莊煒平,胡芹,姜宏梁 ,黃建耿,武棟成

(1.武漢生物技術(shù)研究院,武漢 430073;2.武漢宏韌生物醫(yī)藥股份有限公司,武漢 430073;3.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,武漢 430030;4.武漢漢密頓生物科技股份有限公司,武漢 430073)

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一種存在于多種人體組織中具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞,其來源廣泛,可在骨髓、脂肪、臍帶血和胎盤中分離得到,并被廣泛應(yīng)用于細胞治療和器官移植等方面,在治療移植物抗宿主病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和軟骨及心肌損傷方面都有很好的療效[1-4]。雖然MSC具有低免疫原性的特點,但其作為治療藥物能否引起免疫原性還值得我們進一步去探索。

藥物的免疫原性是指藥物誘發(fā)對自身或相關(guān)蛋白的免疫應(yīng)答或免疫相關(guān)事件的能力。免疫原性影響廣泛,可能會影響藥物的藥動學(xué)特征、藥效學(xué)、安全性和有效性,更嚴重的時候還會產(chǎn)生嚴重的副作用甚至危及生命[5-6]。鑒于此,生物藥的研發(fā)過程中,中國、美國和歐盟等相關(guān)法規(guī)均要求在臨床前和臨床研發(fā)階段開展免疫原性的檢測和評估。

對于蛋白類藥物,如抗體、融合蛋白、多肽和ADC藥物等,免疫原性的檢測可以用配體結(jié)合試驗的方法,通過電化學(xué)發(fā)光技術(shù)(meso scale discovery,MSD)、酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunospecific assay,ELISA)、放射免疫分析(radio immunoassay,RIA)等平臺進行檢測[7-8];對于基因編輯的基因治療產(chǎn)品,如AAV載體,CAR-T細胞等,也可以同樣用配體結(jié)合試驗來檢測引入的外源蛋白的免疫原性[9-11]。然而,MSC藥物的免疫原性檢測一直是一個挑戰(zhàn):首先,經(jīng)典的配體結(jié)合試驗并不適用于細胞的檢測;其次,與CAR-T細胞不同,MSC本身也并未引入外源基因,因而也不能通過檢測表達的外源蛋白的免疫原性來評估MSC藥物的免疫原性。

目前,現(xiàn)有技術(shù)中,對于MSC免疫原性評估均是通過間接的方法評估整個免疫系統(tǒng)的反應(yīng),比如通過免疫分型檢測T/B/NK細胞的比例,或者通過檢測細胞因子、趨化因子、黏附因子等生物標志物的水平來反應(yīng)免疫系統(tǒng)的激活狀態(tài)等[12-15]。這些方法都是通過其他指標側(cè)面反映MSC是否刺激機體產(chǎn)生了免疫原性,并不能直接檢測到抗MSC的抗體水平。本文旨在建立一種可快速準確且直接檢測抗MSC抗藥抗體的方法,可用于臨床前和臨床MSC免疫原性的研究。

1 儀器、試劑耗材與動物

1.1主要儀器 流式細胞儀(BD FACS CanoII,美國BD公司),微孔板振蕩器(88880024,Thermo fisher),渦旋混合儀(MX-S,Dragon LAB),純水儀(Master-S15UV,HHitech),細胞計數(shù)儀(LUNA-II,logosbio),二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma 311,Thermo fisher)。

1.2試劑耗材 Anti-CD44 antibody(Sino Biological,批號:HB06AP2601-B,濃度1.00 mg·mL-1);Protein L-PE(Sino Biological,貨號:11044-H07E-P,批號:HR16JA1001,濃度0.1 mg·mL-1);1×PBS緩沖液(Gibco,規(guī)格/貨號:C10010500BT/500 mL);人臍帶MSC(武漢漢密頓生物科技股份有限公司,批號:UC0046)。水為去離子水;96孔稀釋板(NUNC,貨號:267245)。

1.3動物 食蟹猴,普通級,30只,雌雄各半,動物年齡為3～5歲,體質(zhì)量2.4～5.0 kg。動物來源于永?？h康順生物科技有限公司。實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(桂)2018-0006。實驗動物使用許可證號:SYXK(鄂)2021-0090。實驗動物質(zhì)量合格證:No.0005086和No.0005088。動物管理、使用和相關(guān)操作均經(jīng)過湖北天勤生物科技有限公司武漢分公司實驗動物管理和使用委員會(IACUC)審核與批準(SOP編號:SOP/IAC/002/03),批準文號:IACUC(準)-2022-140。

