楊愛軍，李延菲

泰安市婦幼保健院，山東 271000

臍帶血(umbilical cord blood，UCB)作為造血干細(xì)胞移植的主要來源之一，可用于治療血液和免疫系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、骨髓衰竭、先天性代謝障礙和其他遺傳性疾病[1]。自1988 年首次臍帶血移植以來，全球已有40 000 多例臍帶血移植病人，超過一半的病人得以治愈[2]。在臨床應(yīng)用中，有核細(xì)胞總數(shù)（total nucleated cells，TNC）是臍帶血供體選擇的主要依據(jù)，在臍血庫中優(yōu)先選擇較高TNC 計(jì)數(shù)的臍帶血單位（cord blood units，CBU），以加速移植后的植入，而低TNC 計(jì)數(shù)的CBU 更有可能得不到應(yīng)用而被無限期儲存，加大了高昂成本的支出[3]。臍帶血采集量是決定TNC 大小的關(guān)鍵指標(biāo)之一，臍帶結(jié)扎時間決定了新生兒的胎盤輸血量以及胎盤和臍帶中可以收集和儲存的剩余血液。已知延遲斷臍可以增加新生兒的胎盤輸血，對新生兒產(chǎn)生一定的益處，目前普遍認(rèn)為新生兒應(yīng)延遲斷臍[4-5]。2019 年美國婦產(chǎn)科學(xué)院(American College of Obstetrics & Gynaecologists，ACOG)委員會建議，臍帶血采集不應(yīng)改變延遲斷臍的常規(guī)做法，除非有醫(yī)學(xué)指征的定向捐贈[6]。雖然推測延遲斷臍會減少采集的臍帶血量，但在多大程度上減少了TNC 計(jì)數(shù)并因此影響臍血庫活動仍然存在爭議[7-9]。如何在不影響臍帶血采集的情況下，使新生兒獲得有益的最佳延遲斷臍時間是目前關(guān)注的熱點(diǎn)課題。本研究旨在探究不同延遲斷臍時機(jī)對采集CBU 體積和TNC 含量的影響，明確臍帶血采集時新生兒最佳延遲斷臍時機(jī)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2022 年1 月—2023 年3 月在我院產(chǎn)房自然分娩的產(chǎn)婦及其新生兒作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）足月兒；2）單胎；3）經(jīng)陰道分娩。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）父母有血液系統(tǒng)和惡性疾病史、患有遺傳代謝疾病或可能傳染給孩子的傳染??；2）陰道助產(chǎn)、低體重兒、有明顯畸形和Apgar 評分低的新生兒。本研究以采集CBU 的TNCs 計(jì)數(shù)為主要研究指標(biāo)，分為A、B、C、D、E 5 組，利用PASS 15 軟件(NCSS，Kaysville，Utah，USA)用來計(jì)算所需樣本量。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，A～E 組采集CBU 的TNCs 計(jì)數(shù)分別為10.34，11.57，10.92，7.26，6.76，標(biāo)準(zhǔn)差為1.73，雙側(cè)檢驗(yàn)α為0.05，Power 為0.90，輸入PASS 15 軟件One-Way Analysis of Variance F-Tests中可算得每組至少需要40 例，考慮20%的脫落率，最終每組需至少50 例，總樣本量為250 例。對于符合納入與排除標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)婦，提供給公共庫臍帶血捐獻(xiàn)和延遲斷臍的說明，所有產(chǎn)婦自愿采集并捐獻(xiàn)臍帶血，并簽訂《臍帶血采集知情同意書》《臍帶血供者知情同意書》及本研究的知情同意書。本研究已取得醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2 分組方法

按照隨機(jī)對照原則，使用SPSS 29.0 軟件生成隨機(jī)數(shù)字表，按照孕婦進(jìn)入產(chǎn)房的順序編號，每個編號對應(yīng)1 個隨機(jī)數(shù)字，將隨機(jī)數(shù)字自小到大進(jìn)行排序，隨機(jī)數(shù)字1～50 對應(yīng)的編號為A 組，即分娩后＜30 s 內(nèi)立即斷臍組；隨機(jī)數(shù)字51～100 對應(yīng)的編號為B 組，分娩后30～60 s 斷臍組；隨機(jī)數(shù)字101～150 對應(yīng)的編號為C組，分娩后＞60～90 s 斷臍組；隨機(jī)數(shù)字151～200 對應(yīng)的編號為D 組，分娩后＞90～120 s 斷臍組；隨機(jī)數(shù)字201～250 對應(yīng)的編號為E 組，分娩后＞120 s 斷臍組。隨機(jī)數(shù)字和組別裝入不透明的信封中，父母簽訂知情同意書后，由研究者打開信封確定分組。5 組產(chǎn)婦和新生兒一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表1。

