李高衡，姚少軍，劉晗，袁美玉，戴真，周中凱

（天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

麥麩（wheat bran，WB）是小麥加工的主要副產(chǎn)物，富含膳食纖維、蛋白質(zhì)、低聚糖、植酸以及一系列生物活性物質(zhì)如黃酮類(lèi)化合物、多酚等，因此WB 具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和研究?jī)r(jià)值[1]。大量研究表明，由WB 中提取的多酚、黃酮和可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）等具有良好的抗氧化特性，而經(jīng)過(guò)蛋白酶酶解形成的多肽及其衍生物也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力[2]。盡管WB 具有良好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和應(yīng)用前景，但大多數(shù)WB 被用作釀酒或者動(dòng)物飼料，其價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)未得到充分利用[3]。

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis，BV）是一種益生菌，通過(guò)發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生非核糖體肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases，NRPSs），NRPSs 是一種多功能酶復(fù)合物，也是重要的非核糖體合成的肽，能夠催化刺激特定蛋白轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的氨基?；蝓ズ捅患せ铍逆I的氨基酸片段[4]。有報(bào)道稱(chēng)，BV 屬的成員顯示出廣譜的葡聚糖苷水解酶，可以對(duì)纖維素和木質(zhì)纖維素進(jìn)行水解[5]。

研究表明，蛋白酶酶解WB 得到的WB 蛋白水解物及其超濾組分表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化活性、腎素抑制作用和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制作用，還具有一定的降血壓作用[2]；蛋白酶處理的紫麥麩水解物及其多肽產(chǎn)物具有很強(qiáng)的抗氧化活性和超氧陰離子自由基清除能力，并具有良好的體外消化穩(wěn)定性[6]；WB 的水提取物可有效抑制抗原刺激的RBL-2H3 細(xì)胞中腫瘤壞死因子-α、環(huán)氧合酶-2 和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶等過(guò)敏性和炎癥介質(zhì)的脫顆粒和表達(dá)，從而抑制免疫球蛋白E/抗原誘導(dǎo)和化合物48/80 誘導(dǎo)的體內(nèi)過(guò)敏反應(yīng)[7]。WB 膳食纖維可以在腸道遠(yuǎn)端充當(dāng)結(jié)合酚類(lèi)物質(zhì)的載體，經(jīng)微生物發(fā)酵刺激有益細(xì)菌的生長(zhǎng)，改善和維持腸道健康[3]。

本文采用生物酶聯(lián)反應(yīng)釋放麥麩中的多肽，并開(kāi)展了抗氧化試驗(yàn)和體外發(fā)酵試驗(yàn)，對(duì)麥麩衍生多肽功能進(jìn)一步驗(yàn)證，旨在為植物源多肽提供一種高效、快速和高得率的制備方法，并為提高麥麩的綜合利用提供了一種新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥麩：山東省德州市發(fā)達(dá)面粉集團(tuán)有限公司；貝萊斯芽孢桿菌：天津科技大學(xué)糧油課題組實(shí)驗(yàn)室保藏；氫氧化鈉、無(wú)水碳酸鈉、酒石酸鉀鈉、無(wú)水硫酸銅、過(guò)硫酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、醋酸鈉、鐵氰化鉀、氯化鐵、乙醚、丙酮、濃硫酸、濃鹽酸、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；福林酚（Folin-Ciocalteu，F(xiàn)C）、牛血清白蛋白、沒(méi)食子酸、水溶性維生素E（Trolox）、抗壞血酸、2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2'-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸銨鹽）[2，2'-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ammonium salt），ABTS]、2，4，6-三吡啶基三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）：索萊寶生物科技有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動(dòng)立式蒸汽滅菌器（CT62A）：馳通儀器（上海）有限公司；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FD）：蘇州凈化設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩箱（ZHWY-2102C）：上海智城分析儀器制造有限公司；水浴恒溫振蕩器（TS-110XS）：上?？瞥綄?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；大容量高速冷凍離心機(jī)（GL-10MD）：湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；冷凍干燥機(jī)（Alpha 1-2 LD plus）：Marin Christ 公司（德國(guó)）；酶標(biāo)儀（Epoch2）：美國(guó)伯騰儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA）：上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；厭氧培養(yǎng)箱（YQX-Ⅱ）：上海溪乾儀器設(shè)備有限公司；氣相色譜儀（GC-2014C shimadzu）：日本島津公司；循環(huán)水真空泵（SHZ-D Ⅲ）：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酶液的準(zhǔn)備

