孫興華 于 濤 張學(xué)新 常鴻艷 洪月光 李偉偉

1.河北省秦皇島市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，河北秦皇島 066000；2.濰坊醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東濰坊 261053；3.河北省秦皇島市中醫(yī)醫(yī)院心血管內(nèi)科，河北秦皇島 066000；4.河北省秦皇島市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科，河北秦皇島 066000

前列腺癌是危害全世界男性健康的最常見惡性腫瘤之一[1]。炎癥在多種人類腫瘤包括前列腺癌的發(fā)生、促進和發(fā)展中起重要的作用[2]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，LPS的識別與跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，是引起細胞炎癥效應(yīng)的關(guān)鍵。有研究顯示，長期慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生是非小細胞肺癌、胃癌和宮頸癌發(fā)生的重要致病因素[3-6]。感染及炎癥與前列腺癌的關(guān)系密不可分，革蘭氏陰性桿菌的反復(fù)感染是慢性前列腺炎發(fā)病的重要原因，增加了PCa細胞的增殖能力、遷移能力及局部侵襲能力[7-8]。前列腺六段跨膜上皮抗原（six-segment transmembrane epithelial antigen of prostate，STEAP）家族參與多種生物學(xué)過程，包括增殖和炎癥，在癌癥治療中發(fā)揮潛在作用[9]。STEAP4 是STEAP 家族成員之一，參與乳腺癌和膀胱癌的發(fā)展，并與結(jié)腸癌的炎癥有關(guān)[10-12]。另有研究表明，STEAP4 在前列腺癌組織中高度表達，并且相關(guān)性分析得出STEAP4 高表達的患者比低表達的患者其前列腺癌復(fù)發(fā)的時間更快，可作為前列腺癌患者的預(yù)后指標[13]。然而，STEAP4 在前列腺癌發(fā)展中的作用和相關(guān)機制仍不清楚。本研究旨在探討STEAP4 對LPS 誘導(dǎo)的前列腺癌細胞增殖的影響，可能為前列腺癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)與處理

人前列腺癌細胞系PC3（貨號：CRL-1435）和VCaP（貨號：CRL-2876）由ATCC 提供，并在含有10%胎牛血清（Gibco，美國）和1%青霉素/ 鏈霉素的DMEM（賽默飛世爾科技公司，中國）中于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。參照Xu 等[14]研究，將PC3 和VCaP細胞暴露于1 μg/ml 的LPS（索萊寶，北京）中孵育24 h誘導(dǎo)炎癥環(huán)境。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染

采用Lipofectamine 2000（賽默飛世爾科技公司，中國）將沉默載體（si-STEAP4 及其對照si-con）轉(zhuǎn)染進入細胞。經(jīng)48 h 轉(zhuǎn)染后，觀察細胞生長情況，收集細胞用于進一步研究。STEAP4 的siRNA（si-STEAP4：5’-AUCUUACAAGUUUUCUCCAU-3’）和siRNA 陰性對照（si-con：5’-AGACAUGUGUGUGUCCGCCTT-3’）購自GenePharma（上海）。實驗重復(fù)3 次，設(shè)3個復(fù)孔。將細胞分為對照組、LPS 處理組、轉(zhuǎn)染對照組（LPS+si-con）和轉(zhuǎn)染沉默組（LPS+si-STEAP4）。

1.3 蛋白免疫印跡

采用放射免疫沉淀法測定蛋白濃度，根據(jù)光密度（optical density，OD）值從標準曲線中計算蛋白的濃度。根據(jù)蛋白濃度計算上樣量。本研究實驗的樣品量為20 μl，上樣量為30 μg。臨用前加入最終的樣品緩沖液：2%SDS、100 mmol/L DTT、60 mmol/L Tris（pH 6.8）、0.01%溴酚藍和10%甘油。在電極（正極）上依次疊放PVDF 膜和凝膠。轉(zhuǎn)膜結(jié)束，將膜浸入封閉液（含5%脫脂奶粉的TBS）中緩慢振蕩后洗滌?？筍TEAP4（cat.No.PA5-106509，1∶1 000 稀釋度，賽默飛世爾科技公司）；環(huán)鳥苷酸（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）（cat.No.#A11070，1∶1000 稀釋度，賽默飛世爾科技公司）；抗-cGMP 依賴性蛋白激酶（cGMP-dependent protein kinase，PKG）1（cat.No.#3248，1∶1 000 稀釋度，Cell Signaling Technology）、抗-PKG2（cat.No.PA5-116863，1∶1 000 稀釋度，賽默飛世爾科技公司）、抗血管擴張劑刺激磷酸蛋白（vasodilator stimulated phosphoprotein，VASP）（cat.No.ab109321，1∶1 000 稀釋度，Abcam）、抗磷酸化VASP（p-VASP，ab218619，1∶1 000 稀釋度，Abcam）、抗β-actin（cat.No.ab8227，1∶2 000 稀釋度，Abcam），4℃緩慢振蕩過夜；加HRP標記的二抗（1∶12 000 稀釋），室溫緩慢振蕩2 h 后洗滌；以β-action 作為內(nèi)參，采用Quantity One 軟件將條帶轉(zhuǎn)化為灰度值，蛋白表達量=目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。實驗重復(fù)3 次。

