摘 要： 恩諾沙星是一種喹諾酮類(lèi)抗生素，長(zhǎng)期食用恩諾沙星超標(biāo)的食品會(huì)對(duì)人體健康造成危害。采用熱注入法合成鈣鈦礦量子點(diǎn)（PQDs），以恩諾沙星為模板分子，結(jié)合分子印跡技術(shù)，制備了基于鈣鈦礦量子點(diǎn)-分子印跡復(fù)合材料（Perovskite quantum dots-molecularly imprinted polymer， PQDs@MIP）熒光探針。運(yùn)用透射電子顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜和氮?dú)馕?脫附實(shí)驗(yàn)對(duì)材料形貌、官能團(tuán)和孔徑特性進(jìn)行考察。探究了孵育時(shí)間、恩諾沙星濃度以及類(lèi)似物對(duì)兩者熒光響應(yīng)行為的影響。結(jié)果表明：恩諾沙星可顯著猝滅PQDs@MIP在514 nm處的熒光，具有較快的猝滅動(dòng)力學(xué)（15 min）和較高的飽和濃度（150 mg·L?1），且恩諾沙星濃度為0.05～40.0 mg·L?1時(shí)，猝滅程度和濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，基于此構(gòu)建了恩諾沙星熒光傳感檢測(cè)方法，該方法的檢出限為0.02 mg·L?1。對(duì)三種水產(chǎn)品的添加回收率為93.6%～106.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～4.9%，證明其良好的實(shí)際應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞： 恩諾沙星；熒光探針；鈣鈦礦量子點(diǎn)；分子印跡

中圖法分類(lèi)號(hào)： TS201.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-2324（2024）06-0895-07

恩諾沙星（Enrofloxacin， ENR）是第三代喹諾酮抗生素［1］，對(duì)革蘭氏陰性和某些革蘭氏陽(yáng)性微生物具有良好的殺菌活性。然而，濫用和過(guò)度使用這些抗生素可能會(huì)使其通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體導(dǎo)致嚴(yán)重的健康問(wèn)題［2，3］，如腹瀉、肝損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷［4］以及導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性［5］。因此，開(kāi)發(fā)一種食品中恩諾沙星簡(jiǎn)單、快速、高靈敏檢測(cè)方法至關(guān)重要。

目前，毛細(xì)管電泳、表面增強(qiáng)拉曼光譜、高效液相色譜等方法被用于檢測(cè)恩諾沙星［6-8］。這些方法通常需要大型儀器設(shè)備且對(duì)操作人員的技能要求相對(duì)較高等，不適合快速定量分析。熒光檢測(cè)法具有高效、高靈敏、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于有害物質(zhì)的分析檢測(cè)［9］。

鈣鈦礦量子點(diǎn)（PQDs）光致發(fā)光量子產(chǎn)率高、發(fā)射光譜光譜半峰寬窄，熒光波長(zhǎng)可調(diào)［10，11］，被視為理想的熒光信號(hào)物質(zhì)［12］。然而，通常情況下，PQDs穩(wěn)定性差，對(duì)溫度、濕度、金屬離子和溶劑等環(huán)境因素敏感，限制了它在實(shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用［13］。分子印跡聚合物（MIP）具有高的熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性和抗干擾能力［14］，因此，用MIP包封量子點(diǎn)是構(gòu)建高穩(wěn)定性熒光探針的有效策略，同時(shí)MIP 能解決單獨(dú)使用PQDs 時(shí)選擇性不足的問(wèn)題。

本研究擬以鈣鈦礦量子點(diǎn)為熒光信號(hào)物質(zhì)，以分子印跡聚合物為識(shí)別單元，構(gòu)建了集信號(hào)識(shí)別和傳導(dǎo)為一體的鈣鈦礦量子點(diǎn)分子印跡（PQDs@MIP）熒光探針，測(cè)試了復(fù)合材料的熒光穩(wěn)定性，研究了PQDs@MIP 對(duì)恩諾沙星的熒光響應(yīng)行為，探究熒光猝滅的機(jī)理，實(shí)現(xiàn)對(duì)恩諾沙星的定量檢測(cè)，并將該方法應(yīng)用到了水產(chǎn)品中恩諾沙星的檢測(cè)，為食品中恩諾沙星檢測(cè)提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、諾氟沙星、氟羅沙星（98%，上海麥克林生化科技有限公司）；碳酸銫、溴化鉛、四甲氧基硅烷、油酸（分析純，阿拉丁試劑上海有限公司）；APTES（98%，阿拉丁試劑上海有限公司）；十八烯（gt;90%，阿拉丁試劑上海有限公司）；無(wú)水乙醇、二氯甲烷（分析純，天津凱通化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

