詹佳琦,陳丹丹,郭田心,郭 香,吳 碩,陳曉陽(yáng),周 瑋,張 慶

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院,廣東木本飼料工程技術(shù)研究中心,廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510642)

隨著中醫(yī)業(yè)的迅猛發(fā)展,中藥渣作為提取中草藥原料所遺留的下腳料,在中成藥、中藥飲品及含中藥成分的日化產(chǎn)品日益增加的同時(shí)其產(chǎn)量也逐漸增加。目前,我國(guó)中藥與天然藥用生物資源的種植面積已經(jīng)超過(guò)了240萬(wàn)hm2,每年中藥渣產(chǎn)量高達(dá)1 200萬(wàn)t[1]。然而無(wú)論是中藥飲品還是醫(yī)療使用的各類藥材,亦或是食療等產(chǎn)生的中藥廢渣均沒(méi)有得到合理的利用。常見(jiàn)的處理中藥渣的方式主要有填埋、焚燒、堆放等,這些處理方式不僅占用土地,導(dǎo)致環(huán)境污染,還會(huì)造成資源浪費(fèi)[1]。隨著可持續(xù)發(fā)展的觀念深入人心,如何有效利用中藥渣引起了人們的廣泛關(guān)注。在積極尋找中藥渣綠色處理方式的同時(shí),我國(guó)畜牧業(yè)在發(fā)展過(guò)程中因受多種因素制約所引起的飼料短缺問(wèn)題也引起了人們的注意,其中優(yōu)質(zhì)牧草供應(yīng)不足是現(xiàn)階段制約我國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展的主要因素之一[2-3]。隨著農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)側(cè)改革的進(jìn)行且在我國(guó)飼料資源不足的現(xiàn)象日益凸顯的情況下,畜牧行業(yè)需要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新型飼料,其中將經(jīng)處理后的中藥渣加工調(diào)制成非常規(guī)飼料可能是有效解決飼料短缺、促進(jìn)廢棄物回收循環(huán)利用的方法之一。

劉瑜彬等的研究表明[4],中藥渣作為發(fā)酵原料發(fā)酵后,不僅具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,且具有一定的藥學(xué)功能,其可以作為飼料原料或功能性添加劑。朱彤等[5]用含中藥渣的發(fā)酵飼料飼喂畜禽后發(fā)現(xiàn),中藥渣的添加可以提高飼料轉(zhuǎn)化率,改善畜禽產(chǎn)品品質(zhì),促進(jìn)豬只生長(zhǎng),同時(shí)在減少不同豬群糞污的排泄量和環(huán)境污染等方面有著獨(dú)特的作用。李華磊等[6]在用“十全大補(bǔ)”發(fā)酵中藥渣對(duì)48頭21日齡仔豬進(jìn)行飼用安全性試驗(yàn)的研究表明,在提高斷奶仔豬生長(zhǎng)性能及其抗氧化力、降低腹瀉率、提高其機(jī)體體液免疫方面,中藥渣有著獨(dú)特的積極作用。目前,中藥渣利用率普遍較低,主要是由于植物源中藥中存在植物細(xì)胞壁,其中大量的活性營(yíng)養(yǎng)成分不易被動(dòng)物利用,因此合理的對(duì)中藥渣進(jìn)行生物發(fā)酵、添加劑處理,不僅能夠破壞中草渣的細(xì)胞壁、降解纖維素、促進(jìn)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)吸收,還能夠有效的減少中藥渣的毒副作用[7]。纖維素酶(Cellulase,CE)是一種能夠?qū)Ｒ恍越到饫w維素的高活性生物催化劑[8]。在青貯中添加纖維素酶可以使結(jié)構(gòu)性碳水化合物更易被水解利用,從而有效地縮短厭氧發(fā)酵周期、促進(jìn)乳酸發(fā)酵[9-10]。果膠酶(Pectase,PE),是一類能夠有效分解果膠質(zhì)的酶,生產(chǎn)飼料時(shí),堿性果膠酶能夠與纖維素酶、半纖維素酶混合,降解植物細(xì)胞壁中的果膠和纖維,同時(shí)釋放出淀粉、蛋白質(zhì)、維生素等物質(zhì),進(jìn)而提高飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。此外,在飼料中添加堿性果膠酶,還可以調(diào)整飼料黏度,從而使動(dòng)物對(duì)飼料的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收效果提升[11]。木聚糖酶(Xylanase,XY)可以使木聚糖類半纖維素降解為低聚糖與木糖,將青貯原料細(xì)胞壁的表面結(jié)構(gòu)打破,令纖維素網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變得松散,比表面積增大,從而使飼料更易被瘤胃微生物附著與分解,進(jìn)而提高飼料的消化率[12]。Desta等人[13]在象草(Pennisetumpurpureum)的青貯試驗(yàn)中添加了木聚糖酶,結(jié)果發(fā)現(xiàn)青貯過(guò)程中水溶性碳水化合物含量和乳酸含量增加,半纖維素的含量降低。