從-80 ℃冰箱中取出BV 菌種，解凍后進(jìn)行活化和擴(kuò)培得到擴(kuò)培菌液。將擴(kuò)培菌液按2%的比例加入盧瑞亞-貝爾塔尼（Luria-Bertani，LB）肉湯中，37 ℃培養(yǎng)48 h后得到發(fā)酵液。將發(fā)酵液以4 000 r/min 離心15 min，上清液過(guò)超濾膜濃縮為原體積的1/6 得到的濃縮液即為貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵酶（Bacillus velezensis fermentation enzyme，BVFE）[8]。

1.3.2 WBEE 的制備

粗WB 過(guò)篩至沒(méi)有細(xì)粉篩出，按料液比1∶12（g/mL）加蒸餾水，浸潤(rùn)混勻后，調(diào)節(jié)體系pH8.0。分別按WB質(zhì)量的0.8%和2%加入堿性水解蛋白酶（alkaline hydrolysis protease，AHPE）和BVFE。封口后，于水浴搖床中60 ℃、160 r/min 反應(yīng)3 h 后，4 層紗布過(guò)濾。濾液經(jīng)4 000 r/min 離心20 min，收集上清液即為麥麩酶解提取物（wheat bran enzymatic extract，WBEE）粗液。將提取制備的新鮮WBEE 粗液過(guò)3 kDa 濾膜除去大分子量的蛋白和酶，所得濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮后于凍干機(jī)中冷凍干燥，制得WBEE 凍干粉。裝袋密封于-20 ℃保藏，備用[6]。麥麩水提取物（wheatbranaqueousextract，WBAE）的制備方法除了不加AHPE 和BVFE 外，其他步驟同上述。由麥麩水提液最后制備的凍干粉統(tǒng)稱(chēng)WBAE。

1.3.3 WBEE 生產(chǎn)工藝的優(yōu)化

1）料液比的確定：分別按照WB 與蒸餾水質(zhì)量體積比1∶8、1∶10、1∶12、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）制作反應(yīng)體系，以pH 值為6.8，AHPE 和BVFE 分別添加1%和2%，溫度為55 ℃置于恒溫水浴振蕩器中以160 r/min反應(yīng)4 h。

2）加酶量的確定：按照料液比1∶12（g/mL）加水，pH6.8，分別加入0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的AHPE；同時(shí)，開(kāi)展平行試驗(yàn)分別加入0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的BVFE。溫度為55 ℃置于恒溫水浴振蕩器中以160 r/min 反應(yīng)4 h。

3）pH 值的確定：按照料液比1∶12（g/mL）加水，將體系pH 值分別調(diào)節(jié)至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，待體系穩(wěn)定后，AHPE 和BVFE 分別添加0.8%和2%，55 ℃置于恒溫水浴振蕩器中，以160 r/min反應(yīng)4 h。

4）反應(yīng)時(shí)間的確定：按照料液比1∶12（g/mL）加水，調(diào)pH 值至8.0，待體系穩(wěn)定后，分別加入AHPE 和BVFE 為0.8%和2%，溫度為55 ℃置于恒溫水浴振蕩器中以160 r/min 分別反應(yīng)0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6 h。

5）反應(yīng)溫度的確定：按照料液比1∶12（g/mL）加水，調(diào)pH 值至8.0，待體系穩(wěn)定后，分別加入AHPE 和BVFE 為0.8%和2%，反應(yīng)溫度分別調(diào)為35、40、45、50、55、60、65、70 ℃以160 r/min 反應(yīng)3 h。

