劉航航，潘瓊，羅慧婷，蔡克周，徐寶才，李沛軍

（合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一類(lèi)含有兩個(gè)或多個(gè)由碳原子和氫原子組成的強(qiáng)疏水性有機(jī)化合物，具有至少兩個(gè)凝聚或融合的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)[1]。PAHs 源于有機(jī)物的不完全燃燒和熱解，可以通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體內(nèi)造成危害[2]。由于雙環(huán)氧化合物的代謝激活會(huì)導(dǎo)致DNA 復(fù)制和突變錯(cuò)誤從而導(dǎo)致癌變，PAHs 被認(rèn)為對(duì)人體具有潛在的遺傳毒性和致癌性，易使人體罹患乳腺癌、肺癌和結(jié)腸癌等癌癥[3]。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）已經(jīng)將PAHs 分類(lèi)為1 類(lèi)致癌物、2A 類(lèi)致癌物和2B 類(lèi)致癌物[4]，其中研究較多的是1 類(lèi)致癌物苯并[a]芘（benzo [a] pyrene，BaP）和2B 類(lèi)致癌物苯并[a]蒽（benzo [a] anthracene，BaA）、（chrysene，CHR）和苯并[b]熒蒽（benzo [b]fluoranthene，BbFA。歐盟委員會(huì)（European Commission，EC）規(guī)定了煙熏肉制品中BaP和PAH4（BaA、CHR、BbFA 和BaP）的最大限量，分別為2.0 μg/kg 和12.0 μg/kg[5]。我國(guó)GB 2762—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品污染物限量》規(guī)定，肉及肉制品中BaP 的含量不得超過(guò)5 μg/kg[6]。為減少食品中PAHs危害物對(duì)人體健康的潛在危害，降低其含量具有重大意義。

目前，對(duì)食品中PAHs 的減少措施主要集中于物理和化學(xué)方法。比較常見(jiàn)的物理方法有改變煙熏方式和食品原料的預(yù)處理[7]等；在化學(xué)方法方面，通過(guò)向肉制品中添加醋和啤酒等物質(zhì)，利用其中酚類(lèi)物質(zhì)和抗氧化成分降低肉制品中PAHs[8]。然而，這些物理和化學(xué)方法大多昂貴、復(fù)雜和低效，甚至?xí)a(chǎn)生有毒的次生代謝物，使這些方法往往難以推廣和大規(guī)模實(shí)踐[9]。與此同時(shí)，隨著消費(fèi)者對(duì)良好生活質(zhì)量的要求不斷提高，消費(fèi)者更愿意接受綠色安全的方法。

近年來(lái)，通過(guò)生物學(xué)方法降解PAHs 受到廣泛關(guān)注。許多細(xì)菌已被證實(shí)通過(guò)代謝或共代謝降解PAHs，并且PAHs 降解酶和生物降解途徑是多樣的。在環(huán)境領(lǐng)域，Hadibarata 等[10]研究表明白腐真菌（Armillaria sp.）F022 可以將BaP 降解為苯并[a]芘-1，6-醌，1-羥基-2-苯甲酸和苯甲酸。在食品領(lǐng)域，乳酸菌和凝固酶陰性葡萄球菌（coagulase-negative staphylococci，CNS）是傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中最主要的細(xì)菌群，它們決定了產(chǎn)品的感官和安全特性[11]。Bartkiene 等[12]研究了乳酸菌對(duì)冷熏豬肉香腸中PAHs 的降低效果，結(jié)果表明乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）KTU05-7、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）KTU05-9和清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）KTU05-6 均能夠降低熏腸內(nèi)部PAH4 含量，其中L.sakei KTU05-6 對(duì)PAH4 具有較好的去除效果。CNS 可以通過(guò)蛋白質(zhì)水解和脂肪分解來(lái)促進(jìn)肉制品風(fēng)味的形成，還可改善肉制品色澤[13]。然而，關(guān)于其消減食品中危害物的相關(guān)報(bào)道鮮見(jiàn)。

本研究通過(guò)分析肉源CNS 菌株在模擬體系中對(duì)PAHs 的降低作用，篩選出消減PAHs 能力最強(qiáng)的菌株，并通過(guò)明確菌株消減方式、消減位置和消減關(guān)鍵成分，探究其消減作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PAHs 標(biāo)準(zhǔn)品（BaA、CHR、BbFA 和BaP）（純度＞99%）：北京北方偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院；鏈霉蛋白酶（EC 3.4.24.31）、結(jié)晶紫、阿拉伯樹(shù)膠粉；上海源葉生物科技有限公司；酸水解酪蛋白、辛基苯基聚氧乙烯醚：北京索萊寶科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、布拉德福德蛋白濃度測(cè)定試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、乙腈、無(wú)水乙醇（均為色譜級(jí)）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；除特殊標(biāo)記外其他試劑均為分析純。