表1 5 組產(chǎn)婦及新生兒一般資料比較

1.3 臍帶血采集方法

采用宮內(nèi)采集臍帶血的方法，即胎兒娩出斷臍后、胎盤娩出前收集臍帶血。新生兒娩出后，按相應(yīng)的分組時間，在距離臍輪5～7 cm 處斷臍，用碘伏紗布自臍帶斷端向產(chǎn)婦胎盤端充分消毒臍帶穿刺部位，采血針在距臍帶斷端3～5 cm 處針頭斜面朝下或側(cè)面小角度穿刺臍靜脈采血，臍帶血在重力作用下流入一次性專用采血袋。采集過程中輕輕搖晃采血袋，使臍帶血與抗凝劑混勻，防止凝集。采血完畢后關(guān)閉采血管，等待胎盤自行剝離，協(xié)助胎盤娩出。采集結(jié)束后，將臍帶血放于4 ℃冰箱保存，并及時通知臍血庫人員取血，做進(jìn)一步處理。采集過程中，新生兒在等待延遲斷臍的這段時間要做好保暖，當(dāng)新生兒和產(chǎn)婦發(fā)生任何不適宜采集臍帶血的病情變化時應(yīng)立即斷臍并搶救。

1.4 評價(jià)指標(biāo)

采集CBU 的體積；采集CBU 的TNC 計(jì)數(shù)；符合公共臍血庫入庫標(biāo)準(zhǔn)的CBU 占比。CBU 體積和TNC計(jì)數(shù)測定在山東省臍血庫實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。根據(jù)臍帶血密度為1.06 g/mL，計(jì)算1 g 臍帶血約等于0.94 mL，通過從采集臍帶血總重量中減去皮重(110 g)計(jì)算采集臍帶血體積，然后減去抗凝劑體積(28 mL)計(jì)算采集CBU的最終體積。使用五分類血液分析儀進(jìn)行TNC 分析。公共臍血庫檢測采集臍帶血TNC 之前，需要體積判定，采血量至少應(yīng)達(dá)到80 mL 才能檢測，如果CBU 符合TNC＞8×108，達(dá)到公共臍血庫的入庫標(biāo)準(zhǔn)，捐獻(xiàn)給公共臍血庫。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 29.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量資料若服從正態(tài)分布且方差齊時以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，多組樣本間比較采用單因素方差分析；定量資料若不服從正態(tài)分布或方差不齊，以中位數(shù)、四分位間距[M(Q）]描述，多組間比較采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)，兩兩比較采用多重比較。定性資料采用例數(shù)和百分比（%）描述，多組間比較采用χ2檢驗(yàn)，兩兩比較采用多重比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間兩兩比較時Bonferroni 法校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α'=0.005。

2 結(jié)果

2.1 5 組采集CBU 的體積比較

5 組采集的CBU 的體積平均值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩兩比較結(jié)果顯示，A 組與C 組、D組、E 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。B 組與C 組、D 組、E 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。C 組與D 組、E 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。詳見表2。

表2 5 組采集CBU 的體積比較[M(Q）]單位：mL

2.2 5 組采集體積小于80 mL 的CBU 占比情況

5 組采集CBU 體積小于80 mL 占比分別為10%、16%、44%、70%、80%。隨著斷臍時間的延長，小于80 mL 的CBU 占比越大，采集CBU 的體積逐漸減少，當(dāng)斷臍時間超過60 s 時，采集CBU 體積小于80 mL 的比例達(dá)到了80%。詳見表3。

表3 5 組采集體積小于80 mL 的CBU 占比情況

2.3 5 組采集CBU 中TNCs 水平比較

5 組采集的CBU 中TNC 平均值比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示，A 組與D 組、E組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。B 組與D組、E 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。C 組與D 組、E 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表4。

