鄭楊晨,趙峻祥,劉宇洋,卞彬彬,孔令芝,李井春,李雁冰*

(1.黑龍江八一農墾大學動物科技學院,黑龍江省寒區(qū)飼料資源高效利用與營養(yǎng)調控重點實驗室,黑龍江大慶 163319;2.農業(yè)農村部東北平原農業(yè)綠色低碳重點實驗室,黑龍江 大慶 163319)

春蓼(Polygonumpersicaria)屬于蓼科(Polygonaceae)植物,是一年生草本植物,主產于我國北部和西南各地,主要集中在華東、華中、華南等地,延伸至東北一帶,黑龍江地區(qū)尤以春蓼居多[1]。早在1952年春蓼浸膏就以被批準用于治療便秘[2]。眾多研究表明蓼科蓼屬植物具有良好的中藥作用,常見的有頭花蓼(Polygonumcapitatum)、木天蓼(Actinidiapolygama)、辣蓼(Polgonumhydropiper)等,其主要有效成分是黃酮類、醌類、苯丙類化合物等,藥理作用包括抗菌、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、止痛、殺蟲[3-5]。有研究學者和養(yǎng)殖者應用辣蓼飼喂畜禽,對畜禽疾病進行防治,并取得良好效果[6-7]。春蓼同為蓼屬植物,其藥理作用可能相同。

濕貯玉米又稱高水分玉米、高濕玉米,與干玉米或蒸汽壓片玉米相比,濕貯玉米收獲時間早,省去了干燥、蒸汽加熱和機械壓片等過程,具有瘤胃淀粉消化率較高的特點,近年來逐漸受到畜牧業(yè)的關注和應用[8]。但濕貯玉米的營養(yǎng)價值受收獲時含水量和加工制作方法等多種因素的影響,易出現腐敗發(fā)霉變質等現象,飼喂腐敗變質飼料可引發(fā)多種疾病[9-10]。

近年來,國內外研究表明,動物飼料品質可以顯著影響畜禽腸道微生物群落的發(fā)展,腸道沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌是常見食源性致病菌,飼料對其來說是一個次優(yōu)環(huán)境,有害菌株經飼料傳播已被證明會影響畜禽的健康[10-15]。目前畜牧業(yè)多主張防患大于治療,且自2020年7月1日起,國家農業(yè)農村部開始施行“禁抗令”,所有商業(yè)飼料生產中停止使用促生長用抗生素。2022年兩會再次強調糧食安全的重要性,要把“藏糧于地,藏糧于技”落實到位[16]。蓼屬植物中的多種活性成分以及發(fā)酵中藥方式長足的進步,使得中草藥春蓼與飼料混合青貯的探究對畜禽健康、動物產品安全和替代抗生素具有更重要的意義。目前研究多以辣蓼等蓼屬植物為主,春蓼研究較少,因此本研究旨在探索以不同比例春蓼與濕貯玉米混合青貯對飼料抑菌能力的影響,為進一步開發(fā)春蓼作為飼料添加劑資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 青貯原料及菌株來源

玉米購自黑龍江省哈爾濱市,全株春蓼采自黑龍江省大慶市。大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli),金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus),雞沙門氏菌(Salmonellagullinarum)由黑龍江八一農墾大學動物科技學院預防獸醫(yī)研究室分離、鑒定,由黑龍江八一農墾大學動物科技學院動物營養(yǎng)研究所保存。

