嚴(yán)會(huì)玲,曹磊,鄒榮,張修華,王升富,何漢平

(湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,湖北 武漢 430062)

0 引言

甲胎蛋白(AFP)是一種多功能糖蛋白生物標(biāo)志物(Mw=70 000 Da),可作為治療和干預(yù)中正常生理、致病或藥理學(xué)反應(yīng)的預(yù)后指標(biāo)[1-2]。其在健康成人血液中的濃度應(yīng)小于25 ng/mL,如果人體血液中甲胎蛋白的濃度增加,可能預(yù)示著肝癌、結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌以及其他胃腸道癌癥的發(fā)生[3]。此外,檢測孕婦體內(nèi)的甲胎蛋白含量有助于發(fā)現(xiàn)胎兒的先天缺陷和新生兒疾病[4]。通常肝細(xì)胞癌(HCC)占肝癌的85～90 %,在死亡病例中因患肝癌死亡占據(jù)主要人數(shù)[5]。AFP已被廣泛接受為肝癌細(xì)胞的生物標(biāo)志物。由此可見,監(jiān)測人體中AFP濃度對(duì)早期病變的診斷以及后期治療的分析顯得尤為重要。近幾年AFP的檢測技術(shù)發(fā)展十分迅速,例如酶聯(lián)免疫吸附法[6](enayme-linked immunosorbent assy,ELISA),化學(xué)發(fā)光法[7-8]、熒光免疫分析法[9-11](fluoroimmunoassay,FIA)和電化學(xué)免疫分析[12-14](electrochemical immunoassay)。這些方法具有高精度、選擇性高等優(yōu)點(diǎn),但是也存在一定的局限性,包括需要較高的專業(yè)要求、耗時(shí)的實(shí)驗(yàn)過程和標(biāo)記過程、以及復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)測試底液。例如,ELISA方法不能有效地檢測在腫瘤早期低濃度的腫瘤標(biāo)志物,同時(shí)它也需要高技能的技術(shù)人員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[15],無法實(shí)現(xiàn)普遍化。傳統(tǒng)的電化學(xué)免疫傳感器具有靈敏度低的缺點(diǎn),雖然可以通過引入各種信號(hào)放大來提高靈敏度,例如,滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)[16-17]、使用氫供體(3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺)[18]和酪胺信號(hào)放大(TSA)[19],這些技術(shù)使診斷過程復(fù)雜化。因此,具有靈敏度高、簡單操作且高效的手段來檢測低濃度的疾病標(biāo)志物是非常有必要,特別是用于即時(shí)檢測(POCT)。

無標(biāo)記型的傳感器能夠減少繁瑣的制備過程,其原理是反應(yīng)前后的界面電流、電容以及電勢等產(chǎn)生變化,從而得到信號(hào)輸出,但是該檢測方法的靈敏度較低,導(dǎo)致不能對(duì)低豐度目標(biāo)物進(jìn)行檢測。晶體管作為一種新型的信號(hào)載體,其無需借助復(fù)雜的修飾手段對(duì)信號(hào)進(jìn)行放大處理就可以得到較好的信號(hào)響應(yīng),已成功應(yīng)用在各種類型的生物傳感器中[20-23]。溶液柵控場效應(yīng)晶體管由于其能在電解液中進(jìn)行測試工作,因此決定了該設(shè)備的工作電壓要小于1 V[21-22],低電壓的工作電位有效地防止了檢測液的分解、干擾、保護(hù)生物體不被破壞等。液體的工作環(huán)境滿足了大部分的生物檢測分析,為生物分子檢測提供了一個(gè)可靠的平臺(tái)。

因此本工作設(shè)計(jì)了一種無標(biāo)記電位型溶液柵控石墨烯晶體管生物傳感器對(duì)甲胎蛋白的檢測(圖1)。在柵電極上通過電沉積納米金層來捕獲AFP抗體(anti-AFP),牛血清白蛋白(BSA)作為封閉劑,最終分析物AFP被特異性結(jié)合到電極上。在pH=7.4的PBS中,生物分子帶有一定的電荷,引起柵極/電解質(zhì)溶液界面電勢的變化,從而改變了有效柵壓,最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)移曲線中狄拉克點(diǎn)的偏移。根據(jù)電位偏移量對(duì)甲胎蛋白進(jìn)行定量分析,實(shí)現(xiàn)無標(biāo)記檢測。