1.3.4 WBEE 成分的測(cè)定

1.3.4.1 WBEE 提取率的測(cè)定

對(duì)經(jīng)冷凍干燥制得的WBEE 和WBAE 的提取率進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算。準(zhǔn)確量取適量新鮮制備的麥麩提取物（wheat bran extract，WBE）原液置于玻璃容器中，并記錄溶液體積V 和玻璃容器質(zhì)量m1。將樣品凍干后，立即稱(chēng)量玻璃器皿和樣品質(zhì)量記為m2。采用理想模型法，默認(rèn)1 g WB 可以提取出12 mL WBE。WBE 得率（X，g/100 g）的計(jì)算公式如下。

1.3.4.2 WBEE 中可溶性膳食纖維的測(cè)定

SDF 的測(cè)定采用AOAC 方法[9]。首先，準(zhǔn)確稱(chēng)量（1.000±0.001）g 的樣品，一式3 份。加入2 mL 無(wú)水乙醇、35 mL 50 mmol/L 馬來(lái)酸緩沖液、α-淀粉酶和淀粉糖苷酶（10 萬(wàn)U/g）各5 mL。在37 ℃的水浴中攪拌下反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，向體系中加入3 mL 0.75 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷（Tris）堿溶液，以調(diào)整體系的pH 值至約8.2。取出使體系冷卻至37 ℃，加入4.0 mL 2 mmol/L乙酸，將pH 值調(diào)整到約4.5，然后分別加入胰蛋白酶和胃蛋白酶（1.5 萬(wàn)U/g）各0.1 mL，反應(yīng)30 min。抽濾后冷卻至室溫，加入4 倍體積的乙醇，攪拌并在室溫下放置過(guò)夜。然后，以10 000 r/min 的速度離心10 min，除去上清液，并將殘余物烘至恒重。SDF 提取率（X，g/100 g）計(jì)算公式如下。

式中：m0為待測(cè)樣品質(zhì)量，g；m1為烘至恒重的離心杯質(zhì)量，g；m2為離心杯和烘烤至恒重的可溶性膳食纖維塊總質(zhì)量，g。

1.3.4.3 WBEE 中多肽的測(cè)定

在WBEE 工藝優(yōu)化中多肽含量的測(cè)定采用勞瑞法[10]。具體方法如下，酒石酸溶液A 與新鮮配制的光敏試劑溶液B 以100∶1（體積比）混合配制成堿性酒石酸銅工作液。取0.5 mL 待測(cè)液，加入1mL 酒石酸銅工作液，在室溫下孵育10 min。加入125 μL FC 試劑，渦旋10 s 搖勻反應(yīng)液。靜置30 min 后，在Epoch2 酶標(biāo)儀中測(cè)定720 nm 處吸光度。多肽含量以每100 mL WBE 的等效牛血清蛋白毫克當(dāng)量（mg/100 mL）表示。每個(gè)樣品測(cè)試均重復(fù)3 次[11]。

多肽的準(zhǔn)確定量采用GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測(cè)定凱氏定氮法》的方法對(duì)WBE 中多肽含量進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算[12]。

1.3.5 抗氧化能力的測(cè)定

1.3.5.1 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定

ABTS+自由基清除能力測(cè)定方法采用Zheng 等[13]的試驗(yàn)方法并進(jìn)行稍作修改。將7 mmol/L 的ABTS 溶液和2.45 mmol/L 的K2S2O2溶液按體積比1∶1 混合，避光靜置12～16 h。用50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液梯度稀釋到在734 nm 處的吸光度為0.70±0.02 時(shí)，即完成ABTS工作液的制備（現(xiàn)用現(xiàn)配）。分別取50 μL 的待測(cè)樣液、去離子水、0.02～0.2 mmol/L 水溶Trolox 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加150 μL 的ABTS 工作液，輕微振蕩混勻，室溫避光靜置6 min 后在Epoch2 酶標(biāo)儀中測(cè)定734 nm 處的吸光度。每組樣品做3 個(gè)平行樣孔。