表4 5 組采集CBU 的TNC 計(jì)數(shù)比較[M(Q）]

表5 符合公共臍血庫入庫標(biāo)準(zhǔn)的CBU 占比比較

2.4 5 組符合公共臍血庫入庫標(biāo)準(zhǔn)的CBU 占比比較

5 組符合公共臍血庫入庫標(biāo)準(zhǔn)的CBU 占比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示，A組與D 組、E 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。B 組與D 組、E 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。C 組與D 組、E 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。隨著斷臍時間的延長，符合公共臍血庫入庫標(biāo)準(zhǔn)的CBU 占比逐漸減少，延遲斷臍＞90 s 時，符合公共臍血庫入庫標(biāo)準(zhǔn)的CBU 的占比比立即斷臍和延遲斷臍長達(dá)90 s 組低12.6 倍(χ2=85.069，P＜0.001)。

3 討論

臍帶血是胎兒娩出后存在于臍帶血管和胎盤血管中的殘留血液。臍帶血于1988 年首次應(yīng)用，用于治療患有Fanconi 貧血的兒童[10]。臍帶血目前已經(jīng)成為造血干細(xì)胞的主要來源之一，具有容易采集，對母親和新生兒的風(fēng)險(xiǎn)低，傳播病毒性疾病及發(fā)生移植物抗宿主疾病風(fēng)險(xiǎn)低等優(yōu)勢[11]，已廣泛應(yīng)用于血液系統(tǒng)疾病，并探索應(yīng)用于更廣泛的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。臍帶血所含的造血干細(xì)胞數(shù)量低于骨髓和外周血中的干細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞劑量是臍帶血廣泛應(yīng)用于造血干細(xì)胞移植的主要限制因素。在移植過程中使用不理想的造血干細(xì)胞劑量可能會使血液恢復(fù)和移植發(fā)生延遲，導(dǎo)致移植失敗，并增加感染的風(fēng)險(xiǎn)[12]。對于兒童而言，接受較低TNC 含量會增加移植相關(guān)死亡率和人類白細(xì)胞抗原（HLA）的差異程度[13]。因此，臍血庫儲存高質(zhì)量的臍帶血，尤其是TNC 含量高的CBU 至關(guān)重要[14]。

TNC 是供體選擇的主要依據(jù)，臍帶血采集量是決定TNC 的關(guān)鍵指標(biāo)之一。延遲斷臍可以讓新生兒獲得更多原本留在臍帶和胎盤中的血液[15]，理論上隨著新生兒斷臍時間的延遲，可以采集的臍帶血量會逐漸減少，并在一定程度上對采集臍帶血中的TNC 產(chǎn)生影響。Ciubotariu 等[9]對1 所醫(yī)院1 210 名母親采集的CBU 進(jìn)行體積和TNC 評價(jià)，結(jié)果表明，30～60 s 的延遲斷臍對高TNC 計(jì)數(shù)CBU 的采集有較小的負(fù)面影響。然而，延遲斷臍超過60 s 可顯著降低采集CBU 的體積和TNC 含量，大大降低了獲得臨床有用CBU 的機(jī)會。并且Ciubotariu 等[16]前期對552 名產(chǎn)婦進(jìn)行了隨訪，結(jié)果顯示,非延遲斷臍組CBU 的TNC 含量高于＞60 s 延遲斷臍組的CBU 的TNC 含量達(dá)7 倍。而Allan等[7]對加拿大血液服務(wù)機(jī)構(gòu)在一個采集點(diǎn)采集的CBU進(jìn)行了分析，新生兒出生后斷臍時間分為無延遲、延遲20～60 s、延遲60 s 以上或延遲120 s 以上，結(jié)果表明，任何時間的延遲斷臍減少了為公共臍帶血庫采集的CBU 的體積和TNC 計(jì)數(shù)。Fr?ndberg 等[8]的研究結(jié)果不同于以往研究，對瑞典國家臍帶血庫在斷臍方法從即時斷臍（短于60 s）改為延遲斷臍（長于60 s），對采集的CBU 體積和TNC 進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果指出，收集CBU 的體積顯著減小，但收集單位之間的平均TNC含量無顯著差異。

