張婷 王霄煜 吳如微 張瑩瑩 霍燃華 李海燕 任杰 李潔

摘要［目的］篩選可培養(yǎng)功能微生物，為農(nóng)業(yè)廢棄物的循環(huán)利用提供微生物資源。［方法］以喂食廢菌渣的白星花金龜幼蟲蟲糞為研究對象，采用平板涂布法分離蟲糞中的可培養(yǎng)微生物，并對其分解纖維素和蛋白質(zhì)能力進(jìn)行初步探究。［結(jié)果］共分離出細(xì)菌5株、真菌3株，經(jīng)鑒定，分別為纖維化纖維微細(xì)菌、鉛黃腸球菌、原玻璃蠅節(jié)桿菌、谷氨酸桿菌、灰色鏈霉菌、熱帶假絲酵母、長枝木霉和白地霉。其中纖維化纖維微細(xì)菌和灰色鏈霉菌具有降解蛋白質(zhì)的能力，在酪蛋白培養(yǎng)基上透明圈直徑與菌落直徑的比值（HC）分別為7.259±0.417和1.971±0.584；原玻璃蠅節(jié)桿菌、灰色鏈霉菌、白地霉、長枝木霉具有降解纖維素的能力，在羧甲基纖維素鈉上經(jīng)剛果紅染色后透明圈HC分別為1.166±0.028、2.044±0.245、1.075±0.029、1.288±0.048。［結(jié)論］纖維化纖維微細(xì)菌、原玻璃蠅節(jié)桿菌、灰色鏈霉菌、白地霉和長枝木霉可作為食用菌廢菌渣等農(nóng)業(yè)廢棄物循環(huán)利用的菌種資源。

關(guān)鍵詞白星花金龜；幼蟲蟲糞；可培養(yǎng)微生物；分離鑒定

中圖分類號S 182文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2023）24-0001-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.24.001

Isolation，Identification and Characterization of Culturable Microorganisms from Frass of Protaetia brevitarsis Larva

ZHANG Ting1，WANG Xiaoyu2，WU Ruwei2 et al

（1.Chengde Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Chengde，Hebei 067000;2.Hebei Normal University for Nationalities，Chengde，Hebei 067000）

Abstract［Objective］ To screen cultivable functional microorganisms，and provide microbial resources for the recycling of agricultural waste.［Method］Taking the frass of Protaetia brevitarsis larva with the edible fungi residues as the research object， the plate coating method was used to separate culturable microorganisms from feces， and their ability to decompose cellulose and protein was preliminarily explored.［Result］A total of 5 strains of bacteria，and 3 strains of fungi were isolated.After identification， they were identified as Cellulosimicrobium cellulans， Enterococcus casseliflavus， Arthrobacter protophormiae， Glutamicibacter halophytocola， Streptomyces griseolus， Candida tropicalis， Trichoderma longibrachiatum， Geotrichum candidum.Among them， Cellulosimicrobium cellulans and Streptomyces griseolus had the ability to decompose protein， and the ratio of transparent circle diameter to colony diameter （HC） on casein culture medium were 7.259 ± 0.417 and 1.971 ± 0.584， respectively.Arthrobacter protophormiae， Streptomyces griseolus， Geotrichum candidum and Trichoderma longibrachiatum had the ability to degrade cellulose， and after Congo red staining on sodium carboxymethyl cellulose， the HC values of the transparent circle were 1.166±0.028，2.044±0.245，1.075±0.029 and 1.288±0.048.［Conclusion］Cellulosimicrobium cellulans，Arthrobacter protophormiae， Streptomyces griseolus，Geotrichum candidum and Trichoderma longibrachiatum can be used as strain resources for the reuse of agricultural wastes such as edible fungi residues.