1.3.5.2 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定

在2 mL 試管中分別加入1 mL 0～0.8 mmol/L 的醇溶Trolox 標(biāo)準(zhǔn)液、待測(cè)液，再加入1 mL 0.2 mmol/L 的DPPH 工作液?？瞻捉M：1 mL 95 %乙醇與1 mL 去離子水混合。將混合物渦旋混合30 s，室溫避光反應(yīng)30 min。待反應(yīng)結(jié)束后，在Epoch2 酶標(biāo)儀中測(cè)定517 nm 的吸光度。分別以Trolox 的濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[14]。

1.3.5.3 還原能力的測(cè)定

向100 μL 待測(cè)液、0.005～0.5 mmol/L 的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)液中分別加入0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液和1 g/100 mL K3Fe（CN）6各250 μL，混合后，在50 ℃下反應(yīng)20 min。加入250 μL 10%三氯乙酸混勻，隨后10 000 r/min 離心3 min，獲得250 μL 上清液。向上清液中加入250 μL 的蒸餾水和125 μL 的0.1%氯化鐵，反應(yīng)液上下?lián)u勻，室溫避光反應(yīng)10 min。每個(gè)樣品做3 個(gè)平行，在Epoch2 酶標(biāo)儀中測(cè)定700 nm 的吸光度。

1.3.5.4 總抗氧化值的測(cè)定

樣品的總抗氧化值采用鐵還原抗氧化能力（ferricion reducingantioxidantpower，F(xiàn)RAP）來(lái)測(cè)定[16]。將10mmol/L TPTZ 溶液、20 mmol/L 的FeCl3溶液和0.3 mol/L 的醋酸緩沖溶液（pH3.6） 按體積比1:1∶10 混合配制成FRAP 工作液，4 ℃避光保存，用時(shí)37 ℃預(yù)熱20 min。向50 μL 待測(cè)液和0.01～2 mmol/L 的Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入950 μL FRAP 工作液，37 ℃避光反應(yīng)30 min。取200 μL 的反應(yīng)液放入酶標(biāo)板中在593 nm 處于Epoch2 酶標(biāo)儀測(cè)吸光度。

1.3.6 WBEE 體外發(fā)酵分析

體外模擬腸道微生物發(fā)酵試驗(yàn)參照Catarina 等[17]的試驗(yàn)方法測(cè)定。

1）發(fā)酵前準(zhǔn)備：分別稱(chēng)取50 mg WBEE、WBAE 于10 mL 離心管中，用于體外發(fā)酵試驗(yàn)。培養(yǎng)基的配制按照表1 進(jìn)行，配制好后進(jìn)行高壓滅菌。待用時(shí)再加入維生素K 和氯化血紅素。

表1 體外模擬人體腸道發(fā)酵培養(yǎng)基配料Table 1 Ingredients of in vitro simulated human intestinal fermentation medium

2）發(fā)酵液的制備：提前一周找到8 名無(wú)益生菌制品攝入、無(wú)抗生素?cái)z入、無(wú)腸胃消化道疾病、身體健康的自愿者，男女各4 名。試驗(yàn)當(dāng)天，收集其糞便。分別稱(chēng)量相同質(zhì)量的糞便，以1∶3（g/mL）加入PBS 對(duì)糞便進(jìn)行勻漿。4 層紗布過(guò)濾，濾液加入已滅菌并添加了維生素K 和氯化血紅素的培養(yǎng)基，混合均勻后即為發(fā)酵液。

3）發(fā)酵樣品處理：向裝有樣品的管中加入5 mL發(fā)酵液，以不加WBE 樣品為對(duì)照組。在厭氧培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)0、6、12、24 h。對(duì)照組分別培養(yǎng)0、6、12、24 h。