1.2 試驗設計

試驗以濕貯玉米為材料,將陰干后的全株春蓼用粉碎機粉碎,粉碎后的粉末過四號篩,放進實驗室無菌樣品袋保存?zhèn)溆?。試驗?個處理,為無春蓼添加對照組、5%春蓼添加組、10%春蓼添加組。將濕貯玉米、春蓼按上述比例混勻裝入真空包裝袋,每袋300 g,使用真空包裝機排盡空氣進行真空包裝。各處理重復3次,置于通風陰涼處,分別在3,7,14,30,60天進行開封檢測。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1發(fā)酵品質測定 pH值采用pH計測定(PSH-3C,選自上海虹益儀器儀表有限公司)。測定后保留適量混合溶液。有機酸使用中速定性濾紙(102,杭州富陽北木漿有限公司)過濾后,利用高效液相色譜法測定有機酸的含量。色譜條件為:色譜柱Carbomix H-HP5(8%交聯度,5 μm,8%交聯度,7.8×300 mm);流動相2.5 mmol·L-1硫酸,臨用前用超聲波脫氣;流速0.6 mL·min-1,進樣10 μL;溫度55℃,進樣量10 μL,檢測器為示差檢測器。

1.3.2營養(yǎng)成分測定 干物質(Dry matter,DM)參照劉宇洋等[17]的方法將開封后的青貯飼料放置于65℃電熱鼓風干燥箱(DGG-9240B,上海森信實驗儀器有限公司),烘干48 h,稱量差值得出干物質含量。

1.3.3微生物數量測定 取開封的青貯飼料樣本20 g分別與180 mL滅菌生理鹽水(0.85%)混合,并逐層稀釋,進行微生物數量的檢測。參考張嘉懿等[18]的方法測定乳酸菌(Lacticacidbacteria)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、酵母菌(Yeasts)數量(MRS培養(yǎng)基、VRBA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基購自青島海博生物技術有限公司),使用電熱恒溫培養(yǎng)箱(DRP-9272,上海森信實驗儀器有限公司)37℃培養(yǎng)48 h。

1.3.4有氧穩(wěn)定性 將青貯飼料樣品放入1 L的聚乙烯罐中,罐口完全敞開,使用雙層醫(yī)用無菌紗布覆蓋,防止干燥和污染,樣本正中插入溫度計,敞口放置,環(huán)境溫度為實驗室室溫。每日2次(6∶00,18∶00)記錄室溫和所有樣本的溫度,當樣本的溫度超過室溫2℃時判定為樣本腐敗,以此作為判定標準[19]。

1.3.5代謝組學分析 春蓼乙酸乙酯提取液作為檢測樣本(每個樣本三個重復)由上海派森諾生物科技有限公司采用LC-MS/MS檢測技術對其進行生物體系代謝產物進行分析。色譜條件:Thermo Vanquish(Thermo Fisher Scientific,USA)超高效液相系統(tǒng),使用ACQUITY UPLCR HSS T3(2.1×150 mm,1.8 um)(Waters,Milford,MA,USA)色譜柱,0.25 mL·min-1的流速,40℃的柱溫,進樣量2 μL。正離子模式,流動相為0.1%甲酸乙腈(B2)和0.1%甲酸水(A2),梯度洗脫程序為:0～1 min,2% B2;1～9 min,2%～50% B2;9～12 min,50%～98%B2;12～13.5 min,98% B2;13.5～14 min,98%～2% B2;14～20 min,2% B2。負離子模式,流動相為乙腈(B3)和5 mM甲酸銨水(A3),梯度洗脫程序為:0～1 min,2% B3;1～9 min,2%～50% B3;9～12 min,50%～98% B3;12～13.5 min,98% B3;13.5～14 min,98%～2%B3;14～17 min,2% B3[20]。質譜條件:Thermo QExactive Focus質譜檢測器(Thermo Fisher Scientific,USA),電噴霧離子源(ESI),正負離子模式分別采集數據。正離子噴霧電壓為3.50 kV,負離子噴霧電壓為-2.50 kV,鞘氣30 arb,輔助氣10 arb。毛細管溫度325℃,以分辨率70 000進行一級全掃描,一級離子掃描范圍m/z 100～1 000,并采用HCD進行二級裂解,碰撞能量為30 ev,二級分辨率為17 500,采集信號前3離子進行碎裂,同時采用動態(tài)排除去除無必要的MS/MS信息[21]。

