馬博文，周佳，趙帥，羅宇，李海峰，屈建航

（河南工業(yè)大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001）

微生物多糖是微生物菌體細胞在生長代謝過程中產(chǎn)生的一類高分子聚合物[1]，能在高壓、高滲、高酸堿等環(huán)境下保護自身免受損傷[2]。根據(jù)在細胞中的位置，微生物多糖可分為胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）、胞壁多糖和胞內(nèi)多糖[3]。其中微生物EPS 具有乳化[4]、抗氧化[5]、抗腫瘤[6]、抗炎[7]及免疫調(diào)節(jié)[8]等特性，被廣泛應用于醫(yī)療、護膚、食品、制藥、石油開采等領域，同時因易分離、周期短、雜質(zhì)少等優(yōu)點而備受學者關(guān)注[9]。

隨著社會經(jīng)濟增長和人們生活水平的提高，微生物EPS 產(chǎn)品的市場需求越來越大。當前微生物EPS主要來自于乳酸菌、芽孢桿菌（Bacillus）以及鏈霉菌（Streptomyces）等[10]，多數(shù)菌種的產(chǎn)糖能力和性能仍有待進一步提高。良好、新穎的產(chǎn)EPS 菌種來源和獨特的生物活性開發(fā)，以及合適的發(fā)酵產(chǎn)糖工藝構(gòu)建，仍是當前微生物EPS 的研究熱點和進一步開拓應用市場的必要前提。

乳化是微生物EPS 的重要功能之一，能使疏水性底物分散成細小的液滴，可作為天然乳化劑應用于相關(guān)行業(yè)。王純瑋等[11]研究發(fā)現(xiàn)，兩種開菲爾EPS 在1 h時的乳化活性分別為51.68%和48.26%，高于瓜爾豆膠和黃原膠，能在溶液中長時間保持乳化液狀態(tài)，該多糖產(chǎn)品可作為乳化劑應用于食品行業(yè)。Vinothkanna等[12]研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌AG-06 EPS 的絮凝和乳化活性分別為71.83%和67.79%，該菌所產(chǎn)EPS 經(jīng)純化后可作為生物絮凝劑應用于食品和石油行業(yè)。

水體沉積物蘊藏豐富的微生物菌種資源。本研究從太湖沉積物中篩選獲得一株產(chǎn)EPS 的細菌TH21-44，經(jīng)鑒定為當前微生物EPS 報道較少的副球菌屬，并對其產(chǎn)糖能力、發(fā)酵條件和乳化性能進行研究，以期為豐富微生物EPS 生產(chǎn)來源、性能開發(fā)和應用提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株TH21-44：太湖沉積物中篩選獲得；葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、硝酸鈉、尿素、無水乙醇、苯酚（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；酵母浸粉、胰蛋白胨、酪蛋白、丙酮酸鈉、瓊脂粉：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；氯仿、正丁醇：四川西隴科學股份有限公司。

R2A 培養(yǎng)基[13]：酵母浸粉0.5 g/L、胰蛋白胨0.5 g/L、酸水解酪蛋白0.5 g/L、葡萄糖0.5 g/L、可溶性淀粉0.5 g/L、K2HPO4·3H2O 0.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L、丙酮酸鈉0.3 g/L，pH7.0～7.2，115 ℃滅菌30 min。

改良R2A 培養(yǎng)基：酵母浸粉0.5 g/L、胰蛋白胨0.5 g/L、酸水解酪蛋白0.5 g/L、葡萄糖1.0 g/L、K2HPO4·3H2O 0.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L、丙酮酸鈉0.3 g/L，pH7.0～7.2，115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

UV-2450 紫外可見分光光度計：日本SHIMADZU（島津） 公司；VS-840-2 潔凈工作臺、BXM-30R 立式壓力蒸汽滅菌鍋、BSD-YX2400 智能精密搖床：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 細菌種屬鑒定

參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]對菌株TH21-44進行形態(tài)觀察和生理生化試驗，采用十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-堿裂解法提取細菌的基因組DNA，使用E.coli 16S rRNA 基因通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）[13]，對其16S rRNA 基因進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行核苷酸序列測定，所得序列提交GenBank 數(shù)據(jù)庫中對比，并用MEGA-X 軟件[15]以鄰接法（neighbor-joining）[16]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化結(jié)果和16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，確定菌株的種屬地位。