1.4 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測細胞因子的含量

取對數(shù)生長期的PC3 和VCaP 細胞，以2×107/L接種于6 孔板中，每孔2 ml，細胞貼壁后按照分組進行處理。用si-con 或si-STEAP4 轉(zhuǎn)染PC3 和VCaP 細胞。轉(zhuǎn)染24 h 后，用1 μg/ml LPS 另外再處理細胞24 h。收集上清液于4℃、4 000 r/min 離心10 min（離心半徑10 cm)。按照ELISA 試劑盒白細胞介素（interleukin，IL）-6（cat.No.KHC0061）、IL-8（cat.No.KHC0081）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α)（cat.No.MS223-4）說明書操作，檢測上清液中IL-6、IL-8 和TNF-α 含量。實驗重復(fù)3 次，設(shè)3 個復(fù)孔。

1.5 CCK-8 法檢測細胞存活率

將PC3 和VCaP 細胞（1×104/ 孔）接種至96 孔板。經(jīng)LPS 處理后，加入10 μl 的CCK-8 試劑（Beyotime）并孵育4 h。使用SpectraMax iD5 微板讀取器（Molecular Devices，Sunnyvale，CA）檢測450 nm 處的OD 值。實驗重復(fù)3 次，設(shè)3 個復(fù)孔。

1.6 EdU 染色

將PC3 和VCaP 細胞（5×105/孔）接種至6 孔板，用si-con 或si-STEAP4 轉(zhuǎn)染PC3 和VCaP 細胞。轉(zhuǎn)染24 h 后，用1 μg/ml LPS 另外再處理細胞24 h。根據(jù)操作說明書使用EdU 檢測試劑盒（Abcam）進行孵育。使用DAPI（Beyotime）將細胞核進行染色，在熒光顯微鏡下觀察細胞。細胞增殖以總細胞中EdU 陽性細胞的百分比來表示。實驗重復(fù)3 次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS 處理后各組前列腺癌細胞中STEAP4 蛋白表達水平的變化

LPS 處理組PC3 和VCaP 細胞的STEAP4 蛋白表達水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；LPS 處理組PC3 和VCaP 細胞的STEAP4 的表達水平與轉(zhuǎn)染對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染沉默組PC3 和VCaP 細胞的STEAP4 的表達水平顯著低于轉(zhuǎn)染對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 LPS 處理后各組細胞中STEAP4 蛋白表達水平的變化（n=3）

2.2 STEAP4 敲除對LPS 誘導(dǎo)的各組前列腺癌細胞的炎癥反應(yīng)的影響

LPS 處理組PC3 和VCaP 細胞的IL-6、IL-8 和TNF-α 的表達水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；LPS 處理組和轉(zhuǎn)染對照組PC3 和VCaP細胞的IL-6、IL-8 和TNF-α 的表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染沉默組PC3 和VCaP 細胞的IL-6、IL-8 和TNF-α 的表達水平顯著低于轉(zhuǎn)染對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 STEAP4 敲除對LPS 誘導(dǎo)的各組前列腺癌細胞的炎癥反應(yīng)的影響（n=3）