2 方法

2.1樣品孵育 取約每孔1.2×105個人臍帶MSC懸液于96孔板中,300 ×g離心5 min,棄上清液,之后每孔加入PBS 200 μL洗滌細胞,300×g離心5 min,棄上清液;于96孔板中加入使用PBS溶液1：10稀釋后的陽性質(zhì)控(anti-CD44 antibody)或待測樣品溶液,貼好封板膜后置于微孔板振蕩器上350 r·min-1室溫孵育30 min。然后,于96孔板中每孔加入PBS 200 μL洗滌細胞,300×g離心5 min,棄上清液,重復(fù)該步驟3次后于96孔板中每孔加入Protein L-PE溶液(使用前用PBS溶液進行10倍稀釋)100 μL,貼好封板膜后置于微孔板振蕩器上350 r·min-1,室溫避光孵育15 min。最后,于96孔板中每孔加入PBS 200 μL洗滌細胞,300×g離心5 min,棄上清液,重復(fù)該步驟3次。

2.2流式檢測方法 將“2.1節(jié)”步驟中的細胞每孔加入1×PBS 200 μL重懸細胞,采用流式細胞儀高通量的進樣方法進行上樣,檢測PE熒光信號,PE通道電壓設(shè)為250 V,FSL通道電壓設(shè)為100 V,SSC通道電壓設(shè)為320 V,收集細胞數(shù)量為10 000個。

2.3人臍帶MSC在食蟹猴體內(nèi)免疫原性研究 30只食蟹猴按體質(zhì)量分層隨機分為3組,每組10只,雌雄各半,分別為空白對照組(氯化鈉注射液組)及人臍帶MSC小劑量組(細胞2.4～2.5×106個·kg-1)和大劑量組(細胞4.8～5.0×106個·kg-1)。分別于第1天、第8天和第15天,通過膝關(guān)節(jié)腔注射每周給藥1次,共給藥3次,首次給藥日為試驗第一天。樣品采集:其中第1天、第8天和第15天對各組所有動物分別進行1次血樣采集;第22天、第29天、第36天和第43天對各組4只動物分別進行1次血樣采集,收集全血至含促凝劑和分離膠的采血管中,待血液凝結(jié)后室溫離心,1 800×g,離心10 min。收集血清,放置于-80 ℃超低溫冰箱保存待測。

3 結(jié)果

3.1專屬性 使用鼠抗人的Anti-CD44 antibody作為陽性對照,使用空白混合食蟹猴血清配制低濃度質(zhì)控(100.00 ng·mL-1)、中濃度質(zhì)控(500.00 ng·mL-1)和高濃度質(zhì)控(5 000.00 ng·mL-1)的樣品與空白血清一起按“2.1節(jié)”樣品孵育步驟進行孵育,之后按“2.2節(jié)”流式細胞術(shù)進行上機檢測,收集細胞10 000個后統(tǒng)計平均的PE熒光強度,見圖1,其中空白血清平均熒光強度為55,低濃度質(zhì)控平均熒光強度為160,中濃度質(zhì)控平均熒光強度為632,高濃度質(zhì)控平均熒光強度為5 229,結(jié)果表明不同質(zhì)控濃度的樣品平均熒光強度區(qū)分明顯。

圖1 空白血清、低濃度質(zhì)控、中濃度質(zhì)控和高濃度質(zhì)控流式分析圖Fig.1 Flow chromatograms of blank serum,low,middle and high concentration quality control samples

3.2篩選臨界值和滴度臨界值 對于非臨床研究,臨界值的建立應(yīng)選擇至少15個空白個體基質(zhì)由至少2位分析員在至少3 d進行的3個分析批的響應(yīng)值進行統(tǒng)計分析獲得。在本研究中篩選臨界值和滴度臨界值的建立是通過對30個給藥前食蟹猴空白血清,由3位實驗人員重復(fù)測定2次,產(chǎn)生的180個檢測信號值進行計算。首先對產(chǎn)生的每個個體的信號與該個體所在分析批的平均空白血清信號進行S/N和Log10(S/N)歸一化處理。然后采用箱式圖法進行離群值的排除。之后運用JMP 軟件進行正態(tài)分布判斷,S/N和Log10(S/N)數(shù)據(jù)均為非正態(tài)分布。篩選臨界值因子(PSCPF)則基于統(tǒng)計學(xué)的單側(cè)上限99%的百分位數(shù),通過Excel中的Percentile公式進行計算為2.76,滴度臨界值因子(TCPF)則基于統(tǒng)計學(xué)的單側(cè)上限99.9%的百分位數(shù),計算為2.85。PSCPF和TCPF將用于后續(xù)樣品分析批中篩選臨界值(PSCP)和滴度臨界值(TCP)的計算,其公式分別為:PSCP=PSCPF×空白血清信號值,TCP=TCPF×空白血清信號值。樣品篩選分析中,信號值高于PSCP 的樣品將被判定為陽性。滴度分析中,陽性樣品將被進行梯度稀釋,稀釋至信號值剛好高于或等于TCP的稀釋倍數(shù)將被定義為樣品的滴度。

