任 華 馬 明 王 超 王昭君

1.山西省大同市第五人民醫(yī)院普外科，山西大同 037000；2.山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系，山西晉中 030600

胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是最普遍的肉瘤類型，約占全部胃腸道腫瘤的0.2%，多發(fā)于50 歲以上人群[1]。資料顯示，GIST 的發(fā)生率在不同地區(qū)和人群中有所差異，以中國(guó)、韓國(guó)及挪威發(fā)病率最高[2-3]。GIST 可并發(fā)嘔吐、消化道出血等癥，嚴(yán)重時(shí)可誘發(fā)消化道梗阻及穿孔，導(dǎo)致嚴(yán)重腹部疼痛及感染，危及生命健康。現(xiàn)階段，GIST 治療方式主要包括手術(shù)切除和靶向藥物治療，其中伊馬替尼是目前不可切除性原發(fā)性及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)性GIST 的一線治療藥物，但并非所有患者均對(duì)其敏感，且部分患者存在耐藥問題，導(dǎo)致預(yù)后不甚理想[4-5]。尋找新的治療策略是目前GIST 領(lǐng)域的重要課題。微RNA-30（microRNA-30，miR-30）a 是廣泛表達(dá)于人體各種組織中的一種miRNA，在多種腫瘤中發(fā)揮抑制或促進(jìn)的作用[6-8]。miR-30 家族中的其他成員也在GIST 中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，如miR-30c 可以通過靶向基因來抑制GIST 細(xì)胞的增殖和遷移，表明miR-30 家族是在GIST 發(fā)展和治療中具有潛在價(jià)值的生物標(biāo)志物和藥物靶點(diǎn)[9]。然而，目前關(guān)于其在GIST 中的作用及相關(guān)機(jī)制報(bào)道尚少。研究miR-30a 在GIST 中的作用和機(jī)制，有助于揭示GIST 的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和策略。本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染miR-30a 基因過表達(dá)質(zhì)粒、沉默質(zhì)粒至GIST-T1 細(xì)胞中，檢測(cè)細(xì)胞行為學(xué)變化，并分析可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021 年11 月至2022 年11 月在山西省大同市第五人民醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)切除治療的GIST 患者30 例，男19 例，女11 例；年齡51～72 歲，平均（65.61±9.53）歲。所選受試者均通過病理學(xué)檢查證實(shí)為GIST，排除術(shù)前放化療或藥物治療者。選取患者手術(shù)切除的正常組織（距離GIST 組織邊緣＞5 cm）作為對(duì)照，經(jīng)手術(shù)切除的GIST 組織、正常組織均投入液氮保存。本研究經(jīng)山西省大同市第五人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2021-030），患者或家屬對(duì)研究?jī)?nèi)容知情同意。

1.2 細(xì)胞株

人GIST-T1 細(xì)胞株購自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司。

1.3 藥物、主要試劑、儀器

miR-30a NC、mimics、inhibitor 質(zhì)粒，大連華醫(yī)基因生物技術(shù)有限公司構(gòu)建；LipofectamineTM3000 試劑盒（貨號(hào)：R0084-100ML，常州三友生物工程有限公司）；雙螢光素酶檢測(cè)試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒（貨號(hào)：E1910、A5001，美國(guó)Promega公司）；MTT 試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC 液（貨號(hào)：M6494、A35109、A13199，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（貨號(hào)：A120227，長(zhǎng)春新興藥業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司）；兔抗人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）、Smad2、p-Smad2 一抗（貨號(hào)：ab92486、ab40855、ab53100，美國(guó)Abcam 公司）。Transwell 小室（美國(guó)康寧公司）；SpectraMax 酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices 公司）；Attunenxt 流式細(xì)胞儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.4 qRT-PCR 法檢測(cè)GIST 組織及正常組織中miR-30a 表達(dá)量

取液氮中保存組織，充分粉碎，提取總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳或者比色分析等方法鑒定RNA 純度與完整性。將提取的總RNA 采用stem-loop 法逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄溫度為16～18℃，時(shí)間30 min。設(shè)計(jì)miR-30a 和內(nèi)參基因的qPCR 引物序列，miR-30a：正向?yàn)?’-GCGTCACGTGCCCGCGCATCCGAC-3’；反向?yàn)?’-GCGACTGTACGTGTCACCGACT-3’；U6：正向?yàn)?’-CTGCACGTGCTGCTCAA-3’；反向?yàn)?’-GAGGTAAC-GTGCAGTGTGTG-3’。用qRT-PCR 試劑盒，將cDNA 混合物進(jìn)行熒光定量PCR 分析。通過qPCR數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算和比較，2-△△Ct法計(jì)算miR-30a 相對(duì)表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