受試菌株：木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）A2、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）C2 均分離于自然發(fā)酵風(fēng)干腸，馬胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum）E1 分離于風(fēng)鴨，小牛葡萄球菌（Staphylococcus vitulinus）CICC 10850：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

7.5%氯化鈉肉湯（sodium chloride broth，SCB）培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；甘露醇氯化鈉瓊脂（mannitol salt agar，MSA）培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

潔凈工作臺(tái)（AlphaClean 1300）：力康精密科技（上海）有限公司；振蕩培養(yǎng)箱（BSD-250）：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；臺(tái)式低速離心機(jī)（TDZ5-WS）：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；酶標(biāo)儀（SynergH1）：美國(guó)Bio-Tek 儀器公司；液相色譜儀（S-6000）：華譜科儀（北京）科技有限公司；水浴振蕩器（WE-3）：天津歐諾儀器股份有限公司；分光光度計(jì)（UV-6000PC）：上海元析儀器有限公司；靜音液晶超聲波清洗器（KS-7200XDS）：昆山潔力美超聲儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

在無(wú)菌環(huán)境下，用無(wú)菌接種環(huán)挑取葡萄球菌斜面上的一環(huán)菌泥，將其接入10 mL 無(wú)菌SCB 培養(yǎng)基中，隨后漩渦振蕩，將接過(guò)菌的SCB 培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱，在恒溫條件（37 ℃，150 r/min）下培養(yǎng)18 h 進(jìn)行活化。在無(wú)菌環(huán)境下，將活化后的SCB 培養(yǎng)基漩渦振蕩，通過(guò)無(wú)菌移液槍吸取0.2 mL 菌液接入10 mL 無(wú)菌SCB培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代，連續(xù)傳代培養(yǎng)2 次（37 ℃，18 h），第3 代菌液4 ℃冷藏備用。取10 mL 受試菌株第3 代菌液（1×108CFU/mL），離心（12 000×g，15 min，4 ℃）去上清液得全細(xì)胞。全細(xì)胞經(jīng)無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS，50 mmol/L，pH7.0）洗滌2 次，并溶解在10 mL PBS 中以獲得全細(xì)胞懸液（whole cell suspension，WCS）。

1.3.2 不同菌株對(duì)PAHs 消減能力的測(cè)定

不同菌株對(duì)PAHs 消減能力的評(píng)定參照Yousefi等[14]的方法并稍作修改。在PBS 添加10 ng/mL PAHs標(biāo)準(zhǔn)品，制備得到模擬體系。即向WCS 和PBS 中添加PAHs 標(biāo)準(zhǔn)品，使其最終濃度為10 ng/mL，其中PBS 作為對(duì)照組。培養(yǎng)（37 ℃，150 r/min，18 h）結(jié)束后檢測(cè)PAHs含量。

PAHs 含量測(cè)定參照Li 等[15]的方法并稍做修改，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）進(jìn)行。待測(cè)樣品經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾后，將其添加到2 mL 進(jìn)樣瓶中用于HPLC 檢測(cè)。色譜條件：在裝配熒光檢測(cè)器的高效液相色譜儀上進(jìn)行分離采用雙流動(dòng)相，A 相乙腈，B 相水。流動(dòng)相洗脫梯度：0～17.5 min，40%～100%乙腈；17.5～24.0 min，100%乙腈；24.0～25.5 min，40%乙腈；25.5～27.5 min，40%乙腈。熒光檢測(cè)器的激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)為BaA：274/382 nm；CHR：260/360 nm；BbFA：283/430 nm；BaP：285/410 nm。

1.3.3 S.equorum 不同細(xì)胞組分消減PAHs 能力的測(cè)定

參照Xiao 等[16]的方法并稍作修改。S.equorum WCS經(jīng)超聲破碎（600 W，工作2 s，間歇3 s，180 次，0 ℃）得全細(xì)胞提取液（whole cell extracts，WCE），將全細(xì)胞提取液離心（12 000×g，15 min，4 ℃）得胞內(nèi)提取液（intracellular extracts，IE） 和細(xì)胞碎片。將細(xì)胞碎片溶解在10 mL PBS 中，獲得細(xì)胞碎片懸液（cell debris suspension，CDS）。分別向WCS、WCE、CDS、IE 和10 mL PBS中添加PAHs 標(biāo)準(zhǔn)品，使其最終濃度為10 ng/mL，培養(yǎng)（37 ℃，150 r/min，18 h）結(jié)束后檢測(cè)PAHs 含量。