綜上所述,本試驗(yàn)將通過(guò)在中藥渣中添加不同濃度葡萄糖(Glucose,G)和纖維素降解相關(guān)酶制劑,以直接或間接的方式供應(yīng)中藥渣青貯過(guò)程中充分的發(fā)酵底物(可溶性糖碳水化合物),此外在酶類降解反應(yīng)過(guò)程中輔佐以添加產(chǎn)酸能力強(qiáng)的植物乳桿菌菌株加速發(fā)酵進(jìn)程,嘗試改善中藥渣青貯品質(zhì),以期為中藥渣青貯品質(zhì)改善的技術(shù)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)在佛山某中藥飲品加工企業(yè)收集得到廢棄中藥渣,分別命名為中藥渣1[黃芪(AstragaliRadix)、山藥(DioscoreaRhizoma)與茯苓(Poria)混合中藥渣]與中藥渣2[柴胡(BupleurumchinensisDC)]。兩組中藥渣均分別添加不同濃度葡萄糖(G);植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum,LP)與不同的酶(E)組合進(jìn)行34天的青貯,其中酶共3種,分別為纖維素酶(E1)、果膠酶(E2)和木聚糖酶(E3)(酶均產(chǎn)自湖南盛東生物科技有限公司,纖維素酶的酶活為2×104U·g-1,果膠酶活為3×104U·g-1,木聚糖酶的酶活為2×105U·g-1)。

本試驗(yàn)所用植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,LP)為辣木葉(Moringaoleifera,M)青貯飼料中分離并鑒定出的菌株。2019年5月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)啟林北試驗(yàn)田人工采集辣木葉后,立刻帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行切碎并混合均勻,按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)分裝至聚乙烯塑料袋(20 cm×30 cm)中,每袋約200 g,真空封口機(jī)抽真空并密封保存。經(jīng)過(guò)60 d青貯發(fā)酵后開(kāi)袋取樣并進(jìn)行梯度稀釋MRS瓊脂培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)后分離出96株乳酸菌菌株,從中挑選出的植物乳桿菌菌株,培養(yǎng)24小時(shí)后產(chǎn)酸能力較強(qiáng)(pH=3.8)[14]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)一研究不同濃度的葡萄糖對(duì)不同中藥渣青貯品質(zhì)的影響,設(shè)對(duì)照組CK,試驗(yàn)組分別為0.5%G(0.5 g葡萄糖與100 mL蒸餾水混合均勻后,均勻噴灑到200 g中藥渣當(dāng)中)、1%G(1 g葡萄糖與100 mL蒸餾水混合均勻后,均勻噴灑到200 g中藥渣當(dāng)中)。

試驗(yàn)二研究植物乳桿菌和酶制劑對(duì)不同中藥渣青貯品質(zhì)的影響,設(shè)對(duì)照組CK,試驗(yàn)組分別為植物乳桿菌+纖維素酶(LP+E1)、植物乳桿菌+果膠酶(LP+E2)、植物乳桿菌+木聚糖酶(LP+E3),各組中藥渣用量同樣為200 g。其中CK為空白對(duì)照組,添加等量的純水混勻;LP添加量是106cfu·g-1,酶添加劑的添加量均為200 U·g-1。

1.3 試驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定

本試驗(yàn)所涉及指標(biāo)的測(cè)定方法均參照王成等[15]的研究,并在其方法上做適當(dāng)?shù)男薷募把a(bǔ)充。

中藥渣青貯料混合均勻后取出約70.0 g放置于信封袋中,65℃條件下烘2天至恒重,根據(jù)記錄的烘前烘后樣本重量,計(jì)算干物質(zhì)含量[16]。采用蒽酮比色法測(cè)定水溶性碳水化合物(Water-soluble carbohydrate,WSC)含量[17]。