將GIST-T1 細(xì)胞株培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，隔天換液，貼壁后胰酶消化傳代，對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，接種于6 孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至貼壁，分別將miR-30a陰性對(duì)照質(zhì)粒miR-30a NC、過表達(dá)量質(zhì)粒miR-30a mimics、沉默質(zhì)粒miR-30a inhibitor 轉(zhuǎn)染至GIST-T1細(xì)胞，分別設(shè)為miR-30a NC 組、miR-30a mimics 組、miR-30a inhibitor 組，另取對(duì)數(shù)期GIST-T1 細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組，培養(yǎng)24 h 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 qRT-PCR 檢測(cè)miR-30a 表達(dá)量

取各組細(xì)胞，操作同“1.4”。

1.7 MTT 法檢測(cè)增殖能力

取各組細(xì)胞，預(yù)冷PBS 漂洗、重懸，分別種植于96 孔板中，每孔5 000 個(gè)細(xì)胞，在完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)24、48、72 h 后分別加入新制備的MTT 溶液（5.00 g/L，20 μl），孵育4 h，棄上清并加入150 μl DMSO，充分振蕩至甲瓚晶體溶解，檢測(cè)490 nm 波長(zhǎng)處各組細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白組吸光度值）/（對(duì)照組吸光度值-空白組吸光度值）×100%，其中空白組為不含細(xì)胞和待測(cè)物質(zhì)的培養(yǎng)基和MTT溶液。

1.8 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

Matrigel 基質(zhì)凝膠融化后涂抹至Transwell 小室，取各組細(xì)胞加入無血清培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×106個(gè)/ml，取200 μl 各組細(xì)胞懸液加入Transwell 小室上層，下層中加入完全培養(yǎng)液趨化，置于37℃、5%CO2標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h，用棉簽去除上層腔中未通過Matrigel 基底膜的細(xì)胞，用甲醇固定通過細(xì)胞，并用0.1%結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下隨機(jī)選擇5 個(gè)不重復(fù)視野，計(jì)算侵襲染色細(xì)胞數(shù)/視野數(shù)。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取各組細(xì)胞，清洗、重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml 接種至6 孔板，加入完全培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d，PBS 清洗兩次，低溫離心2 min（3 500 r/min，半徑為8 cm），吸棄上清，按照凋亡試劑盒說明書要求進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程，binding buffer 液重懸細(xì)胞，Annexin V-FITC 液染色后，再加入PI 液二次染色，遮光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算各組凋亡率。

1.10 Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞TGF-β1、Smad2、p-Smad2蛋白表達(dá)量

取各組細(xì)胞，充分裂解，低溫10 000 r/min 離心10 min，取上清并定量蛋白。取少量樣本蛋白，混合4倍量上樣緩沖液，水浴加熱變性蛋白，按照每孔20～30 μg 的量加載到凝膠槽中，加入預(yù)染色蛋白作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用恒壓電源進(jìn)行電泳分離；將分離好的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到聚氟乙烯膜上，用轉(zhuǎn)印儀或半干法進(jìn)行轉(zhuǎn)?。粚⑥D(zhuǎn)印好的膜用5%牛奶在室溫或4℃封閉1～2 h，防止非特異性結(jié)合；將封閉好的膜用含有適當(dāng)稀釋比例的TGF-β1、Smad2、p-Smad2 一抗溶液在4℃過夜或室溫2 h 孵育，使一抗與目標(biāo)蛋白結(jié)合；將孵育好的膜用含有Tween-20 的TBST 緩沖液洗滌3次，10 min/次，去除未結(jié)合的一抗；將洗滌好的膜用含有適當(dāng)稀釋比例的熒光標(biāo)記的二抗溶液在室溫1 h孵育，使二抗與一抗結(jié)合；洗滌：重復(fù)上述洗滌步驟，去除未結(jié)合的二抗；將洗滌好的膜用熒光成像儀進(jìn)行掃描和分析，根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)度和分子量判斷目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

1.11 雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-30a 靶向基因

經(jīng)TargetScan 預(yù)測(cè)，miR-30a 與TGF-β1 3’UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，由百通生物科技（天津）有限責(zé)任公司鑒定。構(gòu)建合成野生型TGF-β1 3’-UTR-WT 及突變型TGF-β1 3’-UTR-MUT 載體，與miR-30a 質(zhì)粒（miR-30a mimics、miR-30a NC）共同轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，加入火鯊魚螢光素酶底物使報(bào)告基因發(fā)出熒光信號(hào)，記錄該酶的熒光強(qiáng)度，加入停止緩沖液，停止螢光素酶反應(yīng)，加入Renilla 螢光素酶底物使內(nèi)參基因產(chǎn)生螢光，記錄該酶的熒光強(qiáng)度。計(jì)算出對(duì)應(yīng)的相對(duì)熒光單位。相對(duì)螢光素酶活性=火鯊魚螢光素酶活性/Renilla 螢光素酶活性。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GIST 組織及正常組織中miR-30a 表達(dá)量比較