4）短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）的測(cè)定：按照Wang 等[18]的方法，對(duì)發(fā)酵好的樣液中的SCFAs 進(jìn)行測(cè)定。對(duì)腸道發(fā)酵環(huán)境的pH 值以及菌群濃度進(jìn)行測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Office 2019、Origin 2021 等軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算處理、數(shù)據(jù)分析和作圖分析。采用SPSS 26 軟件對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，包括正態(tài)分析、方差齊性分析、單因素方差分析。通過(guò)Duncan 檢驗(yàn)確定試驗(yàn)組間差異的顯著性（p<0.05）。結(jié)果表述為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 WBEE 制備工藝優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 料液比最優(yōu)條件的確定

料液比對(duì)多肽含量和抗氧化能力的影響見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)多肽含量和抗氧化能力的影響Fig.1 Effect of ratio of material to solvent on peptide content and antioxidant capacity

由圖1 可知，料液比1∶8～1∶30（g/mL）的變化過(guò)程中，多肽含量逐漸升高，在料液比1∶20（g/mL）處基本達(dá)到穩(wěn)定值（圖1a）。FRAP 在料液比為1∶12（g/mL）時(shí)達(dá)到峰值，后逐漸下降并趨于平穩(wěn)波動(dòng)趨勢(shì)（圖1b）?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)情況和水資源節(jié)約問(wèn)題，料液比最優(yōu)條件確定為1∶12（g/mL）。

2.1.2 加酶量的確定

AHPE 添加量對(duì)多肽含量和抗氧化能力的影響見(jiàn)圖2。

圖2 AHPE 添加量對(duì)多肽含量和抗氧化能力的影響Fig.2 Effect of AHPE addition on peptide content and antioxidant capacity

由圖2 可知，隨著AHPE 添加量的增加，多肽含量及FRAP 均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)且在0.8%處達(dá)到峰值，然后隨著添加量的增加，趨于平穩(wěn)波動(dòng)。這可能是底物已經(jīng)被酶充分催化水解，酶添加量超過(guò)0.8%時(shí)出現(xiàn)冗余。因此，0.8%是AHPE 的最優(yōu)添加量。

BVFE 添加量對(duì)多肽含量和抗氧化能力的影響見(jiàn)圖3。

圖3 BVFE 添加量對(duì)多肽含量和抗氧化能力的影響Fig.3 Effect of BVFE addition on peptide content and antioxidant capacity

如圖3 所示，BVFE 添加量從0.25%增加到2%時(shí)，隨著B(niǎo)VFE 添加量的增加，多肽含量及FRAP 值均呈現(xiàn)穩(wěn)定上升的趨勢(shì)。在達(dá)到2%后，隨著添加量的增加，多肽含量趨于穩(wěn)定波動(dòng)狀態(tài)；而FRAP 值在2%出達(dá)到峰值，推測(cè)當(dāng)酶添加量大于或等于2%時(shí)，底物被酶充分催化水解。因此，2%的添加量是BVFE 的最優(yōu)添加量。

2.1.3 pH 值的確定

pH 值對(duì)多肽含量和抗氧化能力的影響見(jiàn)圖4。

圖4 pH 值對(duì)多肽含量和抗氧化能力的影響Fig.4 Effect of pH value on peptide content and antioxidant capacity

由圖4 可知，在固定其他條件不變的情況下，pH值從4.5 逐漸升高到8.0，多肽含量及FRAP 均呈現(xiàn)穩(wěn)定上升的趨勢(shì)；并在pH 值為8.0 時(shí)，各指標(biāo)達(dá)到峰值；當(dāng)繼續(xù)升高體系的pH 值時(shí)，各指標(biāo)顯示出急劇下降的趨勢(shì)。這可能是高pH 值降低了AHPE 和BVFE 的活性，從而使催化效率降低。因此，pH8.0 是制備體系的最佳pH 值。

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間的確定

反應(yīng)時(shí)間對(duì)多肽含量和抗氧化能力的影響見(jiàn)圖5。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)多肽含量和抗氧化能力的影響Fig.5 Effect of reaction time on peptide content and antioxidant capacity