1.3.4 蛋白酶處理對(duì)S.equorum WCE 消減PAHs 效果的影響

參照O'Brien 等[17]的方法并稍作修改。將0.1 mL鏈霉蛋白酶溶液添加到10 mL S.equorum WCE 中，以不添加鏈霉蛋白酶作為對(duì)照，水?。?7 ℃，1 h）冷卻后，添加PAHs 標(biāo)準(zhǔn)品，使其最終濃度為10 ng/mL，培養(yǎng)（37 ℃，150 r/min，18 h）結(jié)束后檢測(cè)PAHs 含量。

1.3.5 S.equorum 中PAHs 降解酶活力的測(cè)定取上述制備的S.equorum IE 樣品，用于鄰苯二酚2，3-雙加氧酶、脂肪酶和α-淀粉酶活力的測(cè)定。

1.3.5.1 鄰苯二酚2，3-雙加氧酶活力

參照Xi 等[18]的方法并稍做修改。酶活性反應(yīng)體系：0.2 mL 鄰苯二酚（5 mmol/L），3 mL PBS（50 mmol/L，pH 8.0）和0.2 mL IE，測(cè)定其在3 min 內(nèi)、375 nm 處吸光度的變化。定義每分鐘1 μmoL 鄰苯二酚裂解產(chǎn)生2-羥粘糠酸半醛所需要的酶量為1 個(gè)酶活力單位U。鄰苯二酚2，3-雙加氧酶的酶活力按公式（1）計(jì)算。

式中：U 為酶活力，U/mL；A 為樣品吸光值；Vt為反應(yīng)總體積，mL；ε 為摩爾吸光系數(shù)；t 為反應(yīng)時(shí)間，min；d 為比色皿內(nèi)腔厚度，cm；Vs為粗酶液體積，mL。

通過(guò)布拉德福德蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度后，用公式（1）所得結(jié)果再除以每毫升粗酶液中所含蛋白含量，即可得酶的比活力。

1.3.5.2 脂肪酶活力

參照Wang 等[19]的方法并稍作修改。底物溶液的制備方法如下：取90 mg 對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯溶于30 mL乙腈后，將100 μL 對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯溶液加入到900 μL 含有0.1%阿拉伯樹(shù)膠和0.4% Triton X-100的50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液中。在37 ℃和150 r/min條件下孵育5 min 后，向樣品中加入50 μL IE，并在150 r/min 和37 ℃條件下再孵育5 min。用300 μL 的10% Na2CO3終止反應(yīng)?；旌衔锝?jīng)離心后測(cè)量410 nm處的吸光度。定義在37 ℃條件下，每分鐘釋放1 μmol對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenol）所需的酶量為1 個(gè)酶活力單位U。脂肪的酶活力按公式（2）計(jì)算。

式中：U 為酶活力，U/mL；A1為樣品吸光值；A0為樣品空白吸光值；K 為對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；C0為對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；n 為稀釋倍數(shù)；V1為反應(yīng)液體積，mL；V2為粗酶液體積，mL；t 為反應(yīng)時(shí)間，min。

通過(guò)布拉德福德蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度后，用公式（2）所得結(jié)果再除以每毫升粗酶液中所含蛋白含量，即可得酶的比活力。

1.3.5.3 α-淀粉酶酶活力

參照Bo?ic等[20]的方法并稍作修改。采用3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測(cè)定α-淀粉酶活力。將含有100 μL IE 和400 μL 1.0%可溶性淀粉的反應(yīng)混合物在PBS（50 mmol/L，pH7.0）中孵育（40 ℃，30 min）。通過(guò)加入1 mL DNS 試劑停止反應(yīng)，然后將混合物煮沸5 min，冷卻至室溫并用蒸餾水稀釋。淀粉水解過(guò)程中釋放的還原糖量通過(guò)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定。定義在40 ℃、pH7 條件下，每分鐘淀粉水解產(chǎn)生1 mg 葡萄糖所需要的酶量為1 個(gè)酶活力單位U。α-淀粉酶的酶活力按公式（3）計(jì)算。