與正常組織比較，GIST 組織中的miR-30a 表達(dá)量降低（P＜0.05）。見表1。

表1 GIST 組織及正常組織中miR-30a 表達(dá)量比較（±s）

表1 GIST 組織及正常組織中miR-30a 表達(dá)量比較（±s）

注GIST：胃腸道間質(zhì)瘤；miR-30a：微RNA-30a。

2.2 各組細(xì)胞miR-30a 表達(dá)量比較

miR-30a NC 組細(xì)胞miR-30a 表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對(duì)照組比較，miR-30a mimics 組miR-30a 表達(dá)量升高，miR-30a inhibitor 組miR-30a 表達(dá)量降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組細(xì)胞miR-30a 表達(dá)量比較（±s）

表2 各組細(xì)胞miR-30a 表達(dá)量比較（±s）

注 與對(duì)照組比較，aP＜0.05。miR-30a：微RNA-30a。

2.3 各組細(xì)胞增殖能力比較

miR-30a NC 組24、48、72 h 細(xì)胞增殖率與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與對(duì)照組比較，miR-30a mimics 組24、48、72 h 細(xì)胞增殖率降低，miR-30a inhibitor 組24、48、72 h 細(xì)胞增殖率升高（P＜0.05）；與24 h 比較，miR-30a mimics 組、miR-30a inhibitor 組48、72 h 細(xì)胞增殖率升高（P＜0.05）；與48 h比較，miR-30a mimics組、miR-30a inhibitor 組72 h 細(xì)胞增殖率升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h 后細(xì)胞增殖率比較（%，±s）

表3 各組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h 后細(xì)胞增殖率比較（%，±s）

注 與對(duì)照組同期比較，aP＜0.05；與本組24 h 比較，bP＜0.05；與本組48 h 比較，cP＜0.05。

2.4 各組侵襲能力比較

對(duì)照組、miR-30a NC 組、miR-30a mimics 組、miR-30a inhibitor 組穿膜染色細(xì)胞數(shù)分別為（70.40±12.48）、（71.20±13.26）、（29.20±5.26）、（96.40±13.59）個(gè)/視野。miR-30a NC 組穿膜染色細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對(duì)照組比較，miR-30a mimics 組穿膜染色細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.001）；miR-30a inhibitor 組穿膜細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.001）。見圖1。

圖1 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力（400×）

2.5 各組細(xì)胞凋亡率比較

miR-30a NC 組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對(duì)照組比較，miR-138-5p mimics 組凋亡率升高，miR-30a inhibitor 組凋亡率降低（P＜0.05）。見圖2、表4。

圖2 細(xì)胞凋亡率流式圖（n=5）

表4 各組細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

表4 各組細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

注 與對(duì)照組比較，aP＜0.05。

2.6 各組細(xì)胞TGF-β1、p-Smad2/Smad2 蛋白表達(dá)量比較

圖3 各組細(xì)胞TGF-β1、Smad2、p-Smad2 蛋白表達(dá)條帶圖

miR-30a NC 組TGF-β1、p-Smad2/Smad2 蛋 白表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與對(duì)照組比較，miR-30a mimics 組TGF-β1 蛋白表達(dá)量、p-Smad2/Smad2 降低，miR-30a inhibitor 組TGF-β1蛋白表達(dá)量、p-Smad2/Smad2 升高（P＜0.05）。見圖3、表5。

表5 各組細(xì)胞TGF-β1 蛋白表達(dá)量、p-Smad2/Smad2 比較（±s）

表5 各組細(xì)胞TGF-β1 蛋白表達(dá)量、p-Smad2/Smad2 比較（±s）

注 與對(duì)照組比較，aP＜0.05。TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1。

2.7 雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果

miR-30a 與TGF-β1 存在互補(bǔ)序列，見圖4。與miR-30a NC 組比較，miR-30a mimics 組TGF-β1-WT熒光酶活性降低（P＜0.05），對(duì)突變型TGF-β1-MUT熒光酶活性無影響（P＞0.05）。見圖4、表6。

