摘 要： 高溫抑制蘋果花青苷合成，從而影響果實(shí)的著色。本研究發(fā)現(xiàn)高溫條件下，MdMYB308 基因的表達(dá)被強(qiáng)烈誘導(dǎo)。通過亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MdMYB308 定位在細(xì)胞核中。為了研究MdMYB308 的功能，我們利用過表達(dá)和CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)對其進(jìn)行了探究。結(jié)果顯示，MdMYB308 抑制了蘋果花青苷結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)和花青苷合成，MdMYB308 在高溫抑制蘋果花青苷合成中起到了重要的作用，在耐高溫紅色蘋果育種中具有重要的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞： 蘋果；高溫；花青苷；MdMYB308

中圖法分類號： S661.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-2324（2024）06-0867-07色澤是蘋果的重要感官品質(zhì)，尤其是那些鮮艷的紅色果實(shí)，一直以來都深受消費(fèi)者的喜愛。然而，全球變暖，持續(xù)的高溫對紅色蘋果著色造成了很大影響［1］。因此，提升高溫環(huán)境下紅色蘋果品種的著色能力，對于應(yīng)對全球變暖背景下蘋果著色難題具有至關(guān)重要的意義。

花青苷是蘋果果實(shí)呈現(xiàn)紅色的主要色素成分，其生物合成涉及到多個調(diào)控基因的復(fù)雜互作［2］。研究發(fā)現(xiàn)，MYB、bHLH、WD40 家族轉(zhuǎn)錄因子通過形成一個保守的M-B-W 三元復(fù)合體，共同參與調(diào)控植物體內(nèi)花青苷的合成［3］。R2R3-MYB家族基因被認(rèn)為是目前研究最為深入的花青苷調(diào)控基因［4］。在蘋果中，MdMYB1 負(fù)責(zé)調(diào)控蘋果果皮中花青苷的合成［5］，而MdMYB10 基因控制紅肉蘋果花青苷生物合成［6］。

最近研究發(fā)現(xiàn)，高溫環(huán)境可以通過調(diào)控R2R3-MYB家族基因的表達(dá)抑制花青苷的合成。例如，在菊花中，高溫誘導(dǎo)了CmMYB012 基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制了CmCHS、CmDFR、CmANS 和CmUFGT 基因的表達(dá)，減少了花青苷的合成［7］。在馬鈴薯中，高溫通過激活StMYB44基因的表達(dá)，降低了DFR 啟動子的活性，減少了花青苷的積累［8］。同樣，在蘋果中，高溫抑制了MdMYB10 的表達(dá)，導(dǎo)致花青苷積累減少［9］。此外，高溫還能激活MdCOL4 的表達(dá)，進(jìn)而抑制MdMYB1 的表達(dá)，減少了蘋果果皮花青苷的積累［1］。盡管如此，高溫對蘋果花青苷合成的抑制作用中，負(fù)調(diào)控R2R3-MYB家族基因的具體角色尚不十分明確。

前期轉(zhuǎn)錄組分析研究發(fā)現(xiàn)，R2R3-MYB基因MdMYB308 受高溫信號誘導(dǎo)，可能參與了高溫抑制蘋果花青苷合成［10］。因此，本研究旨在分析MdMYB308 在不同溫度條件下的表達(dá)模式，并通過構(gòu)建MdMYB308 過表達(dá)和敲除的轉(zhuǎn)基因蘋果，探究其在調(diào)控花青苷合成中的功能，旨在為高溫條件下培育易著色的蘋果新品種提供寶貴的基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采摘花后120 d‘Otome’蘋果，30 個果實(shí)為1 份，分為4 份，分別置于25 ℃、28 ℃、30 ℃、35 ℃，2×104 lx 光強(qiáng)的光照培養(yǎng)箱中處理9 d，隨后進(jìn)行拍照并收獲果皮，液氮速凍，?80 ℃儲存。