式中：U 為酶活力，U/mL；m 為葡萄糖質(zhì)量，mg；n為稀釋倍數(shù)；V 為反應(yīng)所用淀粉酶原液體積，mL；t 為反應(yīng)時(shí)間，min。

通過(guò)布拉德福德蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度后，用公式（3）所得結(jié)果再除以每毫升粗酶液中所含蛋白含量，即可得酶的比活力。

1.3.6 熱失活S.equorum 對(duì)PAHs 消減作用的影響

參考Yousefi 等[14]的方法對(duì)S.equorum 進(jìn)行熱處理。WCS 經(jīng)熱處理（100 ℃，15 min）冷卻后，添加PAHs標(biāo)準(zhǔn)品，使其最終濃度為10 ng/mL，對(duì)照組不經(jīng)熱處理直接添加PAHs 標(biāo)準(zhǔn)品。培養(yǎng)（37 ℃，150 r/min，18 h）結(jié)束后通過(guò)離心（12 000×g，15 min，4 ℃）去除細(xì)胞，收集上清液用于檢測(cè)PAHs 含量。

1.3.7 S.equorum WCE 的傅里葉變換紅外光譜分析

參照Peng 等[21]的方法并稍做修改。S.equorum 的WCE 經(jīng)凍干機(jī)凍干后，采用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行光譜掃描，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 25.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各數(shù)據(jù)之間的顯著性差異（P<0.05）使用Duncan's 多重分析法進(jìn)行檢驗(yàn)，利用Origin 2017 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同CNS 菌株對(duì)PAH4 的消減效果

食品中將包括BaP 在內(nèi)的16 種多環(huán)芳烴列為食品系統(tǒng)的主要污染物，歐洲食品安全委員會(huì)（EFSA）建議用PAH4（BaA、CHR、BbFA 和BaP）代表食品中多環(huán)芳烴的產(chǎn)生和毒性水平，因此本研究將PAH4 作為篩選菌株的依據(jù)。在模擬體系中接種不同菌株對(duì)PAHs的消減效果見(jiàn)圖1。

圖1 不同菌株對(duì)PAH4 降低量的影響Fig.1 Effects of different bacteria on PAH4 reduction

由圖1 可知，接種組中PAH4 含量均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），即4 種葡萄球菌菌株均能顯著降低模擬體系中的PAH4（P<0.05）。S.xylosus A2、S.carnosus C2、S.equorum E1 和S.vitulinus CICC 10850 對(duì)BaA、CHR、BbFA 和BaP 的降低率分別為3.63%～12.14%、3.86%～8.69%、12.71%～17.11%和6.21%～15.12%。在所有待測(cè)菌株中，S.xylosus A2 和S.carnosus C2 降低PAH4 能力最弱，S.equorum E1 降低PAH4 能力最強(qiáng)，S.equorum E1 對(duì)BaA、CHR、BbFA 和BaP 的降低率分別達(dá)到15.79%、17.11%、13.54%和12.71%。不同的葡萄球菌菌株對(duì)PAHs 表現(xiàn)出不同的消減效果，這與Zhao等[22]的結(jié)果類(lèi)似，他們的研究表明，15 株乳酸菌均可去除無(wú)菌蒸餾水中的BaP，去除率為11%～67%。這主要由菌株特異性造成。后續(xù)試驗(yàn)以降低PAH4 能力最強(qiáng)的S.equorum E1 為研究對(duì)象，探究其對(duì)PAHs 的消減機(jī)理。

2.2 不同細(xì)胞組分對(duì)消減PAH4 的影響

為了明確S.equorum 各細(xì)胞組分對(duì)PAHs 的消減效果，比較了WCS、WCE、IE 和CDS 對(duì)PAHs 的消減效果。S.equorum 的WCS、WCE、CDS 和IE 對(duì)PAH4 降低率見(jiàn)圖2。

圖2 S.equorum 的WCS、WCE、CDS 和IE 對(duì)PAH4 降低率Fig.2 The reduction rate of PAH4 treated with the WCS，WCE，CDS and IE of S.equorum