3.3分析靈敏度和LPC(低濃度質(zhì)控)濃度定值 分析靈敏度和LPC濃度定值則通過3位實驗人員在3 d內(nèi)分析12套滴度稀釋樣品獲得,每套滴度稀釋樣品是HPC(高濃度質(zhì)控)經(jīng)過系列稀釋依次得到,濃度分別為5 000.00、500.00、250.00、62.50、31.25、15.63 ng·mL-1。該實驗中共12條滴度稀釋曲線符合要求,每條稀釋曲線采用兩點直線回歸模型來擬合,通過篩選臨界值計算對應(yīng)的抗體濃度,計算公式:(高于PSCP濃度-低于PSCP濃度)×(PSCP-低于PSCP信號值)/(高于PSCP信號值-低于PSCP信號值)+低于PSCP濃度。本實驗共計算產(chǎn)生12個濃度,臨界值對應(yīng)的平均濃度值為88.50 ng·mL-1,臨界值對應(yīng)濃度的標準偏差為15.055。分析靈敏度將由PSCP對應(yīng)滴度曲線中抗體濃度的95%置信區(qū)間確定,計算公式為分析靈敏度=臨界值對應(yīng)的平均濃度+t0.05×臨界值對應(yīng)濃度的標準偏差,其中t0.05由T分布數(shù)確定,t0.05=1.796,為95%置信區(qū)間對應(yīng)的常數(shù)[n=12 和df(n-1)=11],df為用于計算的樣品的自由度。通過計算得分析靈敏度為115.54 ng·mL-1,滿足指導(dǎo)原則要求的非臨床試驗靈敏度一般需達到250～500 ng·mL-1的要求。根據(jù)1.0%分析批失敗率,LPC的濃度通過以下公式計算:LPC濃度=臨界值對應(yīng)的平均抗體濃度+t0.01×臨界值對應(yīng)濃度的標準偏差,t0.01=2.718,為99%置信區(qū)間對應(yīng)的常數(shù)[n=12 和df(n-1)=11],計算得LPC濃度為129.42 ng·mL-1,為配制方便,精密度考察中將按照130.00 ng·mL-1配制。

3.4精密度實驗 使用混合食蟹猴血清配制3個質(zhì)控HPC(高濃度質(zhì)控),MPC(中濃度質(zhì)控)和LPC(低濃度質(zhì)控),配制濃度分別為5 000.00、500.00和130.00 ng·mL-1,每個濃度5套,配好后分裝凍存在-80 ℃冰箱至少12 h。之后由3位實驗人員分別在3 d進行了6次測定,計算批內(nèi)和批間精密度,見表1。

表1 猴血清中抗MSC抗體測定方法的精密度Tab.1 Precision of method for anti-mesenchymal stem cell antibody in monkey serum

3.5稀釋線性和勾狀效應(yīng) 制備高濃度的質(zhì)控樣品50 000.00 ng·mL-1,然后系列稀釋得到10 000.00、2 000.00、400.00和80.00 ng·mL-1濃度的樣品。樣品測試結(jié)果:高于HPC濃度的樣品響應(yīng)值為13 776.0,高于HPC所對應(yīng)的響應(yīng)值5 120.0,無鉤狀效應(yīng)。

3.6選擇性 選擇性測試了正常基質(zhì)、溶血基質(zhì)和高脂基質(zhì)的影響。分別使用10個空白食蟹猴血清、5個2%溶血血清和5個3.00 mg·dL-1的高脂血清配制LPC 濃度的樣品和空白樣品同時進行測定。檢測結(jié)果顯示添加陽性對照抗體的樣品測試結(jié)果均為陽性,未添加陽性對照抗體的空白樣品測試結(jié)果均為陰性,溶血和高脂并不對方法產(chǎn)生影響。

3.7短期穩(wěn)定性 考察樣品為HPC和LPC,分別進行了凍融穩(wěn)定性、室溫穩(wěn)定性和冷藏穩(wěn)定性考察。凍融穩(wěn)定性:樣品在-60～-90 ℃條件下首次冷凍至少24 h,之后的每次冷凍時間至少12 h,室溫條件下融解,反復(fù)凍融6次后,檢測結(jié)果穩(wěn)定。室溫穩(wěn)定性:樣品在室溫放置至少27 h后測試結(jié)果穩(wěn)定。冷藏穩(wěn)定性:樣品在在2～8 ℃條件下放置至少47 h結(jié)果可接受。