1.3.2 生長曲線及產(chǎn)EPS 曲線

菌株TH21-44 于改良R2A 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d，挑取新鮮菌體接入改良R2A 液體培養(yǎng)基，28 ℃、150 r/min 培養(yǎng)24 h，調(diào)整OD600為0.8 用作種子液，以5%（體積比）接種量接入改良R2A 液體培養(yǎng)基，同條件培養(yǎng)，不同時間（0、12、18、24、36、42、48、60、66、72、84 h）采集發(fā)酵液樣品，測定OD600，繪制生長曲線。發(fā)酵液樣品以8 000 r/min 離心10 min，上清液采用硫酸苯酚法[17]測定EPS 含量，繪制菌株產(chǎn)EPS 曲線。

1.3.3 發(fā)酵產(chǎn)EPS 條件的單因素優(yōu)化

以改良R2A 培養(yǎng)基為基礎發(fā)酵培養(yǎng)基，初始條件為pH7.0、接種量5%、溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min、發(fā)酵時間42 h。分別考察1.0 g/L 碳源（葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖）及碳源濃度（0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 g/L）、1.0 g/L 氮源（酵母浸粉、胰蛋白胨、酸水解酪蛋白、尿素、氯化銨、硝酸鈉）及氮源濃度（0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 g/L）、溫度（25、28、31、34、37 ℃）、pH 值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）和接種量（1%、3%、5%、7%、9%）對菌株TH21-44 產(chǎn)EPS 量的影響。

1.3.4 發(fā)酵條件響應面試驗設計

在單因素試驗結(jié)果的基礎上，使用Design-Expert 12 軟件進行響應面試驗設計，以葡萄糖濃度（A）、接種量（B）和pH 值（C）3 個因素作三因素三水平的響應面試驗，EPS 產(chǎn)量（Y）為響應值，優(yōu)化菌株產(chǎn)EPS 的綜合條件。響應面試驗因素與水平如表1 所示。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗因素水平Table 1 Response surface factors and levels for optimization of fermentation conditions

1.3.5 EPS 乳化性能測定

參照楊晨璐等[18]的方法提取菌株TH21-44 在優(yōu)化條件下發(fā)酵所產(chǎn)的EPS。收集發(fā)酵液，55 ℃減壓濃縮為原體積的1/5，加入1/4 體積的Sevage 試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1，體積比）反復振蕩脫蛋白，8 000 r/min 離心10 min 直至兩相之間無蛋白層，上清液用活性炭除色素，裝入透析袋中透析48 h（截留分子量為2 000 Da），每6 h 換一次水，后加入3 倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置過夜，收集沉淀并用蒸餾水復溶，冷凍干燥得TH21-44 粗EPS。配制5 mg/mL 的粗EPS 溶液并測定其多糖含量，以芝麻油、大豆油、橄欖油、葵花油、汽油、柴油和二甲苯作乳化底物，吐溫80 為陽性對照，以EPS∶底物=2∶3（體積比）混合，利用高速勻漿機劇烈攪拌2 min，精確測量24、48、72 h 的乳化高度和液體總高度，以乳化高度/總高度評估對油類和烴類的乳化能力[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗設置3 個平行，結(jié)果用平均值±標準差表示，運用Origin 9.0 軟件作圖，單因素試驗數(shù)據(jù)用IBM SPSS Statistics 26 軟件進行顯著性分析，響應面試驗設計和分析運用Design-Expert 12 軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌種屬鑒定結(jié)果

形態(tài)學和生理生化結(jié)果表明，菌株TH21-44 為革蘭氏陰性菌，球狀，菌體直徑0.5～1.0 μm，于R2A 培養(yǎng)基上菌落顯淺橙色，圓形，較濕潤，接觸酶、氧化酶、脲酶、硝酸鹽/亞硝酸鹽還原及吲哚產(chǎn)生陽性，H2S、反硝化作用陰性，不能降解淀粉、明膠和纖維素，生長條件為25～37 ℃、0%～1% NaCl、pH6.5～8.0。

基于菌株TH21-44 的16S rRNA 基因序列（Gen－Bank 登錄號OP422630），采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 菌株TH21-44 基于16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain TH21-44 based on 16S rRNA gene sequences

由圖1 可知，TH21-44 16S rRNA 基因與Paracoccus aeridis JC501 的同源性最高，相似度98.54%，且二者聚在同一分支。綜合形態(tài)和生理生化特征以及16S rRNA 系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，初步鑒定菌株TH21-44 為副球菌（Paracoccus sp.）。