Key wordsProtaetia brevitarsis;Frass of larva;Culturable microorganisms;Isolation and identification

白星花金龜（Protaetia brevitarsis），屬鞘翅目花金龜科，是一種寶貴的昆蟲資源，在藥用、飼用、生態(tài)等方面均具有較高的利用價(jià)值。研究表明，白星花金龜幼蟲多在腐殖質(zhì)豐富的土壤或糞堆中生活，以腐爛的秸稈、雜草以及禽畜糞便為食［1］，其幼蟲在對秸稈進(jìn)行轉(zhuǎn)化的同時(shí)，也可以獲得蟲體和蟲糞等副產(chǎn)品，極具有開發(fā)利用價(jià)值。白星花金龜幼蟲對平菇菌糠、豬糞、牛糞、玉米秸稈等農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物消化率較高［2］。對東亞飛蝗糞沙、玉米秸稈、小麥秸稈和花生殼均有一定的轉(zhuǎn)化作用［3］，且獲得的幼蟲干物質(zhì)中蛋白質(zhì)、脂肪和氨基酸含量較高［4］，蟲糞沙也富含較多的有機(jī)物質(zhì)［5］。因此，在利用白星花金龜幼蟲轉(zhuǎn)化利用農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物的同時(shí)，不僅治理了環(huán)境問題，還提高了蟲體和蟲糞沙資源的利用率。

目前有關(guān)白星花金龜幼蟲在廢棄物循環(huán)利用方面的研究主要集中在幼蟲對農(nóng)業(yè)廢棄物的轉(zhuǎn)化利用、農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物對幼蟲生物學(xué)特性影響、幼蟲腸道微生物篩選以及幼蟲蟲糞有機(jī)肥等方面，而對于幼蟲蟲糞微生物的篩選及多樣性研究鮮見報(bào)道。黃婉秋等［6］從白星花金龜幼蟲腸道中分離出1株具有較強(qiáng)纖維素降解能力的纖維單胞菌，其CMC酶活性峰值能達(dá)0.19 U/mL，并確定該菌株具有包括內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡聚糖苷酶和外切葡聚糖酶等纖維素降解相關(guān)基因及代謝通路。賴德強(qiáng)等［7］將白星花金龜幼蟲蟲糞按比例添加在辣椒育苗基質(zhì)中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，辣椒幼苗的生物量、根系發(fā)育情況以及壯苗指數(shù)均顯著高于對照組，提高了辣椒苗期的耐寒能力。劉福順等［8］研究施用不同量白星花金龜幼蟲蟲糞對櫻桃蘿卜生長情況的影響，結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)隨著蟲糞施用量的增加，櫻桃蘿卜地上部、地下部鮮質(zhì)量均呈現(xiàn)增加的趨勢。該研究以飼喂食用菌廢菌渣的白星花金龜幼蟲為研究對象，收集其新鮮蟲糞后采用平板涂布法分離其中的可培養(yǎng)微生物，為篩選可高效利用的微生物提供菌種資源和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料白星花金龜幼蟲由河北燕塞生物科技有限公司提供，主要以食用菌廢菌渣為食。

1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL；麥芽汁培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；酪蛋白培養(yǎng)基：酪蛋白 10.00 g，牛肉浸粉3.00 g，氯化鈉5.00 g，磷酸氫二鈉2.00 g，瓊脂15.00 g，溴麝香草酚藍(lán)0.05 g，pH 7.4±0.1；羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉15.0 g，硝酸銨1.0 g，酵母膏1.0 g，硫酸鎂0.5 g， 磷酸二氫鉀1.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 自然；赫奇遜氏無機(jī)鹽培養(yǎng)液：KH2PO4 1.00 g，NaCl 0.10 g，MgSO4·7H2O 0.30 g，NaNO3 2.50 g，F(xiàn)eCl3 0.01 g，CaCl2 0.10 g，蒸餾水1 000? mL，pH 7.2左右；液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：玉米秸稈粉20 g，赫奇遜氏無機(jī)鹽培養(yǎng)液1 000 mL。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1微生物的分離純化。