圖4 miR-30a 與TGF-β1 互補(bǔ)序列

表6 兩組熒光酶活性比較（±s）

表6 兩組熒光酶活性比較（±s）

注TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1。

3 討論

GIST 是一種起源于胃腸道壁內(nèi)的間葉組織的腫瘤，通常表現(xiàn)為良性或低度惡性，但有時(shí)也表現(xiàn)為高度惡性[10]。年齡及家族性GIST 綜合征、神經(jīng)纖維瘤病、Carney-Stratakis 綜合征等也會(huì)增加GIST 的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[11-12]。其發(fā)病機(jī)制主要與KIT 及PDGFRA 基因突變有關(guān)，突變基因可編碼酪氨酸激酶受體，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[13-14]。正常情況下，酪氨酸激酶受體只有結(jié)合相應(yīng)配體后才會(huì)被激活，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，但當(dāng)KIT 或PDGFRA 基因發(fā)生突變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致受體失去對(duì)配體的依賴性，持續(xù)維持激活狀態(tài)，從而促進(jìn)細(xì)胞無限制增殖及存活，形成腫瘤。高增殖、高侵襲及低凋亡性是GIST 發(fā)生及進(jìn)展的主要原因，探尋抑制GIST 細(xì)胞增殖、侵襲并促進(jìn)其凋亡的有效方式是治療該病的關(guān)鍵。

本研究結(jié)果顯示，GIST 組織miR-30a 表達(dá)量低于正常組織，通過轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)miR-30a mimics 組24、48、72 h 增殖率降低，穿膜染色細(xì)胞數(shù)減少，凋亡率升高，miR-30a inhibitor 組反之，提示miR-30a 在GIST組織中表達(dá)降低，上調(diào)其表達(dá)可抑制GIST 細(xì)胞增殖、侵襲，并促進(jìn)其凋亡。miRNA 是一非編碼小分子RNA，近年來多項(xiàng)研究表明其在GIST 的發(fā)病中起重要作用[15-17]。miR-30a 是一種長(zhǎng)度為70 個(gè)核苷酸的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，位于人類第6 號(hào)染色體的6q13 區(qū)域，主要由MIR30A-1 和MIR30A-2 兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生，由Drosha 酶在細(xì)胞核內(nèi)切割而成被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，由Dicer 酶進(jìn)一步切割為成熟的miR-30a。目前關(guān)于miR-30a 與腫瘤關(guān)系的研究較多。如Ren 等[18]發(fā)現(xiàn)，在透明細(xì)胞腎組織和細(xì)胞中，miR-30a 明顯下調(diào)，與晚期TNM 分期和預(yù)后不良相關(guān)，且表現(xiàn)出有效的抗腫瘤特性。Cai 等[19]認(rèn)為，在順鉑化療后卵巢癌患者血清以及順鉑耐藥細(xì)胞中，miR-30a 的表達(dá)顯著降低，其過表達(dá)可抑制順鉑誘導(dǎo)的自噬并促進(jìn)耐藥細(xì)胞凋亡。關(guān)于miR-30a 在GIST 中的作用，有研究報(bào)道顯示其在GIST 中水平較低，并且與伊馬替尼的敏感性呈正相關(guān)，并被證實(shí)是一種伊馬替尼敏化劑，為克服該病的化療耐藥性提供了新的希望，提示miR-30a 可能與該病的發(fā)生及化療敏感性有關(guān)[20]。

TGF-β/Smad2 信號(hào)通路是一種在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮多種功能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及其他細(xì)胞功能[21-23]。TGF-β 是機(jī)體內(nèi)常見的一種分泌性細(xì)胞因子，作為一組多功能性多肽，其家族中以TGF-β1 活性最高，可被整連蛋白復(fù)合物激活，與TGF-β2 受體結(jié)合后磷酸化TGF-β1 受體的胞內(nèi)區(qū)域，磷酸化TGF-β1 受體又進(jìn)一步磷酸化Smad2 蛋白，使其與Smad4 蛋白結(jié)合，形成Smad2/4復(fù)合物，后者轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)與其他轉(zhuǎn)錄因子或輔助因子相互作用，調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)。既往研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β 信號(hào)通路在腫瘤中被激活，且與miRNA 具有一定關(guān)聯(lián)，具體表現(xiàn)為誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移；刺激血管生成，為腫瘤提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)；抑制免疫系統(tǒng)的抗腫瘤反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視和清除；調(diào)節(jié)基因組穩(wěn)定性，促進(jìn)染色體不穩(wěn)定性和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，導(dǎo)致基因突變和表達(dá)異常[24-26]。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)miR-30a 表達(dá)可抑制TGF-β 信號(hào)通路蛋白表達(dá)，且TGF-β1 是miR-30a的一個(gè)靶基因，提示miR-30a 可能通過靶向調(diào)控TGF-β 信號(hào)通路參與GIST 細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控。

綜上所述，miR-30a 在GIST 中表達(dá)降低，提高其表達(dá)可能通過靶向抑制TGF-β 信號(hào)通路活性抑制GIST 細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)其凋亡。