陳明,王姍姍,喬戈,李苗

(武漢藥品醫(yī)療器械檢驗所,國家藥品監(jiān)督管理局藥物制劑質(zhì)量研究與控制重點實驗室,武漢 430073)

膦甲酸鈉為廣譜非核苷類抗病毒藥,可非競爭性抑制HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶和乙型肝炎類病毒DNA多聚酶,臨床用于敏感病毒所致的皮膚感染、黏膜感染、也可用于HIV感染者。膦甲酸鈉是美國食品藥品管理局最早期批準用于臨床治療艾滋病的16種藥物之一[1-2],其制劑劑型主要包括膦甲酸鈉氯化鈉注射液、膦甲酸鈉注射液、膦甲酸鈉乳膏和膦甲酸鈉滴眼液。HIV是嚴重危害人類身體健康的病原體,也是全球最受關(guān)注的公共衛(wèi)生問題之一[3-8]。通過全球醫(yī)藥工作者持續(xù)不斷的努力,現(xiàn)已有多種有效的新藥和復(fù)方制劑用于治療艾滋病。艾滋病正逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N可控的慢性傳染性疾病[9-14]。

膦甲酸鈉現(xiàn)行國家標準WS1-(X-187)-2004Z[15]和YBH07772006[16]均未控制有關(guān)物質(zhì)。李苗等[17]采用離子色譜法測定膦甲酸鈉氯化鈉注射液中磷酸鹽和亞磷酸鹽,冮海峰等[18]采用HPLC法測定膦甲酸鈉氯化鈉注射液中磷酸鹽和亞磷酸鹽,國內(nèi)幾乎沒有對膦甲酸鈉原料藥有關(guān)物質(zhì)的相關(guān)研究報道。

膦甲酸鈉質(zhì)量標準《中華人民共和國藥典》2020年版未收載。EP11.0[19]和USP43-NF38[20]均有收載,EP11.0與USP43-NF38膦甲酸鈉項下均采用GC法控制雜質(zhì)Ⅱ,HPLC法控制雜質(zhì)Ⅰ及其他雜質(zhì)。為優(yōu)化膦甲酸鈉雜質(zhì)分析方法,本研究采用HPLC法同時控制雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ及其他雜質(zhì),簡化了分析方法,提高膦甲酸鈉的雜質(zhì)分析效率,降低藥品檢驗成本。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(美國AGILENT公司),XS105電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司,感量:0.01 mg)。

1.2試藥 膦甲酸鈉對照品(含CNa3O5P 64.3%,購自中國食品藥品檢定研究院,批號:100943-201001);雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌?武漢大安制藥,批號:201705002),雜質(zhì)Ⅰ對照品(武漢大安制藥批號:1.2),膦甲酸鈉原料(濟南金達藥化有限公司,批號:JD-BP-29-20170704、JD-BP-29-20180902、JD-BP-29-20180905);冰醋酸、焦磷酸鈉、無水硫酸鈉及四己基硫酸氫銨,均為市售分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱:用資生堂CAPCELL PAK C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相[取無水硫酸鈉1.42 g,加冰醋酸3 mL與0.1 mol·L-1焦磷酸鈉溶液6 mL,加水1 000 mL使溶解,作為溶液A;取無水硫酸鈉1.42 g,加無水醋酸鈉4.2 g與0.1 mol·L-1焦磷酸鈉溶液6 mL,加水1 000 mL使溶解,作為溶液B;取溶液A-溶液B(70：30)混合溶液(pH值約為4.4)1 000 mL,加四己基硫酸氫銨0.25 g,振搖使溶解,加甲醇100 mL,搖勻];流速:1.0 mL·min-1;柱溫:35 ℃;檢測波長:230 nm;進樣體積:50 μL。