圖1 SGGT的構(gòu)建過程

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器PMMA/CVD銅基底單層石墨烯、羧基化多壁碳納米管購于南京先豐納米科技有限公司。氯金酸(HAuCl4·3H2O)、癌胚抗原(CEA)購于Sigma-Aldrich公司(北京)。anti-AFP、AFP購于上海領(lǐng)潮生物科技有限公司。20×磷酸鹽緩沖溶液購于生工生物工程股份有限公司。碳酸鉀(K2CO3)、丙酮(C3H6O)、五水合硫酸銅(CuSO4·5H2O)、鹽酸(HCl)均為分析純,購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。人血清白蛋白(HSA)、凝血酶(TB)和肌紅蛋白(MB)購于上海源葉生物科技有限公司。30% H2O2、辣根過氧化物酶、牛血清白蛋白(BSA)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和檸檬酸鈉(C6H5Na3O7)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。金絲、鉻購于中諾新材科技有限公司。玻璃基底購于洛陽古玻璃有限公司。

2450數(shù)字源表,美國吉時(shí)利儀器有限公司。CHI660E電化學(xué)工作站,上海辰華儀器有限公司。V22-300熱蒸發(fā)鍍膜儀,北京中科科技股份有限公司。Tecnai G20透射電子顯微鏡,美國FEI公司。UV-2700紫外可見分光光度計(jì),日本Shimadzu公司。3-18KS冷凍離心機(jī),美國Sigma公司。Milli-Q超純水儀器,美國Millipore公司。玻碳電極、飽和甘汞電極、銀/氯化銀電極和鉑電極,武漢高仕睿聯(lián)科技有限公司。

1.2 石墨烯溶液柵場效應(yīng)晶體管的制備首先對(duì)玻璃基底(10×10×0.7 mm)進(jìn)行清洗處理,將其分別用丙酮、乙醇、H2O超聲清洗各30 min,并用N2吹干。并使用7%的氫氟酸進(jìn)行刻蝕1 min,使用超純水沖洗干凈,并用N2吹干。隨后把玻璃基底放置在掩膜板中在熱蒸發(fā)鍍膜儀中進(jìn)行蒸鍍。先蒸鍍金屬鉻作為粘接層,再蒸鍍金層作為源漏電極,鉻層讓金層更好地貼合于玻璃基底上。最終其厚度為5 nm左右鉻層,70 nm左右的金層。該器件的溝道長度和寬度分別為6 mm和0.25 mm。將購買的石墨烯裁剪成5×5 mm大小,放入由H2O、HCl和CuSO4·5H2O組成的刻蝕液中(50 mL∶50 mL∶10 g)大約30 min后,銅基底被刻蝕干凈,變成透明的PMMA/石墨烯。利用載玻片將PMMA/石墨烯轉(zhuǎn)移到超純水中清洗三次,再將PMMA/石墨烯覆蓋在鍍有源漏極的玻璃基底的溝道位置,過夜干燥。最后,把轉(zhuǎn)移好石墨烯的器件浸入丙酮溶液,依次浸泡3 min,5 min,10 min以除去PMMA層,浸泡完成后,用乙醇沖洗器件,再放置在95 ℃的加熱臺(tái)上加熱10 min。SGGT石墨烯溝道制備完成,儲(chǔ)存在干凈的表面皿中。

1.3 柵極的修飾首先將玻碳電極在麂皮上用Al2O3進(jìn)行拋光,再通過循環(huán)伏安法對(duì)PBS和鐵氰化鉀進(jìn)行掃描(PBS中無雜質(zhì)峰,鐵氰化鉀的氧化還原電位差值小于75 mV),分別在水、乙醇、水中超聲清洗5 min。然后在底液濃度為0.5 %的HAuCl4·3H2O中,以-0.2 V,60 s的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行電沉積。電極在室溫下干燥后,取10 μL,50 μg/mL的anti-AFP于電極表面,4 ℃下放置一夜。使用PBS溶液沖洗電極去除多余抗體,電極表面吹干后,滴10 μL,1%BSA封閉電極,室溫下放置30 min。最后,電極用PBS清洗3次,吹干電極,滴加10 μL不同濃度的AFP抗體,37 ℃,1.5 h。待測電極浸沒在10 mmol/L PBS中保存。

