田華, 張占華, 李曉利, 劉奇, 黃靜

西安交通大學(xué)附屬紅會(huì)醫(yī)院 1.老年病科,2.急診科,3.兒科,4.臨床藥學(xué)科,陜西西安 710054

胃是容易受到外界因素影響的器官,各種因素都會(huì)導(dǎo)致胃潰瘍形成[1-2]。臨床上消炎痛可引起胃酸釋放和胃蛋白酶活性增加,黏液層和碳酸氫鹽釋放減少;同時(shí)也引起胃黏膜脂質(zhì)過(guò)氧化和活性氧(reactive oxygen species,ROS)形成增加[3]。褪黑素是一種有效的ROS代謝清除劑和抗氧化劑,可促進(jìn)胃腸道分泌、運(yùn)動(dòng)、消化和吸收[4]。此外,褪黑素還具有抗炎功能,有助于保護(hù)胃腸黏膜[5];但是褪黑素在消炎痛誘導(dǎo)胃潰瘍中作用未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探討褪黑素在消炎痛誘導(dǎo)小鼠胃潰瘍模型中的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和主要試劑

光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司);總抗氧化態(tài)(total antioxidant status,TAS)、總氧化態(tài)(total oxidant status,TOS)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-6、IL-10檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所);消炎痛、兔源多克隆核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)和Caspase-3抗體(美國(guó)Sigma公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

40只5周齡雄性BALB/c小鼠(22～28 g),購(gòu)于西安交通大學(xué)動(dòng)物中心,室溫下自由進(jìn)食和飲水。將BALB/c小鼠隨機(jī)均分成對(duì)照組、潰瘍組、低劑量褪黑素組和高劑量褪黑素組,每組10只。對(duì)照組僅腹腔注射二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)。潰瘍組小鼠皮下注射2.5 g/L消炎痛NaHCO3溶液[6]。低劑量、高劑量褪黑素組分別用褪黑素1、5 mg/kg預(yù)處理,24 h后注射消炎痛。造模成功7 h后,全麻處死各組小鼠,收集胃組織待用。

1.3 ELISA檢測(cè)

各組小鼠胃組織在10%冰冷磷酸鹽緩沖液中勻漿,4 000 r/min離心,取上清液。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)胃組織中TAS、TOS、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平。氧化應(yīng)激指數(shù)(oxidative stress index,OSI)=TOS/TAS。

1.4 組織病理學(xué)分析

各組小鼠胃組織用10%福爾馬林緩沖液固定,石蠟包埋,4 μm連續(xù)切片。HE染色,顯微鏡下評(píng)估各組胃組織損傷程度[7]。

1.5 免疫印跡分析

提取各組小鼠胃組織100 mg,加入全細(xì)胞裂解液2 mL,勻漿、超聲破碎,BCA法進(jìn)行蛋白定量,制備成電泳樣品。取30 μg電泳樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳,然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。經(jīng)5%牛奶孵育1 h。分別用兔源NF-κB(1∶1 000)和Caspase-3(1∶1 000)4 ℃孵育3 h。用山羊抗兔二抗(1∶10 000),室溫孵育1 h。采用Quantity one圖像分析軟件對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠TAS、TOS、OSI及炎癥細(xì)胞因子比較

與對(duì)照組比較,其他各組TAS、TOS、OSI水平升高(P<0.05);潰瘍組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平升高(P<0.05)。與潰瘍組比較,高劑量褪黑素組TAS水平升高,TOS和OSI水平降低(P<0.05);低劑量和高劑量褪黑素組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平降低(P<0.05)。與低劑量褪黑素組比較,高劑量褪黑素組TNF-α和IL-1β降低(P<0.05;表1)。

表1 褪黑素對(duì)小鼠TAS、TOS、OSI及炎癥細(xì)胞因子的影響

2.2 褪黑素對(duì)小鼠胃潰瘍的影響

對(duì)照組胃黏膜層由單層柱狀上皮組成,排列整齊。潰瘍組胃黏膜層上皮壞死、脫落、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及出血嚴(yán)重。低劑量褪黑素組胃黏膜層上皮壞死、脫落、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及出血較潰瘍組改善。高劑量褪黑素組胃黏膜層上皮壞死、脫落、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及出血較低劑量褪黑素組減輕(圖1)。