由圖5 可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，多肽含量及FRAP 均呈現(xiàn)先迅速上升后穩(wěn)定上升的趨勢(shì)，在反應(yīng)3 h時(shí)，各指標(biāo)值達(dá)到峰值；當(dāng)繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，均表現(xiàn)出穩(wěn)定波動(dòng)。當(dāng)體系反應(yīng)到3 h 時(shí)，各反應(yīng)可能均已接近結(jié)束或已經(jīng)結(jié)束。因此，制備工藝最佳反應(yīng)時(shí)間為3 h。

2.1.5 反應(yīng)溫度的確定

反應(yīng)溫度對(duì)多肽含量和抗氧化能力的影響見(jiàn)圖6。

圖6 溫度對(duì)多肽含量和抗氧化能力的影響Fig.6 Effect of reaction temperature on peptide content and antioxidant capacity

由圖6 可知，隨著溫度從40 ℃逐漸升高到70 ℃，多肽含量及FRAP 均表現(xiàn)為先上升，達(dá)到峰值后再降低的趨勢(shì)；當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，所測(cè)指標(biāo)均達(dá)到峰值。繼續(xù)升高體系的溫度，各指標(biāo)急劇下降，可能是高溫使體系內(nèi)的酶失活，抑制了酶解反應(yīng)的進(jìn)行。因此，制備工藝最佳反應(yīng)溫度為60 ℃。

2.2 麥麩酶解物中的主要成分

工藝優(yōu)化后，對(duì)凍干處理后WBEE 和WBAE 的提取率進(jìn)行比較。樣品中主要成分含量如表2 所示。

表2 樣品提取率與主要成分的含量Table 2 Sample extraction rate and content of major components

由表2 可知，每100 g WB 僅能得到（16.77±0.63）g WBAE；而WBEE 的提取率則為（35.49±1.20）g/100 g WB。較之WBAE，WBEE 的提取率明顯上升（p<0.05），說(shuō)明酶處理顯著提高了提取物的得率。

通過(guò)AOAC 法測(cè)得每100 g WBAE 中含（68.14±1.05）g SDF，而在WBEE 中SDF 的含量為（63.97±2.19）g/100 g WBEE。盡管SDF 在WBAE 和WBEE 凍干物中占比沒(méi)有明顯差異，結(jié)合WBEE 的高提取率，說(shuō)明聯(lián)合酶解對(duì)SDF 溶出和形成有提升作用。

由凱氏定氮的結(jié)果顯示，100 g WBAE 中溶解的蛋白和多肽含量為（24.82±0.51）g，WBEE 中多肽含量為（33.93±0.84）g/100g。結(jié)合WBEE 與WBAE 提取率的顯著差異，可以明顯看出聯(lián)合酶處理不僅顯著提高了WBEE的產(chǎn)量（p<0.001），還提高了多肽在WBE 中的占比。

綜上所述，酶聯(lián)合處理能夠有效的將WB 中的多肽和SDF 提取出來(lái)，顯著提高麥麩中生物活性物質(zhì)的產(chǎn)量，從而表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性。這可能是因?yàn)锽VFE 軟化和破壞了WB 的細(xì)胞壁保護(hù)組織，聯(lián)合蛋白酶共同作用將WB 中的大分子蛋白質(zhì)和附著在表層的活性物質(zhì)分解并釋放出來(lái)。結(jié)果表明WBEE 中主要成分為SDF 和多肽。

2.3 麥麩酶解物抗氧化能力的測(cè)定

在ABTS+自由基清除能力測(cè)定中，WBEE 與WBAE抗氧化性能及標(biāo)準(zhǔn)品的ABTS+自由基和DPPH 自由基清除率見(jiàn)圖7。

圖7 WBEE 與WBAE 的抗氧化性能的比較Fig.7 Antioxidant property of WBEE and WBAE

以0.02～0.2 mmol/L 的Trolox 作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（y=-1.828 1x+0.472 9，R2=0.998 3）。由圖7a 可知，WBEE原液的ABTS+自由基清除能力得到了顯著提升（p<0.01），100 mL 的WBEE 和WBAE 的ABTS+自由基清除能力分別等效于（0.204±0.019）mmol 和（0.067±0.004）mmol的Trolox。