2.3 STEAP4 敲除對LPS 誘導(dǎo)的各組前列腺癌細胞增殖的影響

LPS 處理組PC3 和VCaP 細胞24、48、72 h 的增殖活力顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；LPS 處理組和轉(zhuǎn)染對照組PC3 和VCaP 細胞24、48、72 h 的增殖活力比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染沉默組PC3 和VCaP 細胞24、48、72 h 的增殖活力均低于轉(zhuǎn)染對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）LPS 處理組PC3 和VCaP 細胞的增殖活力顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；LPS 處理組和轉(zhuǎn)染對照組PC3 和VCaP 細胞的增殖活力比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染沉默組PC3 和VCaP 細胞的增殖活力顯著低于轉(zhuǎn)染對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 STEAP4 敲除對LPS 誘導(dǎo)的各組前列腺癌細胞增殖的影響（n=3）

2.4 STEAP4 敲低對LPS 誘導(dǎo)的前列腺癌細胞中cGMPPKG 信號途徑的影響

LPS 處理組PC3 和VCaP 細胞中cGMP、PKG1、PKG2 和pVASP/VASP 的相對表達量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染對照組和LPS處理組PC3 和VCaP 細胞中cGMP、PKG1、PKG2 和pVASP/VASP 的相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染沉默組的PC3 和VCaP 細胞中cGMP、PKG1、PKG2 和pVASP/VASP 的相對表達量顯著高于轉(zhuǎn)染對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 STEAP4 敲低對LPS 誘導(dǎo)的前列腺癌細胞中cGMP-PKG 信號途徑的影響（n=3）

3 討論

前列腺癌是世界范圍內(nèi)男性發(fā)病率排名第二的惡性腫瘤[15]。近年研究報道，在前列腺癌組織中能觀察到慢性炎癥反應(yīng)，被認為是前列腺癌進展的驅(qū)動因素之一[16]。另有研究報道，感染及炎癥與前列腺癌的關(guān)系是密不可分的，革蘭氏陰性桿菌的反復(fù)感染是慢性前列腺炎發(fā)病的重要原因，并且大量證據(jù)表明，感染促進了前列腺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[17-18]。LPS 作為革蘭氏陰性菌的主要化合物，能夠激活免疫細胞產(chǎn)生多種細胞因子和后續(xù)的炎癥反應(yīng)[19]。有研究顯示，LPS 可增加前列腺癌細胞增殖的能力、遷移的能力及局部侵襲的能力，增加了癌細胞的惡性程度[20]。STEAP 家族在前列腺癌中發(fā)揮重要作用。既往研究表明，STEAP4 是受炎癥細胞因子調(diào)節(jié)的靶點[21-22]；此外研究表明，在炎癥相關(guān)環(huán)境下STEAP4 在結(jié)腸癌的發(fā)展中起重要作用[12]。目前，STEAP4 在炎癥環(huán)境下對前列腺癌發(fā)展的影響的相關(guān)研究鮮見報道。

本實驗采用LPS 誘導(dǎo)前列腺癌模擬炎癥環(huán)境，結(jié)果顯示，LPS 處理后的前列腺癌細胞的增殖能力升高，STEAP4 蛋白的表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染si-STEAP4 敲低STEAP4 能夠抑制炎癥條件下前列腺癌的細胞增殖及炎癥因子的水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。另外EdU 染色分析結(jié)果顯示，LPS 能夠促進細胞增殖，而STEAP4 沉默逆轉(zhuǎn)了這一效應(yīng)。以上結(jié)果顯示，STEAP4 敲低可減輕LPS 誘導(dǎo)的前列腺癌增殖，提示STEAP4 在前列腺癌治療中的潛力。

本研究進一步探索了STEAP4 在前列腺癌中介導(dǎo)的下游途徑，并發(fā)現(xiàn)其可能與cGMP-PKG 信號傳導(dǎo)有關(guān)。cGMP 參與多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，有研究表明，PKG2 可以抑制許多腫瘤的細胞增殖，如結(jié)腸癌、黑色素瘤和卵巢癌[23-25]。既往研究表明，cGMP-PKG 信號的激活有助于減少前列腺癌中的細胞增殖[26]。本研究顯示，在LPS 存在的情況下，cGMP-PKG 通路在前列腺癌中失活。本研究仍存在不足，今后仍需要進行體內(nèi)實驗以進一步研究STEAP4 的潛在功能。

綜上所述，STEAP4 下調(diào)能夠抑制LPS 誘導(dǎo)的前列腺癌的增殖。本研究為炎癥環(huán)境下前列腺癌的進展提供了新的見解，并指出了治療前列腺癌的潛在靶點。