圖1 各組小鼠胃組織病理檢測(cè)結(jié)果(HE染色,200×) 箭頭表示出血處。

2.3 褪黑素對(duì)小鼠NF-κB和Caspase-3的影響

與對(duì)照組比較,其他各組小鼠胃組織中NF-κB和Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與潰瘍組比較,高劑量褪黑素組胃組織中NF-κB和Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05;圖2、表2)。

圖2 各組小鼠胃組織典型NF-κB和Caspase-3表達(dá)

表2 各組小鼠NF-κB和Caspase-3比較

3 討 論

胃潰瘍?yōu)槌Ｒ?jiàn)的胃腸道疾病,臨床上主要是由于服用非甾體抗炎藥而導(dǎo)致出血和黏膜病變[8]。研究證實(shí),消炎痛會(huì)引起嚴(yán)重胃腸道損傷和氧化應(yīng)激[9];消炎痛誘導(dǎo)胃潰瘍主要是通過(guò)ROS生成[10]。臨床上,胃潰瘍通常采用組胺-2受體阻滯劑或質(zhì)子泵抑制劑治療,但長(zhǎng)期使用會(huì)引起不良反應(yīng)。研究表明,褪黑素在應(yīng)激性潰瘍模型中對(duì)胃潰瘍有保護(hù)作用[5],但是對(duì)于消炎痛引起胃潰瘍損傷的機(jī)制仍不明確。

消炎痛誘導(dǎo)潰瘍模型顯示胃潰瘍過(guò)程中ROS產(chǎn)生,導(dǎo)致細(xì)胞蛋白氧化和抗氧化劑耗竭[11]。ROS也可引起氧化損傷,破壞抗氧化防御系統(tǒng)。TAS被廣泛用于測(cè)定總抗氧化能力[12]。OSI是一種能顯示脂質(zhì)、蛋白質(zhì)氧化和DNA損傷指標(biāo),而DNA損傷是由于氧化劑增加或抗氧化劑減少而產(chǎn)生的非代償性自由基引起的。本研究結(jié)果顯示,在消炎痛誘導(dǎo)潰瘍中,褪黑素升高TAS,降低TOS和OSI。NF-κB在潰瘍愈合過(guò)程中起著重要作用,胃潰瘍期間組織中NF-κB激活增加[13]。NF-κB也在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中起著重要作用,并觸發(fā)IL-6、IL1-β和TNF-α等促炎癥細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄上調(diào)[14]。在本研究中,褪黑素可能通過(guò)NF-κB信號(hào)通路降低誘導(dǎo)期炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10)水平來(lái)減輕消炎痛誘導(dǎo)胃潰瘍。細(xì)胞凋亡是免疫系統(tǒng)發(fā)育和組織重建過(guò)程中,清除正常細(xì)胞的調(diào)節(jié)過(guò)程。細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)障礙與多種疾病有關(guān)。在消炎痛誘導(dǎo)消化性潰瘍研究中發(fā)現(xiàn)Caspase-3水平升高[15]。在另一項(xiàng)研究中,褪黑素能減少黑質(zhì)中線粒體DNA損傷,并減少ROS產(chǎn)生,抑制細(xì)胞凋亡[16]。在本研究中,與對(duì)照組比較,潰瘍組Caspase-3水平升高,褪黑素預(yù)處理后,Caspase-3水平降低。褪黑素的胃潰瘍保護(hù)機(jī)制可能是通過(guò)抑制凋亡而發(fā)揮作用。

總之,本研究結(jié)果提示,褪黑素可能通過(guò)NF-κB來(lái)調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子,以及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡在消炎痛誘導(dǎo)胃潰瘍小鼠中發(fā)揮保護(hù)作用。