以0.1～0.8mmol/L 的Trolox 作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（y=-0.5446x+0.4995，R2=0.9992）。由圖7a 可看出，100mLWBAE 原液的DPPH 自由基清除能力僅相當(dāng)于（0.115±0.008）mmol的Trolox，而等體積的WBEE 原液較之有顯著提升（p<0.001），達(dá)到等效于（0.679±0.117）mmol Trolox。酶處理提高了WBEE 原液的DPPH 自由基清除能力，這與Zhao 等[19]研究的紫麥麩提取物描述的結(jié)果相同。

WBE 的還原力和FRAP 的比較見(jiàn)圖8。

圖8 WBEE 與WBAE 的還原力和FRAP 的比較Fig.8 Reducing power and FRAP of WBEE and WBAE

采用Canabady-Rochelle等[20]的AERC 方法測(cè)定還原力，以0.005～0.5 mmol/L 的抗壞血酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（y=0.907 7x+0.000 9，R2=0.999 7）。由圖8 可知，100 mL WBAE還原力等效抗壞血酸毫摩爾值為（0.032±0.003）mmol，同體積的WBEE 還原力有顯著提升（p<0.001），較WBAE 提升了3 倍多，達(dá)到了（0.128±0.010）mmol。這可能是在酶解過(guò)程大量抗氧化肽和具有還原性的SDF 等生物活性物質(zhì)得到釋放，提高了提取物的還原力。

FRAP 以0.01～2 mmol/L 的Trolox 做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（y=0.123x+0.001 5，R2=0.998 7）。由圖8 可知，WBEE 的總抗氧化活性出現(xiàn)較大幅度提升，100 mL 的WBEE 的FRAP 等效于（0.726±0.018）mmol 的Trolox。相較于等體積的WBAE 僅為（0.132±0.003）mmol Trolox 的FRAP，提升了4 倍多。這說(shuō)明酶處理對(duì)WB 中抗氧化活性成分的釋放具有明顯的提升作用。這個(gè)結(jié)果與DPPH 自由基、ABTS+自由基清除活力以及還原力說(shuō)明的現(xiàn)象基本一致，都表明WBEE 具有較好的FRAP 和還原性。另外，說(shuō)明WBEE 可以作為膳食抗氧化劑的良好來(lái)源，為WB 綜合利用開(kāi)拓了一種新的渠道。

2.4 麥麩酶解物體外發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

SCFAs 是腸道菌群對(duì)膳食纖維發(fā)酵進(jìn)行糖酵解的產(chǎn)物，主要包括乙酸、丙酸、丁酸。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究都在探究腸道菌群、短鏈脂肪酸與人體的代謝和免疫的關(guān)系[21]。大量研究表明，腸道菌群的代謝產(chǎn)物——SCFAs 與人體健康有顯著相關(guān)性，腸道產(chǎn)丁酸菌和其他益生菌及其代謝產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)腸道微環(huán)境的穩(wěn)定[22]。

不同發(fā)酵時(shí)間下SCFAs 含量變化見(jiàn)圖9。

圖9 SCFAs 濃度在不同發(fā)酵時(shí)間的比較Fig.9 SCFAs concentration at different fermentation time