‘王林’蘋果愈傷組織在含有0.8 mg L?1 6-BA和1.5 mg L?1 2，4-D 的Murashige-Skoog（MS）培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗培養(yǎng)，‘紫3’紅肉蘋果愈傷組織在含有0.3 mg L?1 NAA和1 mg L?1 6-BA 的Murashige-Skoog（MS）培養(yǎng)基上，25 ℃光照培養(yǎng)。并且每隔15 d 繼代1 次愈傷組織，用來進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花青苷含量測定 稱取0.5 g 蘋果果皮或愈傷組織磨成粉末（液氮中），參照Bai 等［11］的方法對花青苷提取和測定。

1.2.2 亞細(xì)胞定位 將MdMYB308 CDS 連接到pHB-GFP 載體上，將重組載體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101 細(xì)胞中。陽性菌OD600培養(yǎng)到1.0～1.5時(shí)，8 000 r/min 離心10 min，收集菌體。MdMYB308-pHB 菌株重懸（OD600=0.6～0.8）于含有10 mM MES、10 mM MgCl2和150 μM乙酰丁香酮的侵染緩沖液中，黑暗靜置2.5 h，注入本氏煙草葉片。以空載體為對照。引物參見表1。

1.2.3 RNA 提取和RT-qPCR 使用Total RNARapid Extraction Kit （Zomanbio，北京，中國）從樣品中提取總RNA，然后使用PrimeScript RTReagent Kit （Takara，大連，中國）反轉(zhuǎn)錄生成第一鏈cDNA。我們使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Takara，大連，中國）進(jìn)行RT-qPCR 分析。以蘋果Actin（AB638619.1）為內(nèi)參。采用2?ΔΔCT 法進(jìn)行定量數(shù)據(jù)分析。引物參見表1。

1.2.4 瞬時(shí)轉(zhuǎn)化蘋果果實(shí) 將MdMYB308 CDS插入到pRI101 載體，從MdMYB308 CDS 的3'端選取300 bp CDS片段插入pTRV2 載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101 細(xì)胞中［12］。將含有MdMYB308-TRV和MdMYB308-pRI 的農(nóng)桿菌菌液分別注射到花后100 d 和140 d 的‘Otome’果皮。黑暗放置過夜，轉(zhuǎn)移到2×104 lx光照條件下，5 d 后進(jìn)行表型觀察并取樣，測定花青苷含量并進(jìn)行qRT-PCR分析。引物參見表1。

1.2.5 CRISPR/Cas9 基因敲除載體構(gòu)建 利用在線網(wǎng)站（http：//www.crisprscan.org/？page=sequence）設(shè)計(jì)MdMYB308 CRISPR/Cas9 靶標(biāo)及引物，將目標(biāo)序列插入到pHSE401 載體中，具體操作步驟參照Ko等人［13］所述。

1.2.6 蘋果愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化與鑒定 將MdMYB308 過表達(dá)和CRISPR/Cas9 基因敲除載體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101 細(xì)胞中，將陽性菌株與繼代15 d 的‘紫3’紅肉和‘王林’蘋果愈傷組織室溫孵育20 min，置于繼代培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，第2 d 將愈傷組織平鋪于抗性培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。進(jìn)一步利用PCR、RT-qPCR、westernblotting 和二代測序鑒定陽性轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷株系。引物參見表1。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 每個試驗(yàn)設(shè)置包含三個生物學(xué)重復(fù)，并使用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫誘導(dǎo)‘Otome’果實(shí)MdMYB308 的表達(dá)水平，抑制花青苷積累

如圖1 所示，隨著處理溫度的升高，蘋果花青苷積累量降低。MdMYB308 表達(dá)量變化趨勢與之相反。其中，35 ℃處理組MdMYB308 表達(dá)量最高。說明高溫促進(jìn)了MdMYB308 的表達(dá)，進(jìn)而影響了花青苷合成。

2.2 MdMYB308亞細(xì)胞定位

如圖2 所示，構(gòu)建35S：：MdMYB308-GFP 亞細(xì)胞定位載體，以空載體為對照，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染煙草葉片。通過煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)了GFP 熒光信號，表明MdMYB308 在細(xì)胞核中表達(dá)。