微生物EPS 來源廣，種類多，菌種資源開發(fā)和應用仍是當前相關(guān)領域研究的重點和前提。副球菌屬（Paracoccus sp.）是由Davis 等[20]于1969 年提議并進行描述，該屬大多為革蘭氏陰性菌，球狀或短桿狀，過氧化氫酶和氧化酶陽性，具有不同的代謝特性[21]。Raguénès 等[22]描述了副球菌亞種玉米黃原菌的胞外多糖EPS1 和EPS2，其中EPS1 硫酸鹽含量高，有潛力應用于化妝品領域。其他關(guān)于副球菌產(chǎn)EPS 的研究鮮有報道。

自湖泊沉積物中分離篩選到的產(chǎn)EPS 副球菌TH21-44，所處環(huán)境低溫少氧，分類同源最近的菌株P(guān).aeridis JC501，分離于印度附生蘭植物根樣，菌落干燥，質(zhì)地緊密，無產(chǎn)EPS 的明顯特征[23]。

2.2 生長曲線及產(chǎn)胞外多糖曲線

菌株TH21-44 生長曲線和產(chǎn)EPS 曲線見圖2。

圖2 菌株TH21-44 的生長曲線和產(chǎn)胞外多糖曲線Fig.2 Growth curve and exopolysaccharide production curve of strain TH21-44

由圖2 可知，TH21-44 的生長和產(chǎn)EPS 變化趨勢一致，但EPS 曲線時間上稍滯后，18 h 前菌株處于指數(shù)生長期，培養(yǎng)基中葡萄糖消耗速率大于EPS 產(chǎn)生速率，故曲線呈現(xiàn)下降趨勢，在42 h 時菌株的EPS 產(chǎn)量最高，為（59.33±3.14）μg/mL，42 h 后EPS 產(chǎn)量有所下降，推測是由于培養(yǎng)基中葡萄糖消耗殆盡，少部分菌株會利用EPS 進行緩慢生長，減少EPS 積累[24]。

2.3 菌株TH21-44 發(fā)酵產(chǎn)EPS 單因素條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 碳源及其濃度

碳源及其濃度對菌株TH21-44 生長和EPS 產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖3。

圖3 碳源及葡萄糖濃度對菌株TH21-44 胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of carbon sources and glucose concentration on the exopolysaccharide production of strain TH21-44

由圖3A 可知，菌株以葡萄糖作為碳源時產(chǎn)糖效果最佳，對應EPS 產(chǎn)量為（52.10±2.04）μg/mL。從生物量來看，菌株以葡萄糖為碳源時生物量最高，而對其它5 種碳源的利用率明顯偏低；由圖3B 可知，增大葡萄糖濃度，菌株EPS 產(chǎn)量先增加后減少，當葡萄糖濃度為5.0 g/L 時，EPS 的產(chǎn)量達到最高值，為（130.54±3.07）μg/mL。因此選擇濃度為5.0 g/L 的葡萄糖為碳源進行后續(xù)試驗。

2.3.2 氮源及其濃度

氮源及其濃度對菌株TH21-44 生長和EPS 產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖4。

圖4 氮源及酵母浸粉濃度對菌株TH21-44 胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of nitrogen sources and yeast extract concentration on the exopolysaccharide production of strain TH21-44

由圖4A 可知，當酵母浸粉作為氮源時，菌株EPS 產(chǎn)量最高為（48.93±0.57）μg/mL，尿素和胰蛋白胨次之，酸水解酪蛋白作氮源的產(chǎn)糖量最低，以尿素、氯化銨和硝酸鈉作為氮源時，菌株生長同時受限；由圖4B 可知，當酵母浸粉濃度為3.0 g/L 時，菌株EPS 產(chǎn)量達到峰值，為（68.05±3.35）μg/mL，繼續(xù)增大酵母浸粉濃度，菌體量和EPS 產(chǎn)量均下降。因此選擇濃度3.0 g/L的酵母浸粉為氮源進行后續(xù)試驗。

2.3.3 溫度、pH 值和接種量優(yōu)化

不同溫度、pH 值和接種量對菌株TH21-44 產(chǎn)EPS 的影響見圖5。

圖5 溫度、pH 值和接種量對菌株TH21-44 胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of temperature,pH,and inoculum size on the exopolysaccharide production of strain TH21-44