準(zhǔn)確稱取10.0 g中藥渣青貯樣品與90 mL的蒸餾水混合均勻,放置于4℃冰箱中過(guò)夜浸取,搖床震蕩1 min后利用定性濾紙過(guò)濾,采用雷磁pHS-3C型pH計(jì)測(cè)定濾液的pH值[18]。將測(cè)定pH值后的濾液用0.22 μm的水系微孔濾膜過(guò)濾后,再采用島津GC-14型高效液相色譜儀(色譜柱:Shodex Rspak KC-811 s-DVB gel column,日本。檢測(cè)器:SPD-M10AVP)測(cè)定有機(jī)酸[乳酸(Lactic acid,LA)、乙酸(Acetic acid,AA)]的含量[19]。根據(jù)苯酚-次氯酸鈉比色法[21],配制以絕干(NH4)2SO4為標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)銨溶液,并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,經(jīng)預(yù)試驗(yàn)后,向適量樣品浸提液加入5 mL苯酚溶液和4 mL次氯酸鈉溶液,置于95℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)5 min,冷卻后于630 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值,計(jì)算得出氨態(tài)氮(NH3-N)含量。

將20.0 g青貯樣品與180 mL無(wú)菌生理鹽水充分振蕩后逐級(jí)稀釋。30℃條件下用MRS瓊脂培養(yǎng)基和結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基分別培養(yǎng)乳酸菌和大腸桿菌48 h;28℃條件下用孟加拉紅培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母菌和霉菌48 h。平板計(jì)數(shù)法測(cè)定微生物數(shù)量[19-20]。本試驗(yàn)培養(yǎng)基均購(gòu)自廣州鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。

稱取0.5 g中藥渣青貯后干粉,加入濃硫酸和催化劑(硫酸鉀∶硫酸銅,5∶1)消煮完成后,用凱氏定氮儀(FOSS Kjeltec 8400,丹麥)測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量[22]。根據(jù)范氏纖維法[23],使用纖維分析儀測(cè)定酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber,ADF)和中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber,NDF)的含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 19.0進(jìn)行雙因素方差分析(Two-way ANOVA),兩個(gè)因素互作時(shí)用Duncan法對(duì)各組進(jìn)行多重比較,P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯前中藥渣的特性

中藥渣1和中藥渣2的干物質(zhì)含量差異較小(約為32.57%和35.88%)(表1),中藥渣1的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量比中藥渣2高。中藥渣1和中藥渣2的可溶性碳水化合物含量分別是8.79%DM和10.87%DM;粗蛋白含量分別是11.75%DM和10.36%DM。中藥渣1和2表面附著的乳酸菌、酵母菌、霉菌和大腸桿菌數(shù)量均小于2. 00 lg cfu·g-1FM。

表1 中藥渣原料青貯前的特性(±SD,n=3)Table 1 Characteristics of traditional Chinese medicine residues before silage (±SD,n=3)

2.2 添加葡萄糖對(duì)中藥渣青貯品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響

由表2可知,不同濃度的葡萄糖添加到兩類中藥渣中后降低了青貯飼料的pH值(P<0.01),僅在0.5%G添加處理的中藥渣2青貯飼料中作用不明顯。0.5%G處理顯著增加了中藥渣1的干物質(zhì)含量(P<0.05)。添加0.5%G對(duì)不同中藥渣乳酸菌計(jì)數(shù)的變化不同,中藥渣1中乳酸菌含量顯著降低(P<0.05),而中藥渣2的乳酸菌含量卻顯著增加(P<0.05)。在中藥渣1發(fā)酵飼料中,僅在添加1%G處理組中檢出酵母菌。添加0.5%G處理后,中藥渣2中酵母菌含量顯著增加(P<0.05)。此外中藥渣1添加0.5%G后乳酸和乙酸含量顯著增加(P<0.05),中藥渣2添加1%G后,乳酸和乙酸含量顯著下降(P<0.05)。與對(duì)照相比,中藥渣2用1%G處理后,可溶性碳水化合物含量顯著增加(P<0.05)。此外,當(dāng)中藥渣所包含的種類不同時(shí),其干物質(zhì)含量具有顯著差異(P<0.05),中藥渣種類對(duì)pH值、可溶性碳水化合物及粗蛋白含量也有極顯著影響(P<0.01)。不同的添加劑處理與中藥渣種類的交互作用對(duì)乳酸菌、乙酸及可溶性碳水化合物含量具有極顯著影響(P<0.01),對(duì)乳酸含量有顯著影響(P<0.05)。