如圖2 所示，WCS 組對(duì)BaA、CHR、BbFA 和BaP的降低率分別為15.79%、17.11%、13.54%和12.71%。WCE 組對(duì)BaA、CHR、BbFA 和BaP 的降低率分別為20.00%、19.98%、13.65%和14.00%，WCE 組對(duì)BaA 和CHR 的降低率顯著高于WCS 組（P<0.05），這表明超聲破碎處理提高了S.equorum 對(duì)PAHs 的降低效果，可能是超聲處理使細(xì)胞中更多的消減物質(zhì)暴露，PAHs更容易與消減物質(zhì)接觸作用的結(jié)果。Yousefi 等[14]研究發(fā)現(xiàn)超聲處理可以改變細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、增加其通透性，從而增加肽聚糖的可利用性，使細(xì)胞壁上產(chǎn)生新的結(jié)合位點(diǎn)?？梢?jiàn)，S.equorum 對(duì)PAHs 的消減可能與物理吸附途徑同時(shí)存在。WCE 組對(duì)PAH4 的降低率和CDS組不存在顯著差異（P>0.05），但顯著高于IE 組（P<0.05），這表明細(xì)胞碎片和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)都具有消減作用，從IE組的消減效果可得，S.equorum 對(duì)PAHs 的消減可能存在生物降解途徑。與本研究結(jié)果類(lèi)似，Zhao 等[22]研究表明植物乳桿菌（L.plantarum）CICC 22135 和戊糖乳桿菌（L.pentosus）CICC 23163 肽聚糖在去除BaP 中起重要作用，并且細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整程度影響B(tài)aP 去除效率。

2.3 S.equorum 生物降解PAH4 關(guān)鍵消減成分的確定

在生物降解PAHs 時(shí)，細(xì)菌中有多種酶及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物參與細(xì)菌對(duì)PAHs 的降解。為了確認(rèn)S.equorum中蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)（酶和蛋白質(zhì)產(chǎn)物）是否在消減PAHs中起關(guān)鍵作用，探究蛋白酶處理對(duì)S.equorum 消減PAHs 的影響。蛋白酶處理前后S.equorum 對(duì)PAH4 的消減效果如表1 所示。

表1 蛋白酶處理對(duì)S.equorum 消減PAH4 的影響Table 1 Effects of protease treatment on PAH4-decreasing ability of S.equorum

對(duì)照組（未經(jīng)蛋白酶處理）對(duì)BaA、CHR、BbFA 和BaP 的降低率分別為20.00% 、19.98% 、13.65% 和14.00%，蛋白酶處理組對(duì)BaA、CHR、BbFA 和BaP 的降低率分別為11.53%、13.77%、7.55%和1.61%。經(jīng)蛋白酶處理后，S.equorum 對(duì)PAH4 消減能力顯著下降（P<0.05），由此表明S.equorum 細(xì)胞片段上蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)（酶和蛋白質(zhì)產(chǎn)物）在消減PAHs 過(guò)程中起重要作用。Xiao 等[16]在探究戊糖乳桿菌R3 對(duì)N-亞硝胺降解時(shí)，發(fā)現(xiàn)其表層蛋白能顯著降低N-亞硝胺含量（P<0.05）。

2.4 S.equorum 生物降解PAH4 關(guān)鍵酶的探究

生物降解是在高度污染環(huán)境中去除PAHs 的主要途徑，Chen 等[23]研究表明枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）降低PAHs能力主要取決于它們是否具有參與芘降解的關(guān)鍵酶。已有研究表明，鄰苯二酚2，3-雙加氧酶（C23O）、脂肪酶和α-淀粉酶都與PAHs 和烴類(lèi)化合物的代謝有關(guān)[23-25]。C23O 是超二醇雙加氧酶家族的成員，催化鄰苯二酚和取代鄰苯二酚環(huán)的裂解效應(yīng)。Karimi 等[24]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌產(chǎn)生的淀粉酶和商業(yè)淀粉酶均能降解烴類(lèi)化合物。脂肪酶在油性烴類(lèi)的生物降解中也起重要作用[25]。因此，通過(guò)檢測(cè)S.equorum 中關(guān)鍵酶（C23O、脂肪酶和α-淀粉酶）的活性可以初步判斷PAHs 降解代謝途徑。

在S.equorum 中檢測(cè)到3 種酶活性如圖3 所示。

圖3 S.equorum 中C23O、脂肪酶和α-淀粉酶的比酶活Fig.3 Specific activity of C23O，Lipase and α-amylase in S.equorum

由圖3 可知，C23O、脂肪酶和α-淀粉酶的比酶活分別為56.65、266.92、3.31 U/mg，其中脂肪酶活性最高（P<0.05），這表明S.equorum 可能通過(guò)產(chǎn)生這些關(guān)鍵降解酶來(lái)降解PAHs。