由圖5A 可知，菌株在28 ℃時發(fā)酵產(chǎn)量最高，EPS產(chǎn)量為（46.77±3.41）μg/mL，隨著溫度的增加，其產(chǎn)糖量逐漸趨于平穩(wěn)；由圖5B 可知，在pH6.0～8.0 時，隨著pH 值的增加，菌株EPS 產(chǎn)量先增加后減少，在pH7.0 時產(chǎn)糖量達到最高，為（50.74±0.34）μg/mL，其他pH 值條件下，EPS 產(chǎn)量較低；由圖5C 可知，以5%接種量培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)糖的效果最佳，EPS 產(chǎn)量達到（44.05±3.63）μg/mL，菌株生物量也達到最高值。因此，分別選取溫度28 ℃、pH7.0 和接種量5%進行后續(xù)分析。

2.4 響應面試驗結(jié)果

2.4.1 單因素試驗方差分析

運用SPSS Statistics 26 軟件進行方差分析，確定對EPS 產(chǎn)量影響最顯著的因素，結(jié)果見表2。

表2 IBM SPSS Statistics 方差分析Table 2 Analysis of variance in IBM SPSS Statistics

由表2 可知，葡萄糖濃度、酵母浸粉濃度、pH 值和接種量對EPS 的產(chǎn)量均具有極顯著的影響（P<0.01），而溫度對EPS 產(chǎn)量具有顯著影響（P<0.05），影響的主次順序為葡萄糖濃度>酵母浸粉濃度>接種量>pH 值>溫度。

2.4.2 響應面試驗設計及結(jié)果分析

氮源濃度過高對菌株有一定毒害作用，影響微生物EPS 的積累，因此選取葡萄糖濃度（A），接種量（B）和pH 值（C）為主要影響因素，EPS 產(chǎn)量（Y）為響應值，設計三因素三水平的Box-Behnken 試驗，結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4，各因素交互作用對EPS 產(chǎn)量影響的三維模型圖見圖6。

圖6 各因素交互作用對EPS 產(chǎn)量影響的響應面與等高線Fig.6 Response surface plots and contour plots of the effects of the interactions between factors on the yield of exopolysaccharides

表3 Box-Behnken 試驗設計及結(jié)果Table 3 Box-Behnken design and test results

表4 二次回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance of the quadratic regression equation

對Box-Behnken 試驗設計數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合，得到響應值Y 與3 個因素A、B、C 的回歸方程：Y =179.23 +36.49A +11.72B +2.37C-5.31AB +14.91AC +2.67BC-71.88A2-7.34B2-17.78C2。

由表4 可知，模型F 值為84.78，P<0.000 1,差異極顯著，表明模型具有較高的可信度，方程式中一次項A 和B 對菌株產(chǎn)EPS 的影響極顯著，C 影響不顯著，各個因素影響的順序為A>B>C；結(jié)合圖6 可知，A和C 的響應曲面走勢最陡，且A 和C 的等高線呈橢圓形，說明兩者交互作用影響極顯著，交互項因素影響的次序為AC＞AB＞BC；二次項A2和C2影響極顯著，B2影響顯著。失擬項P=0.142 3，差異不顯著，表明模型擬合效果好；相關(guān)系數(shù)R2=0.990 9，表明模型回歸效果好，R2adj和R2pre分別為0.979 2 和0.897 9，兩者相差遠小于0.2，信噪比=27.035 2>4，表明模型更精準，真實性強。因此，該模型可以用來解釋發(fā)酵條件對菌株TH21-44產(chǎn)EPS 的影響。

2.4.3 發(fā)酵最優(yōu)條件及驗證試驗

對響應面優(yōu)化所得模型進行數(shù)值分析，得到EPS產(chǎn)量最高值為188.99 μg/mL，對應最優(yōu)發(fā)酵條件為葡萄糖濃度7.160 g/L、接種量6.123%和pH7.112，其他條件為酵母浸粉3.0 g/L、K2HPO4·3H2O 0.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L 及丙酮酸鈉0.3 g/L。實際驗證操作按照葡萄糖濃度7.2 g/L、接種量6.1%和pH7.1，其他參數(shù)不變，該條件下測得菌株TH21-44 產(chǎn)EPS 的實際值為（188.89±0.91）μg/mL，與預測值一致，由此可知該模型能夠較好地預測菌株TH21-44 產(chǎn)EPS 的實際情況。