1.4 青貯后接種有害菌抑菌試驗

在青貯30,60天開封時,取120 g青貯飼料添加1×105cfu·mL-1的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌混勻,取試驗室無菌樣品袋,將每袋120 g的飼料平均分裝到12個樣品袋中,每袋約為10 g,用真空封口機封口,放置室溫下青貯。設置4個不同青貯時間,分別為8 h,24 h,48 h,72 h,分別在對應時間使用平板涂布法檢測三種有害菌菌數。

1.5 數據統(tǒng)計

用Microsoft Excel 2021整理數據,采用SPSS 26.0統(tǒng)計分析軟件對數據進行單因素ANOVA分析﹐采用Duncan氏法進行多重比較,結果以“平均值±標準差”表示;均以P<0.05為差異顯著性判斷標準。采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件中一般線性模型單變量方差分析實現交互效應的方差分析,均以P<0.05為顯著具有交互效應判斷標準;以P<0.01為具有極顯著交互效應判斷標準。

將春蓼代謝產物數據通過Proteowizard軟件包(v3.0.8789)[22]中MSConvert工具將原始質譜下機文件轉換為mzXML文件格式。采用R XCMS軟件包[23]進行峰檢測、峰過濾、峰對齊處理,得到物質定量列表,參數設置有bw=2,ppm=15,peakwidth=c(5,30),mzwid=0.015,mzdiff=0.01,method=‘centWave’。采用公共數據庫HMDB[24],massbank[25],LipidMaps[26],mzcloud[27],KEGG[28]及自建物質庫進行物質的鑒定,參數設置為ppm<30。采用總峰面積歸一化的方法實現數據校正,消除系統(tǒng)誤差。

2 結果與分析

2.1 原料指標的檢測

青貯原料組成成分如表1所示。春蓼含水量為73.83%,pH值為5.90,乳酸菌、酵母菌、大腸桿菌數量分別為7.55,7.49,7.37 lg cfu·g-1,玉米籽粒含水量34.20%,pH值為5.88,乳酸菌、酵母菌、大腸桿菌數量分別為5.78,4.10,2.88 lg cfu·g-1。

表1 青貯原料組成Table 1 The composition of silage raw materials

2.2 春蓼不同添加量對濕貯玉米發(fā)酵品質的影響

由表2可知,經過不同時間發(fā)酵處理的各組,其干物質含量、pH值、乳酸菌數量、酵母菌數量和大腸桿菌數量存在顯著差異(P<0.05)。

表2 春蓼不同添加量對濕貯玉米中微生物菌數的影響Table 2 Effect of different adding amount of Polygonum persicaria on microbial number in high moisture corn

發(fā)酵3天時,添加組干物質含量顯著低于對照組(P<0.05),其余時間段內各組干物質含量無顯著差異,添加組pH值顯著高于對照組(P<0.05),10%春蓼pH值最高,達4.04;7天時,添加組pH值迅速下降,顯著低于對照組(P<0.05),14天時,10%春蓼pH值略有上升,與對照組無顯著差異,5%春蓼組pH值顯著低于其余兩組(P<0.05);30天時,10%春蓼組pH值顯著高于其余兩組,在60天時,各添加組pH值無顯著差異,都顯著低于對照組(P<0.05)。

發(fā)酵3天和7天時,添加組乳酸菌數量都顯著高于對照組(P<0.05);14天和30天時,各組乳酸菌數量沒有顯著差異;60天時,5%春蓼組乳酸菌數量低于對照組和10%春蓼組(P<0.05),10%春蓼組乳酸菌數量與對照組無顯著差異;各組乳酸菌數量隨著發(fā)酵時間延長呈緩慢下降的趨勢。各組酵母菌數量在3天時沒有顯著差異;7天時,10%春蓼組酵母菌數量顯著高于其余兩組(P<0.05);14天時,添加組酵母菌數量顯著低于對照組(P<0.05),其中,10%春蓼組沒有檢測到酵母菌;30天時,各組酵母數量迅速增高,10%春蓼組酵母菌數量從0增加到8.18 lg cfu·g-1,添加組酵母菌數量顯著低于對照組(P<0.05);60天時,5%春蓼組酵母菌數量顯著高于其余兩組(P<0.05)。發(fā)酵3天時,10%春蓼組大腸桿菌數量顯著高于其余兩組(P<0.05),7天時,10%春蓼組大腸桿菌數量迅速降低,但與對照組沒有顯著差異,5%春蓼組大腸桿菌數量顯著低于其余兩組(P<0.05);14天時,添加組大腸桿菌數量顯著低于對照組(P<0.05),5%春蓼組大腸桿菌數量顯著低于10%春蓼組(P<0.05);發(fā)酵30天后,各組均未檢測到大腸桿菌。