本研究采納了美國婦產(chǎn)科學(xué)院委員會意見中指出的延遲斷臍的定義，30 s 內(nèi)即為早斷臍，超過30 s 即為延遲斷臍[17]。本研究結(jié)果顯示，隨著延遲斷臍時間的延長，采集臍帶血的量逐漸減少，＞60 s 延遲斷臍的3組采集的臍帶血量少于≤60 s 斷臍時間的2 組，與上述相關(guān)研究結(jié)果一致。當(dāng)延遲斷臍時間＞120 s 時，采集臍帶血單位體積小于80 mL 的比例高達(dá)80%。

本研究結(jié)果還顯示，隨著斷臍時間的延遲，采集CBU 的TNC 含量逐漸減少，＞90 s 延遲斷臍的2 組采集CBU 的TNC 含量顯著低于≤90 s 延遲斷臍的3 組，且延遲斷臍＞90 s，符合公共臍血庫入庫標(biāo)準(zhǔn)的CBUs的占比比立即斷臍和延遲斷臍≤90 s 組低12.6 倍。與Fr?ndberg 等[8]的研究均采用宮內(nèi)采集臍帶血的方法得出相似的研究結(jié)果，而不同于其他相關(guān)研究結(jié)果[7,9,16]。原因可能為與本研究結(jié)果不一致的其他相關(guān)研究采用宮外采集臍帶血的方法，本研究采用了宮內(nèi)采集臍帶血的方法。可能與宮外采集臍帶血在胎盤娩出后母體和新生兒存在出血情況，加之胎兒胎盤血管中會形成血凝塊，導(dǎo)致造血干細(xì)胞的丟失有關(guān)。

世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）、皇家產(chǎn)科學(xué)會在內(nèi)的多個醫(yī)療組織的委員會及美國兒科學(xué)會和ACOG 共同推薦新生兒分娩后應(yīng)實(shí)施延遲斷臍。2014 年世界衛(wèi)生組織建議新生兒分娩后考慮延遲結(jié)扎臍帶的時間應(yīng)超過60 s[18]。2020 年美國婦產(chǎn)科學(xué)院委員會最新意見建議，所有新生兒應(yīng)延遲結(jié)扎臍帶至少30～60 s[4]。本研究結(jié)果表明，≤90 s 的延遲斷臍時間對采集高TNC 含量的CBU 負(fù)面影響較小，不建議＞90 s 的延遲斷臍時間，而新生兒延長90 s 內(nèi)的斷臍時間對臍血庫采集高質(zhì)量的臍帶血是可行的。國內(nèi)學(xué)者近期的一項(xiàng)研究表明，短于90 s 的延遲斷臍可以改善新生兒的血液學(xué)狀況（血紅蛋白和血細(xì)胞比容），但將延遲斷臍時間從90 s 延長到120 s，并沒有觀察到血紅蛋白和血細(xì)胞比容的進(jìn)一步增加，但卻增加了需要光療的新生兒黃疸和新生兒紅細(xì)胞增多癥的發(fā)生率[19]。《美國婦產(chǎn)科學(xué)院委員會意見（2020 年）》中指出，在足月兒中，延遲斷臍可提高出生時的血紅蛋白水平，并改善出生后前幾個月的鐵儲存，有助于新生兒的生長發(fā)育。但同時指出，在接受延遲斷臍的足月新生兒中，需要進(jìn)行光療的黃疸發(fā)生率略有增加[4]。且臍帶血流多普勒超聲檢查顯示，胎盤-胎兒輸血量在60 s時約80 mL，3 min 時約100 mL[20]。由此可見，延長斷臍時間到90 s 可滿足新生兒必要的胎盤輸血，同時可以降低新生兒黃疸的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

4 小結(jié)

本研究結(jié)果顯示，延遲斷臍長達(dá)90 s，可以滿足新生兒供體必要的血液轉(zhuǎn)移，同時可以采集高質(zhì)量的臍帶血，促進(jìn)臍血庫高質(zhì)量臍帶血的臨床應(yīng)用。但本研究只選擇了1 所醫(yī)院的研究對象，且樣本量較少，研究結(jié)果需要多中心、大樣本的隨機(jī)對照研究進(jìn)一步證實(shí)。