1.4 甲胎蛋白的檢測利用兩個(gè)半導(dǎo)體參數(shù)分析儀Keithley 2450聯(lián)用分析SGGT生物傳感器的性能(圖1),并且通過LabView程序進(jìn)行控制。SGGT裝置在0.01 mmol/L PBS底液中進(jìn)行測試。通過半導(dǎo)體參數(shù)分析儀,以0.01 V/s的掃描速率得到SGGT的轉(zhuǎn)移曲線(IDS/VGS),在柵極范圍在0～1 V,固定的溝道電壓為VDS= 0.05 V下工作。采用電化學(xué)阻抗譜(EIS)的方式對(duì)電極的修飾過程以及電極上anti-AFP最大捕獲量進(jìn)行了測試。EIS在含有0.1 mol/L KCl的5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中采用傳統(tǒng)的三電極體系(玻碳電極、飽和甘汞電極和鉑電極)進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)施加?xùn)艍簳r(shí),溶液柵控場效應(yīng)晶體管體系具有兩個(gè)雙電層:柵極/電解質(zhì)溶液(CG-E)和電解質(zhì)溶液/溝道(CE-C),可以模擬成兩個(gè)平行板電容器的等效電路,如圖2(A)所示。蛋白質(zhì)由兩性離子氨基酸化合物組成,每種蛋白質(zhì)都具有它們自己的等電點(diǎn)(pI)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同pH值的溶液環(huán)境時(shí),它們可以帶正電荷或帶負(fù)電荷。AFP的等電點(diǎn)是4.9,因此在中性的PBS溶液中帶負(fù)電荷。柵電極的表面電位會(huì)受到帶電分子的影響,當(dāng)柵極捕獲目標(biāo)物AFP后,帶負(fù)電荷的AFP在柵極界面產(chǎn)生電偶極子(在圖2(A)藍(lán)色箭頭標(biāo)識(shí)的位置),從而改變晶體管的有效柵電壓。

圖2 (A)雙電層中電位降以及偶極子分布圖和(B)捕獲目標(biāo)物前后轉(zhuǎn)移曲線的變化

(1)

(2)

ΔQ為捕獲目標(biāo)物后的改變電荷,C為SGGT的總電容。CG-E為柵極/電解質(zhì)溶液界面電容,CE-C為電解質(zhì)溶液/溝道界面電容,S活性層的面積。溝道電流IDS的公式如下:

(3)

(4)

式中,VDirac為電中性時(shí)的柵極電壓,此時(shí)的空穴和電子的濃度相等,為最低的電流。電極界面形成的偶極子,誘導(dǎo)電位Δφ可表示為:

(5)

2.2 柵極修飾表征本研究在電化學(xué)工作平臺(tái)上通過EIS研究了柵極界面修飾過程。如圖3(A)所示,裸電極的阻抗值為200 Ω,電沉積一層納米金層時(shí),阻抗值從200 Ω減小到50 Ω,這是因?yàn)榧{米金能加速電子傳遞的速度,導(dǎo)致阻抗值減少。當(dāng)anti-AFP被捕獲在電極上時(shí),阻抗值從50 Ω增加到950 Ω,抗體作為電惰性物質(zhì),降低了電子的傳輸速度,導(dǎo)致阻抗值增大(圖3(B))。同樣,牛血清白蛋白和抗原分子均為非導(dǎo)電生物分子,當(dāng)牛血清白蛋白進(jìn)行封閉后,其阻抗值增加到1 163 Ω。修飾柵極捕獲目標(biāo)物AFP后,其阻抗值進(jìn)一步增加到4 500 Ω。上述分析表明柵極修飾以及對(duì)AFP的捕獲是成功的。