2.5 熱失活S.equorum 對(duì)PAH4 的物理吸附作用

為了明確S.equorum 對(duì)PAHs 的去除是否存在物理吸附途徑，研究了細(xì)胞活性對(duì)消減PAHs 的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 細(xì)胞活性對(duì)S.equorum 消減PAH4 的影響Table 2 Effect of cell viability on PAH4-decreasing ability of S.equorum

由表2 可以看出，對(duì)照組對(duì)BaA、CHR、BbFA 和BaP的降低率分別為15.79%、17.11%、13.54%和12.71%，熱處理組對(duì)BaA、CHR、BbFA 和BaP 的降低率分別為28.77%、30.52%、25.41%和27.38%，S.equorum 經(jīng)熱處理后對(duì)PAH4 的降低能力顯著提升（P<0.05），這與Yousefi 等[14]的結(jié)果一致。Zhu 等[26]研究指出熱處理提高了乳酸菌對(duì)酚甲烷的結(jié)合去除能力。結(jié)合本研究結(jié)果可知，S.equorum 在熱處理后可能改變了細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生新的結(jié)合位點(diǎn)，增加了細(xì)胞對(duì)多環(huán)芳烴的吸附。Zhao 等[22]認(rèn)為乳酸菌對(duì)BaP 的去除不存在生物代謝，在PAHs 去除過(guò)程中細(xì)胞活性是不必要的。

2.6 S.equorum 對(duì)PAH4 的吸附官能團(tuán)分析

通過(guò)FTIR 分析S.equorum 的WCE 以識(shí)別與PAHs結(jié)合相關(guān)的潛在官能團(tuán)和可能的結(jié)合位點(diǎn)，獲取PAHs 消減過(guò)程中涉及官能團(tuán)的更多信息結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 S.equorum 全細(xì)胞提取液的傅里葉紅外分析Fig.4 Fourier transform infrared spectrum of the whole cell extracts of S.equorum

如圖4 所示，根據(jù)文獻(xiàn)[27]報(bào)道對(duì)L.pentosus R3主要吸收譜帶進(jìn)行歸屬：3 280.66 cm-1（—OH 的伸展振動(dòng)吸收）；2 927.14 cm-1（C—H 鍵的不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)吸收）；1 642.19 cm-1（酰胺Ⅰ帶中的C O 伸縮振動(dòng)吸收）；1 543.17 cm-1（酰胺Ⅱ帶中的N—H 鍵的彎曲振動(dòng)吸收和C—N 鍵的拉伸）；1 395.67 cm-1（羧基的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)）；1 230.79 cm-1（脂質(zhì)和多糖P O 的伸縮振動(dòng)）；1 062.49 cm-1（肽聚糖C—O 的伸縮振動(dòng)）。939.34 cm-1（羧酸面外彎曲振動(dòng)吸收）；858.30 cm-1（C—H 面外彎曲振動(dòng)吸收）。Xiao 等[28]表明官能團(tuán)（羥基、胺基等）除了引發(fā)范德華力，還可以引發(fā)各種分子水平的相互作用，這些基團(tuán)在白腐真菌吸附PAHs 過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。此外，這些化學(xué)基團(tuán)存在于多糖、蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)中，一些脂肪族和芳香族成分可能有助于S.equorum 對(duì)PAHs 物理吸附。

3 結(jié)論

在模擬體系中，受試4 株CNS 菌株對(duì)PAHs 都具有消減作用，其中S.equorum 效果最好。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，S.equorum 的WCS、WCE、IE 和CDS 對(duì)PAHs 均具有消減效果，且WCE 和CDS 對(duì)PAHs 消減效果最強(qiáng)（P<0.05）。蛋白酶處理使S.equorum WCE 對(duì)PAH4 消減能力顯著降低（P<0.05），說(shuō)明S.equorum 關(guān)鍵消減物質(zhì)為蛋白類(lèi)物質(zhì)；同時(shí)，在WCE 中檢測(cè)到PAHs 關(guān)鍵降解酶活性，表明S.equorum 消減PAHs 存在生物降解途徑。熱滅活處理使S.equorum 對(duì)PAH4 消減能力顯著提升（P<0.05），說(shuō)明S.equorum 消減PAHs 存在物理吸附途徑，并且—OH、C O、N—H、C—N 等官能團(tuán)參與了物理吸附過(guò)程。因此，S.equorum 可以通過(guò)物理吸附和生物降解兩種作用途徑消減PAHs。