果如表2所示,LLOQ樣品的準(zhǔn)確度偏差在±20.0%范圍及精密度RSD<20.0%,其他質(zhì)控水平的樣品滿足偏差在±15.0%范圍內(nèi)及精密度RSD<15.0%的要求。

表2 大鼠血漿中7種B族維生素的精密度和準(zhǔn)確度測定結(jié)果Tab.2 Determination results of precision and accuracy of seven B vitamins in rat plasma analyzed by LC-MS/MS %

2.9提取回收率 取大鼠正常血漿,按“2.5節(jié)”處理并加入含7種VB的混合工作溶液10 μL制備低、中、高質(zhì)控樣品,進(jìn)樣分析并記錄各VB或內(nèi)標(biāo)的峰面積(A)。另取空白血漿同法處理并記錄各VB或內(nèi)標(biāo)的峰面積(B),待測物和內(nèi)標(biāo)的提取回收率按A/B×100%計算。結(jié)果如表3所示,3個濃度水平質(zhì)控樣品中所有VB的提取回收率均>86.16%,內(nèi)標(biāo)的回收率均值為86.90%,RSD為1.45%～10.16%。結(jié)果表明,此前處理方法的回收率較高。

表3 大鼠血漿中7種B族維生素的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)測定結(jié)果Tab.3 Determination results of extraction recovery and matrix effect of seven B vitamins in rat plasma %

2.10基質(zhì)效應(yīng) 取6個不同來源的大鼠空白血漿,按“2.5節(jié)”處理并加入各待測VB的混合溶液10 μL制備低、高質(zhì)控樣品,進(jìn)樣分析后記錄各VB或內(nèi)標(biāo)的峰面積(C)。另取離心管不加血漿同法處理,記錄各VB或內(nèi)標(biāo)的峰面積(D),待測物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)按C/D×100%計算。結(jié)果如表3所示,維生素B5低、高兩個濃度水平QC樣品的基質(zhì)效應(yīng)分別為235.84%和240.54%,精密度<15%;除此之外,其他6種VB的基質(zhì)效應(yīng)為92.22%～114.30%,精密度為3.67%～14.63%;內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)均值為109.90%,精密度為3.44%。結(jié)果表明,維生素B5存在穩(wěn)定的基質(zhì)增強(qiáng),其他VB及內(nèi)標(biāo)沒有基質(zhì)效應(yīng)。

2.11穩(wěn)定性 按“2.5節(jié)”方法制備含待測VB低、高濃度水平的質(zhì)控樣品,用以考察室溫放置穩(wěn)定性(室溫,10 h)、自動進(jìn)樣器放置穩(wěn)定性(4 ℃,12 h)、反復(fù)凍融穩(wěn)定性(-80 ℃,3次)、長期凍存穩(wěn)定性(-80 ℃,30 d)。2個濃度水平在每種條件下各進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),將各樣本中VB的濃度與新處理分析的樣本中VB的濃度進(jìn)行比較。結(jié)果表明,7種VB在上述四種情況下均穩(wěn)定。

2.12藥動學(xué)研究 3只雄性SD大鼠在恒溫恒濕動物房適應(yīng)1周后,于給藥前12 h禁食但允許自由飲水。參考已上市的復(fù)合VB膳食補(bǔ)充劑的劑量,灌胃給予大鼠混合VB溶液,其中含維生素B1為70 mg·kg-1、維生素B2為10 mg·kg-1、維生素B3為10 mg·kg-1、維生素B5為20 mg·kg-1、維生素B6為20 mg·kg-1、維生素B9為10 mg·kg-1、維生素B12為20 mg·kg-1。分別于給藥前(0)及給藥后0.167、0.5、1、2、3、4、6和8 h,從大鼠眼眶靜脈叢采集約110 μL血液收集于含肝素的離心管中,立刻離心分離血漿(4 ℃,8 000 r·min-1,15 min),保存在-80 ℃冰箱。血漿樣本經(jīng)處理后進(jìn)樣分析,測定各時間點(diǎn)VB血藥濃度,繪制平均藥-時曲線。從圖3可知,給藥前通過禁食12 h可以降低大鼠血液中VB的含量至LLOQ以下;給藥后維生素B1、維生素B2、維生素B5、維生素B6和維生素B9的血藥濃度較高,在所有給藥后的樣本中均能被定量檢測,且Cmax未超出檢測上限,所得藥動學(xué)曲線較完整;相比之下,維生素B3、維生素B12血藥濃度較低,給藥1 h或3 h后就無法被檢出。此外,除B5外,其他VB的Tmax均在0.5 h左右。結(jié)果表明,該檢測方法能對真實(shí)樣本中的VB進(jìn)行同時測定。

圖3 健康大鼠單次灌胃B族維生素混合溶液后的藥物濃度-時間曲線圖Fig.3 Concentration-time curves of B vitumins in healthy rats after single intragastric administration of their mixed solution

3 討論

本研究建立了一種快速、準(zhǔn)確的LC-MS/MS方法同時測定大鼠血漿中7種VB的含量。與已報道的方法相比,本方法具有以下優(yōu)點(diǎn):①分析時間短、通量高。已報道的采用LC-MS/MS法測定生物樣本中VB的方法較為罕見,其分析時間均在20 min以上[9,12];本研究通過優(yōu)化色譜條件將分析時間縮短至14 min,1 d之內(nèi)可以分析約100個樣本,分析通量提高約30%。②線性范圍寬,各VB的濃度范圍跨越數(shù)量級3～4個,可以滿足不同濃度樣本的分析需求。③樣品前處理簡單,與固相萃取[13]、衍生化法[14]等方法相比,本文采用甲醇沉淀蛋白法更為簡便快捷,提取回收率良好,且重現(xiàn)性高。

但是,本方法仍具有一定的局限性。首先,維生素B5存在基質(zhì)增強(qiáng),本研究嘗試過甲醇、乙腈、乙酸乙酯等不同沉淀試劑、不同濃度的甲酸、醋酸銨等流動相添加劑以及更換色譜柱和調(diào)節(jié)梯度洗脫程序,均未能消除其基質(zhì)效應(yīng);還試過用正丁醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷等有機(jī)試劑進(jìn)行液液萃取,結(jié)果顯示只有乙酸乙酯能消除維生素B5的基質(zhì)效應(yīng),但其提取回收率太低(低于20%),這可能是由于水溶性的VB在乙酸乙酯中溶解度較差;因此,該問題的解決方案仍有待繼續(xù)研究。其次,維生素B3和維生素B12存在血藥濃度過低而難以檢測的問題,可考慮采用磁性微納米材料[15]進(jìn)行富集,以提供更好的LLOQ。此外,本研究只測定了7種原型VB,將來可考慮增加各VB在體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物進(jìn)行同時分析。

綜上所述,本研究建立的LC-MS/MS方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、快捷穩(wěn)定,為研究體內(nèi)VB含量變化提供了可靠的分析工具。