圖3 柵極修飾過程的電化學(xué)阻抗圖譜

2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化對(duì)納米金界面捕獲抗體的最大量進(jìn)行了優(yōu)化來保證足夠的檢測范圍。GCE電沉積納米金層后,滴加不同濃度的anti-AFP濃度(10 μg/mL,20 μg/mL,30 μg/mL,40 μg/mL,50 μg/mL)到該修飾電極上,于4 ℃下培育12 h,隨后通過電化學(xué)阻抗法研究最優(yōu)濃度。如圖4(A)所示,當(dāng)anti-AFP的濃度達(dá)到50 μg/mL時(shí),阻抗值的變化值可忽略不計(jì),因此為了保證anti-AFP有足夠的量去捕獲抗原,選擇anti-AFP的濃度為50 μg/mL。

圖4 (A)抗體固載量和(B)測試底液PBS濃度的優(yōu)化(n=3)

對(duì)于場效應(yīng)晶體管,電解質(zhì)溶液的離子強(qiáng)度對(duì)傳感器的靈敏度影響很大。在電解質(zhì)溶液中,由于靜電相互作用,帶負(fù)電荷的抗體分子被陽離子包圍,這些表面電荷在雙電層的德拜長度(Debye length)內(nèi)是可以被屏蔽的。因此,與柵極的距離大于Debye長度的蛋白質(zhì)對(duì)柵極電位的影響很小。由此可見,與電解質(zhì)的離子濃度相關(guān)的Debye長度會(huì)影響傳感器的性能。在電解質(zhì)溶液中的Debye長度(Debye length)可以由下面的公式定義:

(6)

式中,ε為電解質(zhì)的絕對(duì)介電常數(shù),κ是玻耳茲曼常數(shù),T是溫度,NA是阿伏伽德羅常數(shù),I是溶液的離子強(qiáng)度,q是電荷量。為了檢測Debye長度對(duì)器件性能的影響,分別在不同離子濃度的PBS(20 mmol/L、10 mmol/L、5 mmol/L、1 mmol/L、0.1 mmol/L)中檢測同一濃度的AFP(100 ng/mL)。如圖4(B),當(dāng)離子濃度從1 mmol/L開始增加時(shí),柵壓的偏移量隨著PBS離子濃度的變化有很大的差距,這說明PBS離子濃度超過1 mmol/L時(shí),德拜長度較短,很大程度上影響器件性能變化,不適合該傳感的檢測分析。然而發(fā)現(xiàn)低于1 mmol/L時(shí),柵壓偏移量的差距幾乎可以忽略,這表明Debye長度的進(jìn)一步增加將不會(huì)再明顯影響器件的性能。因此選擇測試液PBS的離子濃度為0.1 mmol/L。

2.4 甲胎蛋白檢測如上所述,該SGGT對(duì)AFP進(jìn)行檢測時(shí),優(yōu)化了柵極的固載量和電解質(zhì)溶液的濃度來提高靈敏度。根據(jù)檢測原理可知,中性電解質(zhì)環(huán)境下,帶負(fù)電荷的抗原分子,在柵極界面產(chǎn)生偶極子,使柵極界面的電位下降,為了保持有效柵壓一致,則需要施加更大的柵壓(VDirac向正方向偏移)。因此,柵極上存在不同數(shù)量的目標(biāo)物對(duì)柵極界面的電位影響不同,柵壓的偏移量也會(huì)不同,可根據(jù)不同濃度目標(biāo)物與柵壓偏移量之間的關(guān)系擬定線性關(guān)系。在固定溝道電壓(VDS= 0.05 V),柵壓范圍從0～1 V,測定轉(zhuǎn)移曲線。如圖5(A-G)所示,隨著目標(biāo)濃度的增加(5 ng/mL至200 ng/mL),轉(zhuǎn)移曲線偏移量逐漸增加,并且呈現(xiàn)了較好的線性關(guān)系ΔVDirac= 45.42lgc+ 4.98(R2= 0.990 1),檢測限為1.00 ng/mL(圖5(H))。相比于其他的生物傳感器,SGGT生物傳感器具有高的靈敏度(表1)。