收集新鮮的幼蟲糞沙0.1 g于無菌管中，加入0.9 mL無菌水充分混勻后，稀釋至10-2、10-3濃度梯度涂布于分離培養(yǎng)基上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長出菌落后，挑取單菌落至相應(yīng)的培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，純化次數(shù)3次以上，直至獲得穩(wěn)定生長的單菌落。

1.3.2形態(tài)學(xué)鑒定。菌落形態(tài)觀察：將獲得的菌株挑取單菌落進(jìn)行平板劃線培養(yǎng)，觀察菌體在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及生長情況。菌體形態(tài)觀察：染色后置于顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.3.3分子生物學(xué)鑒定。

1.3.3.1DNA提取。分別用Ezup 柱式細(xì)菌、真菌、酵母菌基因組 DNA 抽提試劑盒提取相應(yīng)微生物的基因組DNA。

1.3.3.2PCR擴(kuò)增及測序。采用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中，細(xì)菌引物序列27F（AGAGTTTGATCMTGGCTCAG）、1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）；酵母菌引物序列NL1（GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG）、NL4（GGTCCGTGTTTCAAGACGG）；真菌引物序列ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）、ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）。擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.4降解蛋白質(zhì)和纖維素能力初探。

將分離純化的菌株分別點(diǎn)接種至酪蛋白固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后觀察菌株生長情況及產(chǎn)生透明圈情況，并計(jì)算透明圈直徑與菌落直徑的比值（HC），探究各菌株降解蛋白質(zhì)的能力。

將分離純化的菌株分別點(diǎn)接種至羧甲基纖維素鈉固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后觀察菌株生長情況，用剛果紅染色后觀察透明圈情況，計(jì)算透明圈HC值，探究各菌株降解纖維素的能力。

2結(jié)果與分析

2.1菌種的分離鑒定通過對白星花金龜幼蟲蟲糞樣品進(jìn)行分離，總共得到細(xì)菌5株、真菌3株，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對所分離的菌株進(jìn)行綜合鑒定。

2.1.1細(xì)菌。

2.1.1.1形態(tài)學(xué)觀察。

將分離純化的細(xì)菌培養(yǎng)于LB固體培養(yǎng)基上，觀察菌落形態(tài)，并挑取單菌落進(jìn)行顯微觀察。各細(xì)菌菌落形態(tài)及菌體形態(tài)見表1，其中分離出的4株細(xì)菌革蘭氏染色后均呈陽性。

2.1.1.2分子鑒定。將細(xì)菌16S rDNA測序結(jié)果提交至NCBI進(jìn)行Blast對比，并結(jié)合《細(xì)菌鑒定手冊》確定待測菌株的分類地位。分子鑒定結(jié)果顯示，xh1菌株為纖維化纖維微細(xì)菌（Cellulosimicrobium cellulans），dh1菌株為谷氨酸桿菌（Glutamicibacter halophytocola），hb2菌株為鉛黃腸球菌（Enterococcus casseliflavus），hd1菌株為原玻璃蠅節(jié)桿菌（Arthrobacter protophormiae），hb1菌株為灰色鏈霉菌（Streptomyces griseolus）。

2.1.2真菌。

2.1.2.1形態(tài)學(xué)觀察。

將分離純化的菌株培養(yǎng)于麥芽汁固體培養(yǎng)基和PDA固體培養(yǎng)基上，觀察其菌落形態(tài)，并挑取單菌落進(jìn)行顯微觀察。各真菌菌落形態(tài)及菌體形態(tài)見表2。

2.1.2.2分子鑒定。將測序結(jié)果提交至NCBI進(jìn)行Blast對比，并結(jié)合《酵母菌鑒定手冊》《真菌鑒定手冊》確定待測菌株的分類地位。分子鑒定結(jié)果顯示，bd1菌株為熱帶假絲酵母（Candida tropicalis），SM2菌株為長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum），SX2菌株為白地霉（Geotrichum candidum）。