2.2溶液的配制

2.2.1供試品溶液 取本品0.24 g,精密稱量,置10 mL量瓶中,加冰醋酸0.5 mL潤濕,加流動相適量,振搖使溶解,用流動相稀釋至刻度,搖勻。

2.2.2對照溶液 精密量取供試品溶液適量,用流動相稀釋制成每毫升約含膦甲酸鈉48 μg的溶液。

2.2.3系統(tǒng)適用性溶液 取雜質(zhì)Ⅰ對照品與雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌犯鬟m量,用流動相溶解并稀釋制成每1 mL中分別含雜質(zhì)Ⅰ0.48 mg與雜質(zhì)Ⅱ0.24 mg的溶液,作為雜質(zhì)對照品儲備液;取本品0.24 g,置10 mL量瓶中,加冰醋酸0.5 mL,振搖,加雜質(zhì)對照品儲備液1 mL,用流動相溶解并稀釋至刻度,搖勻。

2.2.4靈敏度溶液 精密量取對照溶液適量,用流動相稀釋制成每毫升約含膦甲酸鈉7.2 μg的溶液。

2.3方法學(xué)驗證

2.3.1系統(tǒng)適用性實驗和專屬性實驗

(1)系統(tǒng)適用性實驗 取流動相作為空白溶劑。系統(tǒng)適用性溶液、空白溶劑及樣品溶液色譜圖見圖1?？梢?系統(tǒng)適用性溶液色譜圖中雜質(zhì)Ⅰ峰與雜質(zhì)Ⅱ峰均能與膦甲酸鈉峰完全分開,而空白溶劑在相應(yīng)保留時間上沒有色譜峰出現(xiàn)。

A.空白溶液;B.系統(tǒng)適用性溶液;C.樣品溶液;1.膦甲酸鈉;2.雜質(zhì)Ⅰ;3.雜質(zhì)Ⅱ。圖1 系統(tǒng)適用性實驗的HPLC圖譜 A.blank solution;B.system suitability solution;C.sample solution;1.foscarnet sodium;2.impurityⅠ;3.impurityⅡ.Fig 1 HPLC chromatograms for system suitability test

(2)專屬性實驗 取“2.2.1節(jié)”下的供試品溶液,分為5份,每份分別量取1 mL,①加入1 mol·L-1鹽酸溶液0.1 mL,放置1 h,用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液中和,用流動相稀釋至刻度;②加入1 mol·L-1氫氧化鈉溶液0.1 mL,放置1 h,用1 mol·L-1鹽酸溶液中和,用流動相稀釋至刻度;③加入10%過氧化氫溶液0.1 mL,放置1 h,用流動相稀釋至刻度;④取供試品溶液,在日光下光照24 h;⑤取供試品溶液,100 ℃水浴下加熱30 min。對5份溶液進行測定,色譜圖見圖2,降解產(chǎn)物與膦甲酸鈉的分離度均符合要求。

D.酸破壞樣品;E.堿破壞樣品;F.氧化破壞樣品;G.光破壞樣品;H.高溫破壞樣品;1.膦甲酸鈉。圖2 專屬性實驗的HPLC圖譜D.sample treated with acid;E.sample treated with alkali;F.sample treated with oxidation;G.sample treated with UV light;H.sample treated with high temperature;1.foscarnet sodium.Fig 2 HPLC chromatograms of specificity test

2.3.2線性關(guān)系考察 精密稱取膦甲酸鈉對照品12 mg,置50 mL量瓶中,用流動相溶解并稀釋至刻度,搖勻。分別精密量取適量,加流動相稀釋制成每毫升分別約含5、25、50、124、248 μg的溶液,照本研究的色譜方法測定,以濃度(C)為橫坐標,峰面積(A)為縱坐標進行線性回歸,回歸方程為:A=1.8C+9.8×10-4,r=0.999 9;線性范圍為5～248 μg·mL-1。精密稱取雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌?用流動相制成每毫升含雜質(zhì)Ⅱ分別1.6、3.2、4.5、6.8、9.1 μg的溶液,照本研究的色譜方法測定,以濃度(C)為橫坐標,峰面積(A)為縱坐標進行線性回歸,回歸方程為:A=2.5×103C+3.2×102,r=0.999 9;線性范圍為1.6～9.1 μg·mL-1。

2.3.3精密度試驗 取“2.2.2節(jié)”下的對照溶液,精密量取50 μL注入液相色譜儀,連續(xù)進樣6次,膦甲酸鈉主峰的保留時間與峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為0.0%和1.1%。精密量取濃度為2.4 μg·mL-1雜質(zhì)Ⅱ溶液50 μL注入液相色譜儀,連續(xù)進樣6次,雜質(zhì)Ⅱ峰的保留時間與峰面積的RSD分別為0.0%和0.8%。