表1 其他AFP免疫傳感器的性能比較

圖5 (A～F)不同目標(biāo)物濃度下SGGT的轉(zhuǎn)移曲線測試圖,(G)轉(zhuǎn)移曲線測試匯總圖和(H)SGGT的線性圖

2.5 傳感器的選擇性與穩(wěn)定性這里我們選取血液中常見的四種干擾物質(zhì)凝血酶(TB)、人血清白蛋白(HAS)、肌紅蛋白(MB)和癌胚抗原(CEA)對(duì)該SGGT傳感器選擇性進(jìn)行評(píng)估。實(shí)驗(yàn)過程中,除了將目標(biāo)物AFP替換成干擾物質(zhì),其他實(shí)驗(yàn)條件及步驟均不變,記錄下VDirac,其中AFP的實(shí)驗(yàn)濃度為10 ng/mL,其他干擾物質(zhì)的濃度均為50 ng/mL。如圖6(A)所示,當(dāng)存在目標(biāo)物AFP時(shí),其輸出信號(hào)遠(yuǎn)大于干擾物所產(chǎn)生的信號(hào)。該結(jié)果表明,SGGT對(duì)AFP的檢測具有較高的選擇性。使用同一器件在5天內(nèi)隔天重復(fù)測試同一根電極(目標(biāo)物濃度為5 ng/mL)來測試器件以及柵極修飾的穩(wěn)定性。如圖6(B)所示,五天內(nèi)的重復(fù)檢測結(jié)果與初始檢測信號(hào)相差不大,可忽略不計(jì),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了SGGT整體具有較好的穩(wěn)定性。綜上所述,表明該溶液柵控石墨烯晶體管生物傳感器對(duì)甲胎蛋白的檢測具有很高的選擇性和穩(wěn)定性。

圖6 (A)SGGT傳感器的選擇性測試(n=3)和(B)同一個(gè)器件連續(xù)五天測試的穩(wěn)定性測試(n=3)

2.6 血清中AFP的加標(biāo)回收臨床樣品中AFP目標(biāo)物的檢測是在血清中進(jìn)行,血清作為一個(gè)十分復(fù)雜的生理環(huán)境,含有很多的酶、蛋白質(zhì)、激素、無機(jī)物等,因此實(shí)驗(yàn)中非常有必要驗(yàn)證該傳感在血清中是否受到這種復(fù)雜生理環(huán)境的影響。這里我們使用稀釋10倍的人血清作為背景培養(yǎng)液體進(jìn)行人血清加標(biāo)實(shí)驗(yàn),其中AFP的濃度分別為5 ng/mL、30 ng/mL、100 ng/mL。如表2可知檢測結(jié)果準(zhǔn)確,回收率在100.6%～108.0%范圍內(nèi),相對(duì)偏差在0.6%～1.3%之間。這些檢測結(jié)果表明,該SGGT生物傳感器可以應(yīng)用于復(fù)雜的血清環(huán)境中進(jìn)行甲胎蛋白的檢測。

表2 人血清中對(duì)甲胎蛋白的加標(biāo)回收測試 (n=3)

3 結(jié)論

本工作構(gòu)建了無標(biāo)記電位型溶液柵控石墨烯晶體管并對(duì)甲胎蛋白進(jìn)行檢測。采取簡單的抗體功能化柵極捕獲目標(biāo)物,實(shí)現(xiàn)了甲胎蛋白的高選擇性、高靈敏的分析檢測。柵極的成功修飾保證了器件的穩(wěn)定性,并且器件溝道部分實(shí)現(xiàn)了重復(fù)利用。研究表明檢測液離子濃度會(huì)顯著影響柵極界面的德拜長度進(jìn)而影響器件對(duì)AFP的檢測,發(fā)現(xiàn)PBS離子濃度低于1 mmol/L沒有明顯影響。電位型策略主要是根據(jù)轉(zhuǎn)移曲線中性點(diǎn)的偏移量對(duì)甲胎蛋白進(jìn)行定量測試,結(jié)果表明在5 ng/mL至200 ng/mL濃度范圍內(nèi),偏移量與AFP的對(duì)數(shù)濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系:ΔVDirac= 45.42lgc+ 4.98(R2= 0.990 1),檢測限達(dá)到了1.00 ng/mL。綜上所述,SGGT生物傳感器在免標(biāo)記的檢測方面具有很好的應(yīng)用前景,同時(shí)該方法簡單穩(wěn)定、易于集成化,有望實(shí)現(xiàn)高通量檢測。