由表3可知,濕貯玉米中添加春蓼,乳酸和乙酸含量各組之間存在顯著差異(P<0.05)。發(fā)酵3天、14天時,各組乳酸含量沒有顯著差異,7天、30天和60天時,添加組乳酸含量均顯著高于對照組(P<0.05);發(fā)酵3天、7天時,各組乙酸含量沒有顯著差異,30天時,5%春蓼組乙酸含量顯著高于其余兩組(P<0.05),對照組乙酸含量最低,60天時,10%春蓼組顯著高于其余兩組(P<0.05),各組乳酸、乙酸含量均隨著發(fā)酵時間延長呈先升高后下降的趨勢。

2.3 添加春蓼對濕貯玉米有氧穩(wěn)定性的影響

由表4可知,發(fā)酵3天、7天時各組有氧穩(wěn)定性天數類似,發(fā)酵14天時,添加春蓼組的有氧穩(wěn)定性天數升高,發(fā)酵30天時,5%春蓼組有氧穩(wěn)定性天數顯著提升,發(fā)酵60天時,10%春蓼組有氧穩(wěn)定性天數為各組最佳,達到7天。

表4 添加春蓼對濕貯玉米有氧穩(wěn)定性的影響Table 4 Effects of Polygonum polygonum on aerobic stability of high moisture corn

2.4 全株春蓼對青貯30天后濕貯玉米混合青貯抑菌效果的影響

由表5可知,添加大腸桿菌的各組中,只有發(fā)酵72 h時檢測到了大腸桿菌,且各添加組大腸桿菌數量顯著低于對照組(P<0.05)。

表5 青貯30天后全株春蓼添加對濕貯玉米抑菌效果的影響Table 5 Effect of whole plant Polygonum persicaria addition on the bacterial inhibition of high moisture corn after 30 days of silage

添加金黃色葡萄球菌的各組中,發(fā)酵8 h,24 h和48 h時,各添加組金黃色葡萄球菌數量都顯著低于對照組(P<0.05),其中,24 h和48 h時,10%春蓼組金黃色葡萄球菌數量顯著低于5%春蓼組(P<0.05),72 h時,各組金黃色葡萄球菌數量與對照組沒有顯著差異。

添加沙門氏菌的各組中,在發(fā)酵8 h和72 h時,均未檢測到沙門氏菌,24 h時,添加組沒有檢測到沙門氏菌,48 h時,5%春蓼組沙門氏菌數量與對照組沒有顯著差異。

2.5 全株春蓼對青貯60天后濕貯玉米混合青貯抑菌效果的影響

由表6可知,添加大腸桿菌和沙門氏菌的各組均未檢測到菌。

表6 發(fā)酵60天后全株春蓼添加對濕貯玉米抑菌效果的影響Table 6 Effect of whole plant Polygonum persicaria addition on the bacterial inhibition of high moisture corn after 60 days of silage

添加金黃色葡萄球菌的各組中,10%春蓼組在各個時間段內均未檢測出金黃色葡萄球菌,5%春蓼組在8 h未檢測到金黃色葡萄球菌,在其他時間段內,5%春蓼組金黃色葡萄球菌數量均低于對照組(P<0.05)。