2.3 MdMYB308抑制蘋果花青苷合成

2.3.1 MdMYB308 抑制蘋果果皮花青苷積累和關(guān)鍵酶基因表達(dá) 與對照（TRV）相比，瞬時(shí)沉默MdMYB308 的‘Otome’蘋果果皮花青苷積累增加，促進(jìn)果實(shí)著色；相反，瞬時(shí)過表達(dá)MdMYB308的‘Otome’蘋果果皮花青苷積累明顯低于對照（pRI），抑制著色（圖3）。

如圖4 所示，qRT-PCR 分析表明，沉默表達(dá)MdMYB308 后，蘋果果皮中花青苷合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)明顯被促進(jìn)。相反，過表達(dá)MdMYB308明顯抑制蘋果果皮中花青苷合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)。

2.3.2 MdMYB308 抑制蘋果愈傷組織中花青苷積累和關(guān)鍵酶基因表達(dá) 如圖5 所示，獲得3 個MdMYB308 超表達(dá)‘紫3’紅肉蘋果愈傷愈傷株系（MdMYB308-OE#1/3/5）和3 個敲除MdMYB308‘王林’蘋果愈傷株系（MdMYB308-Cas9#1/3/6）。結(jié)果顯示，MdMYB308-OE#1/3/5 蘋果愈傷組織中花青苷含量明顯低于野生型（Red）；而與野生型（WL）相比，敲除MdMYB308-Cas9#1/3/6 蘋果愈傷組織中花青苷的積累顯著增加。

如圖6 所示，qRT-PCR 分析表明，過表達(dá)MdMYB308 蘋果愈傷組織中，花青苷合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)明顯收到抑制。相反，敲除MdMYB308 基因明顯促進(jìn)蘋果愈傷組織中花青苷合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)（圖6）。以上結(jié)果說明MdMYB308 從轉(zhuǎn)錄水平抑制了蘋果花青苷合成。

3 討論

高溫是影響蘋果著色的重要環(huán)境因素。前人研究發(fā)現(xiàn)，高溫可以通過抑制蘋果花青苷正調(diào)控R2R3-MYB基因的表達(dá)，抑制花青苷的合成。高溫可以抑制蘋果花青苷正調(diào)控基因MdMYB10的表達(dá)，抑制果實(shí)花青苷合成和著色［9］。高溫還可以通過誘導(dǎo)MdCOL4 的表達(dá)，抑制花青苷正調(diào)控基因MdMYB1 的表達(dá)，進(jìn)而降低蘋果果皮中花青苷的積累［1］。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)高溫誘導(dǎo)R2R3-MYB 負(fù)調(diào)控基因MdMYB308 表達(dá)，抑制蘋果花青苷合成。可見，高溫抑制蘋果著色涉及多個正負(fù)調(diào)控基因信號途徑。這些結(jié)果為培育高溫條件下易著色蘋果新品種提供了多個潛在基因靶點(diǎn)。

大量研究表明，HSFA 在植物高溫響應(yīng)中起關(guān)鍵作用［14］。HSFA1a、HSFA1b、HSFA1d 和HSFA1e 被認(rèn)為是植物熱應(yīng)激反應(yīng)中不可或缺的主調(diào)節(jié)因子［15，16］。在擬南芥中，HsfA6a 能夠與MYB102 啟動子序列結(jié)合，調(diào)控MYB102 的表達(dá)［17］。在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組，我們發(fā)現(xiàn)高溫誘導(dǎo)MdHSFA 和MdMYB308 基因表達(dá)。但是至目前為止，尚不清楚MdHSFA與MdMYB308 之間是否存在調(diào)控關(guān)系，今后進(jìn)一步揭示MdMYB308 的上游高溫響應(yīng)途徑，將對我們深入認(rèn)識高溫抑制蘋果花青苷合成機(jī)制具有重要意義。

除轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，高溫還通過蛋白水平調(diào)控植物生理反應(yīng)。葡萄中，高溫可以提升過氧化物酶活性，降解花青苷［18］。鑒于葡萄的結(jié)果，我們有理由推測高溫也可能引起蘋果過氧化物酶等活性升高導(dǎo)致了花青苷降解。未來的研究可以進(jìn)一步探究高溫引起的蛋白水平調(diào)控機(jī)制，以全面了解高溫對蘋果著色的影響。

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