研究表明，Xu 等[25]通過攪拌速率、曝氣速率和分批補料的發(fā)酵模式使光滑念珠菌的EPS 產(chǎn)量提高了1.53 倍；孫建瑞等[26]采用響應面試驗對淡水微藻EPS的積累進行優(yōu)化，結(jié)果使其EPS 產(chǎn)量達到70.37 mg/L，是優(yōu)化前的1.62 倍。本研究采用響應面法優(yōu)化TH21-44 發(fā)酵產(chǎn)EPS，結(jié)果產(chǎn)量是優(yōu)化前的3.18 倍。

微生物培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件對EPS 的產(chǎn)量、生物活性及結(jié)構(gòu)表征有較大影響[27-29]。本研究當葡萄糖濃度增加到10 g/L 時，菌株TH21-44 的生物量和EPS產(chǎn)量均下降，這可能是因為葡萄糖濃度過高，增大環(huán)境滲透壓，從而導致細菌細胞吸收葡萄糖的效率降低，影響EPS 的產(chǎn)生[30]；當酵母浸粉濃度超過3 g/L 時，生物量和產(chǎn)糖量急劇下降，可能是由于高濃度氮源對微生物細菌有毒害作用，氮源被細菌代謝后產(chǎn)生銨態(tài)氮或硝態(tài)氮，一定程度上影響菌體生長，從而抑制EPS 的產(chǎn)生[31]，此外，氮源作為細菌合成蛋白質(zhì)、核酸以及其他能源物質(zhì)的前體，濃度過高會使菌株胞內(nèi)和胞外蛋白的合成量增加，從而影響后續(xù)的產(chǎn)物提純[32]。同時，高于28 ℃、偏酸以及偏堿的培養(yǎng)條件下，菌株TH21-44 生物量和EPS產(chǎn)量也有所下降，高溫、酸性或堿性環(huán)境會嚴重影響相關(guān)酶活和新陳代謝[33]；當接種量低于5%時，菌株生長緩慢，耗時耗力，接種量高于5%時，菌株生長迅速，衰亡期提前，菌體自溶釋放出EPS，被其他細菌細胞吸收利用，從而影響EPS 積累[34]。

2.5 菌株TH21-44 所產(chǎn)EPS 的乳化性能

本研究中制備所得粗EPS 溶液中多糖濃度為4.87 mg/mL，其乳化能力測試結(jié)果見表5。

表5 菌株TH21-44 胞外多糖對油類和烴類的乳化能力Table 5 Emulsification capacity of EPS produced by strain TH21-44 for oils and hydrocarbons %

由表5 可知，EPS 對油類和烴類的乳化能力在72 h內(nèi)均保持60%以上，其中對葵花油的乳化能力最強，24 h 時達到69.62%，優(yōu)于吐溫80 的乳化能力，且72 h的乳化能力僅下降1.52%，無顯著差異（P＜0.05），說明該EPS 對葵花油的乳化穩(wěn)定性較好，這樣的穩(wěn)定性在乳化芝麻油、大豆油、橄欖油和汽油上也有體現(xiàn)。

據(jù)報道，海氏芽孢桿菌CamB6 所產(chǎn)EPS 在24 h時對葵花油的乳化能力為62.73%[35]，泛菌屬BCCS 001 GH 所產(chǎn)EPS 在72 h 時對葵花油的乳化能力為50.60%，72 h 內(nèi)的乳化效果下降了2.30%[36]。相比之下，本研究中菌株TH21-44 的EPS 對葵花油的乳化能力及乳化穩(wěn)定性具有較強的優(yōu)勢，具備作為生物乳化劑應用于食品和洗滌行業(yè)的潛力。

4 結(jié)論

分離篩選獲得的高效產(chǎn)胞外多糖菌株TH21-44，經(jīng)鑒定為副球菌（Paracoccus sp.）；其EPS 最佳發(fā)酵條件為pH7.1、接種量6.1%、溫度28 ℃、葡萄糖7.2 g/L、酵母浸粉3.0 g/L、K2HPO4·3H2O 0.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L 及丙酮酸鈉0.3 g/L，該條件下EPS 產(chǎn)量為188.89 μg/mL，是優(yōu)化前的3.18 倍；該條件下所產(chǎn)EPS對油類和烴類具有良好的乳化性能，其中對葵花油的乳化能力最強，24 h 達到69.62%，72 h 時仍保持穩(wěn)定，能力明顯優(yōu)于吐溫80。本研究豐富了微生物EPS 的菌種來源，并對微生物EPS 的開發(fā)及其乳化性能應用，提供了重要的參考依據(jù)。