表2 添加葡萄糖對(duì)中藥渣1和2青貯品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響Table 2 Effects of adding glucose on the silage quality and nutritional value of chinese medicine residue 1 and 2

2.3 添加LP和不同酶對(duì)中藥渣1和中藥渣2青貯品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響

由表3可知,LP與酶制劑混合處理后兩種中藥渣中的干物質(zhì)含量并沒(méi)有發(fā)生明顯變化,但它們顯著降低了pH值(P<0.05)。LP+PE處理后兩種中藥渣中的乳酸菌顯著減少。所有的處理中均未檢測(cè)到霉菌和大腸桿菌,僅在LP+CE處理的中藥渣2中檢測(cè)到酵母菌。LP與不同酶制劑的混合處理均降低了兩種中藥渣的氨態(tài)氮、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量(P<0.05)。與對(duì)照相比,LP+CE處理后的中藥渣1酸性洗滌纖維含量顯著下降(P<0.05),LP+CE和LP+PE處理后的中藥渣1中的中性洗滌纖維含量顯著下降。雖然相較于對(duì)照組,除了LP+CE處理顯著增加了中藥渣1的粗蛋白含量以外(P<0.05),其他試驗(yàn)組中粗蛋白含量并沒(méi)有明顯變化,但添加劑處理對(duì)兩種中藥渣的粗蛋白含量影響極顯著(P<0.01)。

表3 添加LP和不同酶對(duì)中藥渣1和2青貯品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響Table 3 Effects of adding lp and different enzymes on the silage quality and nutritional value of chinese medicine residues 1 and 2

3 討論

3.1 中藥渣原料特點(diǎn)

依據(jù)Jessie等[24]的報(bào)道,飼草的干物質(zhì)含量在30%～35%之間是達(dá)到良好青貯發(fā)酵效果的指標(biāo)之一。兩種中藥渣的干物質(zhì)含量達(dá)到了理想發(fā)酵的要求。中藥多為植物,絕大多數(shù)纖維含量高,根據(jù)黎智華等[25]的研究發(fā)現(xiàn),適宜的纖維含量有利于促進(jìn)動(dòng)物消化道發(fā)育、刺激胃腸蠕動(dòng)及分泌消化液,還可以緩解有害物質(zhì)對(duì)動(dòng)物腸黏膜的損傷,但纖維含量過(guò)高會(huì)降低飼料的適口性,同時(shí)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用。NDF或ADF作為粗纖維中的主要成分,它們是保證奶牛瘤胃正常發(fā)酵的重要指標(biāo)[26]。與王春梅等[27]的研究結(jié)果相比,本研究中藥渣原料的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量相對(duì)較高。利用參與纖維素降解相關(guān)的酶類對(duì)中藥渣進(jìn)行發(fā)酵前期的預(yù)處理,不僅可以使得植物細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)成分得到有效釋放促進(jìn)反芻動(dòng)物對(duì)此類非常規(guī)飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收,被降解的纖維素還能轉(zhuǎn)化為反芻動(dòng)物可利用的可溶性碳水化合物,厭氧條件下為乳酸菌提供充分的發(fā)酵底物、加速發(fā)酵進(jìn)程[28]。當(dāng)前的研究中由于中藥渣的纖維素含量較高,即使其WSC含量能滿足良好發(fā)酵的基本要求(>38 g·kg-1),也無(wú)法確保乳酸菌能夠有效的利用[29]。此外中藥渣表面附著的乳酸菌數(shù)量較低(<5 lg cfu·g-1),這都無(wú)法確保中藥渣在青貯過(guò)程中穩(wěn)定發(fā)酵,致使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)無(wú)法獲得良好保存,因此需要有效的添加劑來(lái)促進(jìn)中藥渣青貯飼料發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌的發(fā)酵并減少營(yíng)養(yǎng)損失。