體外模擬腸道微生物發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明，在發(fā)酵的不同時(shí)間段，WBEE 處理明顯豐富了體內(nèi)短鏈脂肪酸含量（p<0.01），特別是丁酸濃度（圖9c）?？赡苁且?yàn)閃BEE 通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物組成和代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體產(chǎn) 生有益影響。大量研究表明，腸道菌群消化膳食纖維，并轉(zhuǎn)化為多種對(duì)人體健康有益的有機(jī)化合物，包括氨基酸、SCFAs 等[23-24]。丁酸及丁酸鹽在體內(nèi)可以通過(guò)脂肪酸氧化為機(jī)體供應(yīng)能量，是腸道上皮細(xì)胞的主要供能物質(zhì)。丁酸與機(jī)體健康密切相關(guān)，對(duì)調(diào)節(jié)腸道健康、抑制炎癥及癌癥等病癥意義重大[22]。由圖9a～圖9c 可知，與空白組相比，WBAE 發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸、丙酸、丁酸含量在6、12、24 h 均有極顯著升高（p<0.01）。而WBEE 發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸、丙酸、丁酸含量在12、24 h 較之WBAE 均有極顯著升高（p<0.01）。不論是與空白組還是WBAE 相比，WBEE 對(duì)體外發(fā)酵腸道微生物代謝的影響顯著，在12～24 h 發(fā)酵過(guò)程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，總SCFAs 的含量與WBAE 相比有高度顯著提升（圖9d，p<0.001）；WBEE 在腸道發(fā)酵24 h后，乙酸、丙酸、丁酸和總SCFAs 的含量較之WBAE 增幅分別為34.2%、40.0%、79.0%和66.1%。因此，認(rèn)為WBEE 中的可溶性膳食纖維和多肽可能為腸道菌群的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)和能量，改善了腸道能量供應(yīng)。此外，多肽還可能會(huì)調(diào)節(jié)腸道微環(huán)境，減輕腸道內(nèi)氧化自由基對(duì)腸道的損傷。這一點(diǎn)在腸道菌群的代謝產(chǎn)物（SCFAs）的恢復(fù)，尤其是丁酸顯著增加，可以看出腸道環(huán)境得到改善。

3 結(jié)論

本文旨在運(yùn)用生物酶聯(lián)合反應(yīng)從麥麩中將具有抗氧化活性的可溶性成分提取出來(lái)，提高WB 的綜合利用價(jià)值。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了一種區(qū)別于傳統(tǒng)單酶和多酶的酶處理系統(tǒng)，成功運(yùn)用貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵酶破壞掉包裹在麥麩蛋白周?chē)睦w維素、半纖維素、木質(zhì)素等保護(hù)層，增加了麥麩蛋白的酶解接觸面積和位點(diǎn)；然后與堿性水解蛋白酶一起對(duì)麥麩蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步催化分解，大大提高了酶解效率并縮短了酶解時(shí)間（3 h）；大大提高了多肽[（33.93±0.84）g/100 g]和可溶性膳食纖維[（63.97±2.19）g/100 g]的產(chǎn)量。試驗(yàn)表明，酶解得到的產(chǎn)物具有較高的自由基清除能力[等價(jià)于（0.679±0.117）mmol Trolox/100 mL 的DPPH 自由基清除能力和（0.204±0.019）mmol Trolox/100 mL 的ABTS+自由基清除能力]、還原力[等價(jià)于（0.128±0.010）mmol抗壞血酸標(biāo)品/100 mL]和抗氧化能力[等價(jià)于（0.726±0.018）mmol Trolox/100 mL]。推測(cè)麥麩酶解物可能具有祛除體內(nèi)自由基并抵抗機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的功能。此外，在體外模擬腸道消化試驗(yàn)中，麥麩酶解物表現(xiàn)出良好的短鏈脂肪酸調(diào)節(jié)能力。與麥麩水提物相比，總脂肪酸含量漲幅為66.0%，特別是丁酸含量漲幅為79.0%?？赡苁且?yàn)辂滬熋附馓崛∥镏械目扇苄陨攀忱w維和多肽改善了腸道微環(huán)境，為腸道菌群提供了充盈的能量，促進(jìn)了腸道益生菌的生長(zhǎng)，因此，使菌群代謝的短鏈脂肪酸的增長(zhǎng)。接下來(lái)可以繼續(xù)設(shè)計(jì)衰老模型和炎癥模型開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證麥麩酶解物的功能。期望可以為抗擊炎癥和防衰老提供一種綠色健康的功能食品，實(shí)現(xiàn)麥麩的綜合利用。