LUMINA LF-1701009 熒光分光光度計(jì)、NICOLET iS10 傅里葉變換紅外光譜儀（美國(guó)Thermo 公司）；TALOS F200S 透射電子顯微鏡（美國(guó)FEI 公司）；ZNCL-TS 500 智能磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；TG16-WS 臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PQDs@MIP探針制備和表征

1.3.1.1 PQDs@MIP 探針合成 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［15］，采用熱注入法合成PQDs 并進(jìn)行包硅處理。以合成的PQDs 為熒光信號(hào)物質(zhì)，以分子印跡聚合物為識(shí)別單元，結(jié)合分子印跡溶膠-凝膠過(guò)程，構(gòu)建復(fù)合探針，具體方法如下：將0.1 mmol恩諾沙星溶解在10.0 mL 二氯甲烷中。繼續(xù)加入10.0 mg PQDs，0.4 mmol APTES，25 ℃下攪拌30 min進(jìn)行預(yù)聚合，接著加入1.6 mmol四甲氧基硅烷，在25 ℃下攪拌15 h，8 000 r/min 離心8 min收集得到聚合物。聚合物用無(wú)水乙醇洗滌5 次，60 ℃下進(jìn)行真空干燥得到PQDs@MIP。按照上述步驟，不加模板分子恩諾沙星，得到非印跡聚合物PQDs@NIP。

1.3.1.2 PQDs@MIP 探針表征 運(yùn)用TEM、FTIR和氮?dú)馕?脫附法表征納米復(fù)合材料的形貌，官能團(tuán)、比表面積及孔徑。

1.3.2 熒光穩(wěn)定性研究 將PQDs@MIP置于自然光下一周，每天測(cè)試熒光發(fā)射光譜，記錄其在514 nm 處的熒光強(qiáng)度，通過(guò)材料在自然光條件下一周的熒光強(qiáng)度變化分析其穩(wěn)定性。

1.3.3 PQDs@MIP 對(duì)恩諾沙星熒光響應(yīng)行為研究

1.3.3.1 PQDs@MIP 對(duì)恩諾沙星動(dòng)態(tài)和靜態(tài)熒光響應(yīng)實(shí)驗(yàn) 測(cè)試復(fù)合材料在加入5.0 mg·L?1恩諾沙星不同時(shí)間后的熒光光譜，計(jì)算F0/F-1（F0為PQDs@MIP 的熒光峰值，F(xiàn) 為PQDs@MIP 添加恩諾沙星后的熒光峰值）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，F(xiàn)0/F-1 為縱坐標(biāo)繪制動(dòng)態(tài)響應(yīng)曲線。測(cè)試其達(dá)到飽和吸附的時(shí)間。測(cè)試PQDs@MIP在不同濃度恩諾沙星溶液中的熒光光譜，以恩諾沙星濃度為橫坐標(biāo)，F(xiàn)0/F-1為縱坐標(biāo)繪制靜態(tài)響應(yīng)曲線。測(cè)試其對(duì)恩諾沙星的飽和濃度。

1.3.3.2 選擇性實(shí)驗(yàn) 測(cè)試PQDs@MIP 和PQDs@NIP對(duì)恩諾沙星及類(lèi)似物氧氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、諾氟沙星、氟羅沙星（濃度均為20 mg·L?1）的熒光響應(yīng)情況，驗(yàn)證PQDs@MIP對(duì)恩諾沙星的選擇性。

1.3.3.3 熒光響應(yīng)機(jī)理探討 測(cè)試添加恩諾沙星前后PQDsMIP 的熒光壽命；判斷熒光響應(yīng)類(lèi)型，使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)PQDs@MIP 及恩諾沙星的吸收峰進(jìn)行表征。分析猝滅機(jī)制。

1.3.4 PQDs@MIP 對(duì)恩諾沙星傳感方法建立取2.0 mg PQDs@MIP 放置于5.0 mL離心管中，分別向其中加入2.0 mL 不同濃度的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液。測(cè)試其熒光發(fā)射光譜，并計(jì)算F0/F-1。以恩諾沙星濃度為橫坐標(biāo)，F(xiàn)0/F-1 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)3 倍信噪比計(jì)算得出檢出限。

熒光檢測(cè)條件為：Ex=365 nm，Em=514 nm，狹縫寬度為5 nm，光電倍增管電壓為550 V。

1.3.5 實(shí)際樣品中恩諾沙星的檢測(cè) 選取海蝦、鯧魚(yú)、鱸魚(yú)三種樣品，參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB31656.3-2021》對(duì)樣品進(jìn)行前處理并測(cè)試樣品本底值。分別在50.0 μg·kg?1、250.0 μg·kg?1、500.0 μg·kg?1三個(gè)水平下進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，經(jīng)提取和凈化后，使用無(wú)水乙醇復(fù)溶，按照1.3.4 方法進(jìn)行熒光檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PQDs@MIP表征