2.6 春蓼乙酸乙酸萃取液代謝產物

圖1為春蓼萃取液總離子流圖,其中縱坐標表示收集存儲離子的電流總強度,橫坐標表示離子的生成時間或連續(xù)掃描的掃描次數,其中,每個峰的峰面積代表某種代謝產物的濃度,也可以說是某種離子的總量。

圖1 春蓼萃取液總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of extract of Polygonum persicaria

由表7可知,春蓼乙酸乙酯萃取液表達量最高的代謝產物主要為黃酮類化合物(金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、山奈酚、槲皮苷和異槲皮苷等物質),姜酚類化合物(姜酚),兩種酚酸類化合物(兒茶素沒食子酸酯和三羥基苯甲酸)和其他類化合物(2,4,6-三氨基甲苯、乙酰酰胺、三羥基苯甲酸、5-戊基間苯二酚、吡唑醚菌酯、瑟丹酸內酯和膽堿)。

表7 春蓼乙酸乙酯萃取液中表達量高的前20個代謝產物Table 7 The top 20 high-expressed metabolites in the ethyl acetate extract of Polygonum persicaria

3 討論

3.1 全株春蓼添加對濕貯玉米青貯品質的影響

要保證青貯的發(fā)酵品質,就要形成一個良好的以乳酸菌為主導的厭氧環(huán)境,而評判的指標主要就是pH值及有機酸含量。本試驗中,發(fā)酵3天時,添加春蓼的pH值顯著高于對照組(P<0.05),可能是由于春蓼所含的一些有效成分增加了青貯原料的緩沖能值[29],使得添加組pH值高于對照組,發(fā)酵7天后,添加組pH值便基本趨于穩(wěn)定且顯著低于對照組(P<0.05)。乳酸在青貯飼料方面發(fā)揮著重要作用,乳酸含量越高則青貯品質越好,本試驗中乳酸含量呈先增高后降低的趨勢,這可能與春蓼中的黃酮類物質有關,前期黃酮類物質抑制了有害微生物繁殖,促進了乳酸菌的生長,從而產生了大量乳酸,降低了pH值,這與王妍等人[30]的研究相似;由于游離乳酸的積累,pH值迅速下降也會抑制乳酸菌的生長,進而抑制了青貯中乳酸的產生,致使后期乳酸含量降低[31];添加組在發(fā)酵14天后酵母菌數量顯著低于對照組(P<0.05),在30天和60天時,都未檢測出大腸桿菌,這是由于低pH值的環(huán)境下,大腸桿菌生長受到抑制;值得注意得是,在發(fā)酵60天時,10%春蓼組乙酸含量顯著高于其余兩組,這可能與蓼屬植物地上部分含有少量甲酸和乙酸有關[32],這將有效抑制不利微生物生長,提高青貯發(fā)酵品質,防止青貯飼料腐敗變質[33]。

3.2 全株春蓼添加對濕貯玉米有氧穩(wěn)定性的影響

在對濕貯玉米中添加春蓼的有氧穩(wěn)定性試驗結果發(fā)現,發(fā)酵60天后的10%春蓼組有氧穩(wěn)定性最好,有氧穩(wěn)定性天數顯著高于其他各組,達到168 h,從開封檢測結果可以看出,10%春蓼組在60天時,酵母菌沒有被檢測到,乙酸含量顯著高于各組,為0.60 g·kg-1DM,其余兩組在60天乙酸含量降低,而10%春蓼組在60天時乙酸含量反而升高,由于乙酸可以抑制好氧微生物的活性,提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性,因此10%春蓼組有氧穩(wěn)定性最好[33]。這與嚴波等人[34]在研究紫花苜蓿、稻秸與干酒糟及其可溶物(Distillers dried grains with solubles,DDGS)混合青貯中發(fā)現,添加乙酸青貯飼料有氧穩(wěn)定性提升的結果相似。并且10%春蓼組相較于其他兩組,含有更多的黃酮類化合物,黃酮類化合物有較好的抗菌、抗氧化性,抑制細菌、霉菌的生長,有利于濕貯玉米有氧穩(wěn)定性。李偉等人[35]研究發(fā)現甘草細胞中提取的黃酮粗提液具有相同功效。因此將春蓼作為青貯添加劑與青貯原料共同發(fā)酵有利于青貯的有氧穩(wěn)定性的提高,但春蓼對青貯原料發(fā)酵品質和有氧穩(wěn)定性的研究少有報道,其中的發(fā)酵過程和代謝物之間的變化還有待進一步研究。