2.2降解蛋白質(zhì)和纖維素能力

酪蛋白培養(yǎng)基上菌株生長結(jié)果顯示（表3），纖維化纖維微細(xì)菌和灰色鏈霉菌能夠產(chǎn)生明顯的透明圈，透明圈HC值分別為7.259±0.417、1.971±0.584，說明其具有一定的蛋白質(zhì)降解能力；羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)后剛果紅染色結(jié)果顯示（表4），原玻璃蠅節(jié)桿菌、灰色鏈霉菌、白地霉和長枝木霉能夠產(chǎn)生透明圈，透明圈HC值分別為1.166±0.028、2.044±0.245、1.075±0.029、1.288±0.048，說明其具有一定的纖維素降解能力。陳燕紅等［9］研究表明，纖維化纖維微細(xì)菌具有水解蛋白質(zhì)的特性，這與該研究結(jié)果一致。

3討論與結(jié)論

白星花金龜幼蟲能夠有效降解秸稈、菌渣等農(nóng)業(yè)廢棄物，研究表明其腸道中存在豐富的與纖維素降解有關(guān)的微生物［3，10］，而目前對于其幼蟲相關(guān)的微生物的研究也主要集中在腸道微生物上。黃婉秋等［6］

從白星花金龜幼蟲腸道中分離出1株具有較強(qiáng)分解纖維素能力的纖維單胞菌。魏盼盼［11］對白星花金龜幼蟲腸道微生物多樣性研究發(fā)現(xiàn)，具有降解木質(zhì)纖維素和固氮功能的纖維菌屬、纖維桿菌屬、纖維素單胞菌屬、假單胞菌屬、鏈霉菌屬等優(yōu)勢菌屬在中腸和后腸中都有存在。田小燕等［12］對飼喂玉米秸稈的白星花金龜幼蟲腸道微生物細(xì)菌多樣性研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌屬和脫硫弧菌屬分別為幼蟲中腸和后腸中的優(yōu)勢菌屬。

該研究從白星花金龜幼蟲新鮮蟲糞中共分離出細(xì)菌5種、真菌3種，對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，初步確定其分類地位及所屬類群，分別為纖維化纖維微細(xì)菌、鉛黃腸球菌、原玻璃蠅節(jié)桿菌、谷氨酸桿菌、灰色鏈霉菌、熱帶假絲酵母、長枝木霉和白地霉。通過選擇培養(yǎng)基進(jìn)行初步的功能篩選，確定纖維化纖維微細(xì)菌和灰色鏈霉菌具有降解蛋白質(zhì)的能力，原玻璃蠅節(jié)桿菌、灰色鏈霉菌、白地霉和長枝木霉具有降解纖維素的能力，但其降解能力強(qiáng)弱仍需進(jìn)一步定量研究。

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)中產(chǎn)生的廢棄物種類多、數(shù)量大，但目前對于農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用率相對較低。我國每年都能生產(chǎn)出大量的食用菌廢菌渣，因其利用過程中存在諸多難點(diǎn)，導(dǎo)致其實(shí)際循環(huán)利用率相對較低。而利用微生物發(fā)酵技術(shù)對農(nóng)業(yè)廢棄物進(jìn)行無害化處理，已成為生態(tài)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要方向。研究表明，纖維化纖維微細(xì)菌、原玻璃蠅節(jié)桿菌、灰色鏈霉菌等細(xì)菌，以及長枝木霉、白地霉等真菌具有降解纖維素和蛋白質(zhì)的能力［13-15］，且在增加土壤養(yǎng)分、提高土壤酶活［16］、增強(qiáng)植物抗逆性［17-18］、吸附金屬離子［19-20］等方面表現(xiàn)出積極作用。因此，從飼喂食用菌廢菌渣的白星花金龜幼蟲蟲糞中分離可培養(yǎng)微生物，篩選降解纖維素和蛋白質(zhì)的功能菌，將為食用菌廢菌渣的循環(huán)利用提供菌種資源。

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