由圖1（A）可知，PQDs 呈現(xiàn)出分布均勻、尺寸均勻的顆粒狀態(tài)。由于在合成PQDs 過(guò)程中加入了APTES，經(jīng)APTES 水解后的PQDs 聚集并嵌入到SiO2材料中。由圖1（B）可知，溶膠凝膠過(guò)程為PQDs@MIP 表面包裹了一層印跡層，PQDs成功嵌入到分子印跡聚合物當(dāng)中。

從圖2（A）可以看出，復(fù)合材料有著許多與PQDs 相同的特征峰，證實(shí)了PQDs 的嵌入。Si-O-Si 的伸縮振動(dòng)峰位于1 056 cm?1處，這意味著APTES 及TMOS成功水解包覆硅層，1 700 cm?1顯示了N-H的拉伸振動(dòng)，這主要來(lái)源于APTES。

氮?dú)馕?脫附法表征的結(jié)果如圖2（B）所示，PQDs@MIP 和PQDs@NIP 顯示出相似的吸附類(lèi)型。PQDs@MIP的比表面積為77.5 m2·g，明顯高于PQDs@NIP 的比表面積（21.3 m2·g）。這是因?yàn)樵赑QDs@MIP 合成過(guò)程中，模板分子恩諾沙星經(jīng)過(guò)洗脫之后，在材料表面形成了生成孔穴。

2.2 熒光穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

結(jié)果如圖2（C）所示，PQDs@MIP 的熒光強(qiáng)度仍保持初始熒光強(qiáng)度的90.7%。證明復(fù)合材料的熒光穩(wěn)定性良好。這得益于在PQDs 合成的過(guò)程中使用APTES 作為封端劑，有效地鈍化PQDs 表面缺陷，并通過(guò)APTES 水解對(duì)PQDs 表面包覆硅層，提高PQDs 的穩(wěn)定性。進(jìn)一步通過(guò)溶膠-凝膠法將PQDs 封裝到聚合物中，借助其優(yōu)秀的穩(wěn)定性進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了對(duì)PQDs 的保護(hù)作用。

2.3 PQDs@MIP 對(duì)恩諾沙星熒光響應(yīng)行為研究

2.3.1 動(dòng)態(tài)熒光響應(yīng)和靜態(tài)熒光響應(yīng) 當(dāng)恩諾沙星與PQDs@MIP 混合時(shí)，恩諾沙星進(jìn)入聚合物的孔隙需要一定的時(shí)間來(lái)平衡。研究了PQDs@MIP達(dá)到飽和吸附所需要的時(shí)間。結(jié)果如圖3（A）所示，在前15 min 內(nèi)，熒光猝滅程度F0/F-1 的值迅速升高并于15 min 達(dá)到最大值并保持穩(wěn)定，表明在15 min時(shí)該復(fù)合材料對(duì)恩諾沙星的吸附達(dá)到飽和，因此確定最佳孵育時(shí)間為15 min。

探究了PQDs@MIP和PQDs@NIP對(duì)恩諾沙星的飽和吸附能力。如圖3（B）所示，隨著恩諾沙星濃度的增加，熒光猝滅程度逐漸增大，到150 mg·L?1時(shí)，達(dá)到最大值并保持穩(wěn)定。表明在150 mg·L?1 時(shí)大多數(shù)特異性位點(diǎn)與恩諾沙星結(jié)合，達(dá)到了吸附平衡。PQDs@MIP 對(duì)恩諾沙星的最大響應(yīng)濃度為150 mg·L?1。

在實(shí)驗(yàn)達(dá)到吸附平衡時(shí)，PQDs@MIP 響應(yīng)值均明顯大于PQDs@NIP，并且MIP的吸附能力明顯高于NIP，這一現(xiàn)象是因?yàn)樵贛IP制備過(guò)程中模板分子恩諾沙星經(jīng)乙醇洗脫后，使得PQDs@MIP較PQDs@NIP有著更大比表面積和孔體積。