3.3 全株春蓼添加對濕貯玉米抑菌效果的影響

本試驗分得的20個代謝產物中,有10個為黃酮類成分,其很可能是春蓼抑菌抗氧化活性物質。春蓼主要檢測的前20種代謝產物為金絲桃苷、糖苷蘆丁衍生物、槲皮素、山奈酚、槲皮苷和異槲皮苷、姜酚、兒茶素沒食子酸酯、三羥基苯甲酸等物質,其中金絲桃苷、糖苷蘆丁衍生物都屬于槲皮素衍生物[36],槲皮素對于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等有害菌都有顯著抑菌效果[37-38]。而姜酚清除氧自由基能力比維生素E強,具有抗氧化、抗炎、抗凝等多種生物活性,還有抗病原微生物、殺菌防腐的功效[39-40]。目前也有研究發(fā)現兒茶素沒食子酸酯也具有抑菌、抗炎、抗氧化等功能[41]。試驗中,發(fā)酵30天后的青貯飼料各組,在發(fā)酵8 h,24 h和48 h時,均未檢測到大腸桿菌,各組pH值均低于4.2,大腸桿菌未檢測到可能與青貯飼料的低pH值有關,也可能與春蓼有效成分有關。從發(fā)酵30天時青貯料各項指標中可以看出發(fā)酵并未穩(wěn)定,乳酸菌和酵母菌數量也沒有保持穩(wěn)定,可能造成發(fā)酵72 h時飼料環(huán)境中的pH升高,因此飼料各組均檢測到了大腸桿菌,但各添加組的大腸桿菌數量均顯著低于對照組,這可能與添加組中春蓼的有效成分有關。春蓼中含有多種黃酮類化合物,黃酮類化合物是蓼屬植物最主要的次生代謝產物,廣泛存在于蓼屬植物中,具有抗菌、抗氧化、清除自由基等作用[42]。其中,抗菌作用是目前國內外主要研究的方向,本次抑菌試驗中,添加組有害菌數量顯著低于對照組(P<0.05),這與黃酮類化合物的抗菌功效有很大的聯系,宋立立等人[43]研究發(fā)現報道銀杏葉中的黃酮成分可以有效抑制病原微生物的生長,將其作為飼料添加劑,可以有效提高動物生成性能和治療由細菌引起的疾病,對產氣型腸桿菌和大腸桿菌均有良好的抑制效果;眾多學者[44-45]研究表明黃酮類化合物中槲皮素抑制沙門氏菌的能力最強,最低抑菌濃度為0.063 mg·mL-1,槲皮素用于抑制金黃色葡萄球菌生長的濃度為2 mg·mL-1。從青貯飼料抑菌試驗結果看出,10%春蓼處理比5%春蓼處理的金黃色葡萄球菌數量更低,可能與春蓼添加量有一定關系。雖然低pH值對于有害菌的影響是主要的[45],但是當對照組中含有有害菌時,添加組的有害菌數量總是低于對照組,這與黃酮類化合物的抑菌機制有很大的關系。目前對春蓼的研究較少,其藥理作用機制尚不明確,故后期應以該方面為重點,以期為進一步開發(fā)利用該植物提供基礎。

4 結論

10%春蓼添加量顯著改善濕貯玉米發(fā)酵品質及有氧穩(wěn)定性。春蓼對三種有害菌均有抑制能力,且10%春蓼添加量對金黃色葡萄球菌及沙門氏菌抑制能力較5%添加量更佳。春蓼代謝產物主要含有黃酮類、姜酚類化合物。