3.2 添加葡萄糖中藥渣青貯品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值

pH值是衡量青貯飼料品質(zhì)的重要指標(biāo)。一般認(rèn)為青貯飼料pH值低于4.2時(shí),腐敗微生物能被抑制,青貯飼料能得到良好的發(fā)酵效果。但pH值過(guò)低不利于有益菌的生存[19]。根據(jù)何立貴[30]給出的pH值與青貯質(zhì)量之間的關(guān)系標(biāo)準(zhǔn),可知pH值在3.5～4.1范圍內(nèi)最有利于青貯品質(zhì)。在本試驗(yàn)中所有處理組的pH值均低于4.2,這可能是中藥渣青貯后不良微生物(大腸桿菌、霉菌)的生長(zhǎng)受到明顯抑制,達(dá)到良好抑菌效果的原因。張濤等[31]及趙慶杰等[32]的研究表明,乳酸菌可以降低pH值及蛋白質(zhì)的分解,減少干物質(zhì)損失,從而獲得優(yōu)質(zhì)的青貯飼料。在中藥渣青貯發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌是優(yōu)勢(shì)菌種,添加0.5%G更加增長(zhǎng)了中藥渣2中乳酸菌的生長(zhǎng)活性。但根據(jù)Ohmomo等[33]的報(bào)道,許多乳酸菌菌株在pH值低于4.0的環(huán)境下時(shí)耐受性較弱,本試驗(yàn)中各處理組pH值均低于4.0,且添加了不同濃度的葡萄糖后中藥渣的pH值降低,這可能是0.5%G處理的中藥渣1中乳酸菌數(shù)量下降的原因。整個(gè)青貯發(fā)酵期間,無(wú)論是否添加0.5%的葡萄糖,中藥渣1中均未檢測(cè)出酵母菌,可能是因?yàn)橹兴幵?中具有抑制其生長(zhǎng)的活性成分,但是添加1%G后,酵母菌的生長(zhǎng)在中藥渣1中明顯增加,這可能是因?yàn)槌浞值陌l(fā)酵底物給酵母菌的生長(zhǎng)提供了所需養(yǎng)分,使得酵母菌在發(fā)酵初期正常生長(zhǎng),同時(shí),在中藥渣2中添加0.5%的葡萄糖后,可能已達(dá)到了酵母菌生長(zhǎng)所需的最適發(fā)酵底物需求,因此其數(shù)量顯著增加(P<0.05)。氨態(tài)氮含量能反映蛋白的降解速率,當(dāng)粗蛋白被轉(zhuǎn)化成氨態(tài)氮以后,并不能被反芻動(dòng)物有效利用,而是大部分被微生物轉(zhuǎn)化成菌體蛋白,氨態(tài)氮含量越高,意味著蛋白營(yíng)養(yǎng)損失越嚴(yán)重[34]。盡管在當(dāng)前的研究中,添加葡萄糖以后,并沒(méi)有顯著減少氨態(tài)氮含量,但與對(duì)照組相比,所有處理組氨態(tài)氮的含量均有所下降。

3.3 添加LP和不同酶青貯34天后的發(fā)酵中藥渣品質(zhì)

pH值的變化解釋了不良微生物的生長(zhǎng)情況。青貯34天以后,在中藥渣青貯飼料中均未檢測(cè)到大腸桿菌、酵母菌、霉菌的存在,這可能是因?yàn)檩^強(qiáng)的酸性條件抑制了其生長(zhǎng)活性。纖維含量是評(píng)價(jià)粗飼料品質(zhì)最主要的指標(biāo)之一,中藥渣在添加LP與不同酶組合的青貯添加劑后,酸洗洗滌纖維和中性洗滌纖維含量顯著減少(P<0.05),這可能是由于酶制劑有效地將纖維素降解成了微生物可直接利用的單糖,加速了乳酸菌發(fā)酵進(jìn)程,產(chǎn)生大量的有機(jī)酸,這個(gè)變化規(guī)律與pH值的變化也是一致的[35]。此外,添加LP與不同酶的組合后,中藥渣粗蛋白含量增加同時(shí)減少了氨態(tài)氮的產(chǎn)生。

4 結(jié)論

由本試驗(yàn)可知添加不同濃度的葡萄糖能有效降低中藥渣青貯飼料的pH值,添加植物乳桿菌與纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶的不同組合對(duì)于降低中藥渣青貯飼料的pH值、減少蛋白降解及降低中藥渣纖維素含量等具有良好效果,中藥渣作為非常規(guī)飼料開(kāi)發(fā)具有較大可行性。