2.3.2 選擇性實(shí)驗(yàn) 如圖3（C）所示，恩諾沙星對(duì)PQDs@MIP 的猝滅程度F0/F-1 值為0.59 大于對(duì)PQDs@NIP 的0.33，并且結(jié)構(gòu)類(lèi)似物中對(duì)PQDs@MIP的猝滅較強(qiáng)的氧氟沙星和左氧氟沙星的猝滅程度分別為0.33 和0.34 均遠(yuǎn)小于0.59。這是因?yàn)樵赑QDs@MIP 的合成以及洗脫過(guò)程中，恩諾沙星作為模板分子在PQDs@MIP 的印跡層中留下了特定的印跡位點(diǎn)，其他結(jié)構(gòu)類(lèi)似物因與恩諾沙星的分子結(jié)構(gòu)存在差異而不能進(jìn)入印記位點(diǎn)，只能通過(guò)非特異性吸附產(chǎn)生較微弱的熒光響應(yīng)。非印跡材料的制備過(guò)程中沒(méi)有恩諾沙星的加入，而沒(méi)有形成特定的孔穴結(jié)構(gòu)，因此對(duì)恩諾沙星沒(méi)有特異性識(shí)別的作用。

2.3.3 熒光響應(yīng)機(jī)理分析 熒光的猝滅機(jī)理包括動(dòng)態(tài)猝滅效應(yīng)和靜態(tài)猝滅效應(yīng)［16］。由圖4（A）所示，加入恩諾沙星后，PQDs@MIP位于514 nm熒光壽命明顯降低，這證明恩諾沙星對(duì)PQDs@MIP猝滅行為是動(dòng)態(tài)熒光猝滅。

考慮到本方法合成的PQDs@MIP表面有著許多氨基，能與恩諾沙星表面豐富的基團(tuán)之間存在氫鍵相互作用，導(dǎo)致二者間的電子轉(zhuǎn)移然后發(fā)生熒光猝滅。如圖4（B）所示，恩諾沙星與PQDs@MIP的紫外吸收峰發(fā)生重疊。這滿足電子轉(zhuǎn)移的條件。因此推測(cè)電子轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致PQDs@MIP熒光猝滅的主要原因。

2.4 PQDs@MIP 熒光傳感檢測(cè)恩諾沙星方法建立

將PQDs@MIP 用于恩諾沙星的檢測(cè)，如圖5（A）所示恩諾沙星可以有效猝滅PQDs@MIP位于514 nm 處的熒光強(qiáng)度。如圖5（B）所示，F(xiàn)0/F-1 和恩諾沙星濃度在0.05～40.0 mg·L?1 濃度范圍有著良好的線性關(guān)系。PQDs@MIP 的線性方程為：y=0.022 4x+0.111 8（R2=0.9954）、PQDs@NIP 的線性方程為：y=0.011 3x+0.035 7（R2=0.991 9）。該方法的LOD 為0.02 mg·L?1。并基于此建立了恩諾沙星的檢測(cè)方法。

2.5 實(shí)際樣品中恩諾沙星的檢測(cè)

選取海蝦、鯧魚(yú)、鱸魚(yú)三種實(shí)際樣品，通過(guò)添加回收實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PQDs@MIP熒光探針用于檢測(cè)水產(chǎn)中的恩諾沙星的可行性。結(jié)果如表1 所示，樣品添加回收率在93.6%～106.5%之間，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.9%～4.9%之間。說(shuō)明該方法具有較高的準(zhǔn)確性?？捎糜谒a(chǎn)品中恩諾沙星的檢測(cè)。

3 討論

恩諾沙星殘留檢測(cè)對(duì)于保障食品安全至關(guān)重要。熒光檢測(cè)法因其高靈敏度、低檢測(cè)限、簡(jiǎn)便操作和微量檢測(cè)能力備受青睞，但熒光探針存在選擇性不足的缺點(diǎn)，將PQDs 封裝在分子印跡聚合物網(wǎng)絡(luò)中，提高PQDs 了探針的穩(wěn)定性和選擇性。將本研究建立的方法與其他報(bào)道的方法進(jìn)行比較（表2），本方法有著較低的檢出限和較寬的線性范圍。

4 結(jié)論

采用熱注入法制備PQDs，結(jié)合分子印跡溶膠-凝膠技術(shù)，構(gòu)建了集信號(hào)識(shí)別和傳導(dǎo)為一體的PQDs@MIP熒光探針。對(duì)恩諾沙星的飽和吸附時(shí)間為15 min，飽和吸附量為150 mg·L?1?；陔娮愚D(zhuǎn)移動(dòng)態(tài)猝滅機(jī)制，實(shí)現(xiàn)了對(duì)恩諾沙星定量熒光檢測(cè)。該檢測(cè)方法線性范圍為0.05～40.0 mg·L?1，檢出限為0.02 mg·L?1。將方法應(yīng)用在了實(shí)際樣品中，對(duì)三種水產(chǎn)品的添加回收率為93.6%～106.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.9%～4.9% 之間。為食品中恩諾沙星的快速檢測(cè)提供了新方法，進(jìn)一步助推了鈣鈦礦量子點(diǎn)在安全檢測(cè)中的應(yīng)用研究。

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