3.8免疫原性研究 對30只食蟹猴,共計138個樣本使用上述驗證的方法進行樣品的篩選分析,篩選分析為陽性的樣本進行滴度檢測。結(jié)果見圖2,空白對照組動物所有采血點篩選分析信號值并沒有隨著采樣時間的增加而增加,且低于篩選分析臨界值,因此篩選分析均為陰性,未檢測到抗藥抗體;小劑量組和大劑量組,從給藥后第15天開始篩選分析檢測到的信號值大幅度增加,高于篩選分析臨界值,篩選分析為陽性,可檢測到抗藥抗體產(chǎn)生。之后對篩選分析為陽性的樣本進行滴度分析,小劑量組滴度值在20～1 000,大劑量組滴度值高于低劑量組,在40～4 000內(nèi),且小劑量組和大劑量組中均呈現(xiàn)了隨著采樣時間的增加滴度值也增加的現(xiàn)象。實驗結(jié)果證實,人臍帶MSC食蟹猴骨關(guān)節(jié)腔注射后可誘導(dǎo)食蟹猴體內(nèi)產(chǎn)生抗人臍帶MSC抗體,且與人臍帶間充質(zhì)細胞劑量呈正相關(guān)。

圖2 空白對照組、小劑量組和大劑量組篩選分析信號值Fig.2 Signal values of screening analysis for blank control group,low dose group and high dose group

4 討論

本文建立的流式細胞法檢測抗MSC抗體,能夠特異、靈敏、快速且準確地測定食蟹猴血清中產(chǎn)生的抗藥抗體。與傳統(tǒng)的通過評價免疫分型T/B/NK細胞的比例,或者檢測細胞因子、趨化因子、黏附因子等生物標志物的水平變化來反映免疫系統(tǒng)的激活狀態(tài),從而間接評價MSC免疫原性相比[12-15],該方法能夠更直接地檢測到抗藥抗體,闡明其產(chǎn)生時間、濃度水平以及持續(xù)時間,從而更直觀地反映產(chǎn)生的抗藥抗體對動物的毒性反應(yīng)。

文獻[16-17]報道,采用流式細胞法檢測猴血清中抗MSC抗體,其原理是將樣品與MSC孵育后,加入生物素標記的鼠抗猴IgG抗體的二抗,之后加入FITC標記的鏈霉素,最后上流式檢測FITC 的熒光信號。由于FITC屬于弱熒光,因此該方法靈敏度較低。由于二抗的特殊性,該方法只能檢測產(chǎn)生的IgG抗體,且往往因缺少合適的陽性對照抗體而難以遵循藥物免疫原性研究技術(shù)指導(dǎo)原則進行方法學(xué)的驗證[18-19],從而存在技術(shù)風(fēng)險。本研究對基于流式細胞法檢測抗MSC抗體進行改進。首先,基于MSC CD105、CD166、CD29和CD44陽性的共同特征[20],選取了鼠抗人CD44的抗體作為該實驗的陽性對照抗體。在二抗的選擇中,采用了PE 標記的Protein L 作為檢測試劑,PE作為較亮的熒光標記,可以顯著提高方法的靈敏度,同時Protein L與鼠和人源化的IgG、IgM、IgA、IgD和IgE 均能夠結(jié)合[21],從而實現(xiàn)了對不同型抗MSC抗體的檢測。本研究遵循藥物免疫原性研究技術(shù)指導(dǎo)原則進行了方法學(xué)的驗證。驗證中建立了篩選分析臨界值和滴度臨界值,由于方法的特殊性,本實驗并未進行確證實驗,因為未建立確證臨界值,對統(tǒng)計方法進行了改進,未使用指導(dǎo)原則推薦的5%的假陽性率,而是采用更嚴格的1%的假陽性率進行分析臨界值的計算,從而去減少假陽性的產(chǎn)生。相較于傳統(tǒng)的蛋白類藥物免疫原性的驗證,本研究基于實際情況也未進行藥物耐受的考察。其MSC與傳統(tǒng)藥物相比不同,其不會殘留于血清中,因此不存在藥物干擾的影響。

通過對食蟹猴血清給藥前和給藥后的血清進行檢測發(fā)現(xiàn),空白對照組信號值均低于篩選分析臨界值,未產(chǎn)生抗藥抗體,而小劑量組和大劑量組均在第15天產(chǎn)生了較高的熒光信號值,隨著采樣時間增加,熒光信號值也增加,且大劑量組的熒光信號值高于小劑量組,符合抗藥抗體產(chǎn)生的規(guī)律,也直接證明該方法可成功用于檢測食蟹猴體內(nèi)產(chǎn)生的抗藥抗體,解決通過傳統(tǒng)間接法檢測MSC免疫原性的局限性。筆者將基質(zhì)換成人血清后,進行了方法學(xué)的測試,其方法的性能與食蟹猴血清無明顯區(qū)別。因此該方法未來可進一步驗證并用于人體臨床中MSC免疫原性的研究。