2.3.4檢出限 按本研究色譜方法測定,膦甲酸鈉和雜質(zhì)Ⅱ的檢出限分別為23 ng和62 ng(S/N=3)。

2.3.5加樣回收率實驗 精密稱取已測定有關(guān)物質(zhì)的供試品0.24 g,共12份,分為3組,置于10 mL量瓶中,分別制備含雜質(zhì)Ⅱ為0.05%、0.15%的溶液各3份,含雜質(zhì)Ⅰ0.2%與雜質(zhì)Ⅱ0.1%的溶液6份。結(jié)果表明該方法雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ回收率良好,見表1。

表1 雜質(zhì)Ⅰ加樣回收率實驗結(jié)果Tab.1 Results of recovery test of impurity Ⅰ n=6

2.3.6溶液穩(wěn)定性試驗 取“2.2.1節(jié)”下的供試品溶液和“2.2.3節(jié)”下的系統(tǒng)適用性溶液,進行溶液的穩(wěn)定性考察。室溫下放置0、2、4、8、12和24 h后分別進樣50 μL,記錄色譜圖,其中供試品溶液在24 h內(nèi)均未檢出雜質(zhì)峰;系統(tǒng)適用性溶液在24 h內(nèi)均可檢出雜質(zhì)Ⅰ和雜質(zhì)Ⅱ,但峰面積有減小趨勢,見表2,表3,因此采取本研究方法測定膦甲酸鈉有關(guān)物質(zhì)時各樣品溶液應(yīng)臨用新制。

表2 雜質(zhì)Ⅱ加樣回收率實驗結(jié)果Tab.2 Results of recovery test of impurity Ⅱ n=12

表3 系統(tǒng)適用性溶液穩(wěn)定性實驗結(jié)果Tab.3 Results of stability test of system suitability solution

2.3.7樣品的測定 按“2.2.1節(jié)”下方法制備供試品溶液進行測定,3批樣品均未檢出雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ及其他雜質(zhì)。

3 討論

USP43-NF38和EP11.0膦甲酸鈉項下均為HPLC法控制雜質(zhì)Ⅰ及其他雜質(zhì),GC法控制雜質(zhì)Ⅱ,HPLC法供試品溶液均以流動相作溶劑制備含膦甲酸鈉2.4 mg·mL-1的溶液。本研究發(fā)現(xiàn),膦甲酸鈉雜質(zhì)Ⅱ結(jié)構(gòu)中含有多個酯鍵,在堿性條件下容易降解,照USP43-NF38及EP11.0制備供試品溶液時,由于膦甲酸鈉濃度較高使供試品溶液呈堿性,其中雜質(zhì)Ⅱ會快速降解,配制后立即進樣與放置36 min后分別測定,可以檢測到雜質(zhì)Ⅱ峰面積快速變小。本研究對USP43-NF38及EP11.0方法進行優(yōu)化,將供試品溶液與系統(tǒng)適用性溶液的制備過程調(diào)整為:取膦甲酸鈉先加少量冰醋酸濕潤,再加流動相振搖數(shù)分鐘即可完全溶解,既可縮短供試品溶液的制備時間,又可調(diào)節(jié)溶液的pH值至弱酸性,防止雜質(zhì)Ⅱ的快速降解,可得到較穩(wěn)定的供試品溶液和系統(tǒng)適用性溶液。

有關(guān)物質(zhì)是藥品質(zhì)量研究中關(guān)鍵性的項目之一,現(xiàn)已成為藥品質(zhì)量標準中不可或缺的一項[21-22]。本研究通過優(yōu)化USP43-NF38及EP11.0膦甲酸鈉項下有關(guān)物質(zhì)檢查的色譜方法,建立了HPLC法測定膦甲酸鈉有關(guān)物質(zhì),同時控制雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ及其他雜質(zhì),并進行了方法學(xué)驗證,該方法操作簡便,專屬性好,結(jié)果準確,有利于提高膦甲酸鈉的雜質(zhì)分析效率,實現(xiàn)藥品檢驗經(jīng)濟學(xué)的目標。