陳笛 溫昌明 李祥欣 孫軍 高軍 張?jiān)谛?張東煥 張保朝

(南陽(yáng)市中心醫(yī)院,河南 南陽(yáng) 473000)

腦梗死(CI)是一種多發(fā)于中老年人群的常見(jiàn)急性腦血管疾病,臨床上稱為缺血性腦卒中,發(fā)病急,可在短時(shí)間內(nèi)引發(fā)序慣性腦損傷,嚴(yán)重?fù)p害神經(jīng)功能,患者致死、致殘比例均較高〔1,2〕。CI起病急且病情進(jìn)展快,往往錯(cuò)過(guò)最佳治療窗口,臨床治愈率低,預(yù)后不佳,如今其患病人數(shù)逐年增加,已成為中老齡人群殘疾及死亡的主要原因〔3,4〕。腦缺血損傷發(fā)生時(shí),因供血受阻引起缺血部位腦組織壞死,激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),而血液再灌注時(shí),會(huì)促進(jìn)炎癥進(jìn)展,進(jìn)一步加重腦損傷,因而抑制神經(jīng)炎癥是減輕缺血再灌注腦損傷、修復(fù)神經(jīng)功能的有效手段〔5,6〕。Toll樣受體(TLR)4/核因子(NF)-κB是機(jī)體調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)代謝、過(guò)氧化和炎癥反應(yīng)的主要信號(hào)途徑〔7〕,抑制TLR4/NF-κB信號(hào)激活可降低炎性因子表達(dá),增強(qiáng)抗氧化活性,減輕腦組織炎癥和氧化應(yīng)激損傷,改善急性CI患者神經(jīng)功能〔8〕。CC類趨化因子配體(CCL)2是TLR4/NF-κB途徑的下游信號(hào)因子,下調(diào)TLR4/NF-κB信號(hào)可降低CCL2的表達(dá),抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),保護(hù)腦組織免于缺血損傷,因而TLR4/NF-κB/CCL2信號(hào)可作為CI的重要治療靶點(diǎn)〔9〕。微小RNA (miR)-124是介導(dǎo)阿爾茨海默病、創(chuàng)傷性腦損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生與進(jìn)展的重要因子,過(guò)表達(dá)miR-124-3p可減輕重復(fù)性輕度創(chuàng)傷性腦損傷小鼠神經(jīng)退行性病變,改善其認(rèn)知功能〔10〕,并可減少膠質(zhì)瘢痕的形成,促進(jìn)CI恢復(fù)〔11〕,另有研究顯示,miR-124可通過(guò)下調(diào)TLR4/NF-κB/CCL2通路激活程度減輕高氧誘導(dǎo)的過(guò)度炎癥,抑制肺上皮細(xì)胞凋亡〔12〕。因而推測(cè)miR-124可能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB/CCL2信號(hào)減輕腦缺血損傷所致的神經(jīng)元凋亡,本文通過(guò)建立CI大鼠模型,對(duì)此進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 SD大鼠,雄性,體質(zhì)量200～230 g,SPF級(jí),購(gòu)于上海昇敞生物科技有限公司〔生產(chǎn)許可SCXK(滬)2021-0002〕。在南陽(yáng)市中心醫(yī)院屏障環(huán)境動(dòng)物房適應(yīng)飼養(yǎng),在動(dòng)物籠中喂養(yǎng),一籠5～6只,平均溫度(23±2.5)℃,平均濕度(55±5)%,照明12 h/12 h明暗循環(huán)交替,1 w后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑及儀器 miR-124 agomir、TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、miR-124 agomir陰性對(duì)照、空載質(zhì)粒、miR-124 與U6引物、一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒(貨號(hào)B639277-0100)購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司;大鼠白細(xì)胞介素(IL)-17酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(貨號(hào)SEKR-0007)、三苯基氯化四氮唑(TTC,貨號(hào)T8170)、大鼠環(huán)氧化酶(COX)-2 ELISA試劑盒(SEKR-0075)、高效RIPA裂解液(貨號(hào)R0010)、總RNA提取試劑盒(貨號(hào)R1200)購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;活性氧(ROS)測(cè)定試劑盒(貨號(hào)E004-1-1)、TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)G001-1-1)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)C503021)購(gòu)于南京建成生物工程研究所有限公司;兔源Anti-β-actin一抗(貨號(hào)ab8227)、兔源Anti-CCL2一抗(貨號(hào)ab7202)、兔源Anti-B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白(Bcl-2)一抗(貨號(hào)ab194583)、兔源Anti-增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)一抗(貨號(hào)ab18197)、兔源Anti-NF-κB p65一抗(貨號(hào)ab16502)、兔源Anti-Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)一抗(貨號(hào)ab32503)、兔源Anti-TLR4一抗(貨號(hào)ab214185)、羊抗兔二抗(貨號(hào)ab150077)購(gòu)于美國(guó)Abcam公司等。

冰凍切片機(jī)、光學(xué)顯微鏡-型號(hào)CM1520、DMI3000B購(gòu)于德國(guó)Leica公司;電泳儀、全段酶標(biāo)儀、化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀、轉(zhuǎn)膜儀-型號(hào)PowerPac Universal、1681135、ChemiDoc XRS+、CFX96 Touch 1855196、Trans-Blot Trubo,購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司等。

1.3制備CI大鼠模型及分組給藥 參照文獻(xiàn)〔13〕的方法制備大鼠CI模型:大鼠禁食12 h,禁水4 h,腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%)溶液,大鼠深度麻醉后仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上,于頸部脫毛備皮、酒精消毒,切開(kāi)頸部皮膚逐層分離肌肉組織,找到并游離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈與頸內(nèi)動(dòng)脈,結(jié)扎頸外動(dòng)脈后以特定線栓插入其中,經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈到達(dá)大腦中動(dòng)脈,阻斷中動(dòng)脈血流2 h,然后拔出線栓,恢復(fù)血流,再灌注24 h,即可完成造模。接著觀察大鼠行為,采用Zea Longa分級(jí)法〔14〕做神經(jīng)功能缺損狀況評(píng)分:大鼠行為正常,0分;大鼠左前肢伸展不完全,1分;提尾大鼠時(shí),其向左側(cè)轉(zhuǎn)圈,2分;大鼠行走不便,向左側(cè)傾倒,3分;大鼠不能行走,幾乎無(wú)意識(shí),4分,評(píng)分1～3分表示建模成功,共成功造模60只。以隨機(jī)數(shù)表法將CI大鼠平均分為5組:模型組、miR-124 agomir組、TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組、miR-124 agomir陰性對(duì)照+空載質(zhì)粒組、miR-124 agomir+TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組,另取12只大鼠只分離頸動(dòng)脈,不做其他操作,作為假手術(shù)組。miR-124 agomir、TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、miR-124 agomir陰性對(duì)照、空載質(zhì)粒濃度參照說(shuō)明書(shū)設(shè)置,給藥處理組均于造模完成后,馬上以尾靜脈注射的方法干預(yù)給藥;模型組和假手術(shù)組尾靜脈注射等量0.9%氯化鈉溶液,各組均每周給藥1次,共給藥處理2 w。

1.4檢測(cè)神經(jīng)功能 于造模完成2 w后觀察大鼠行為,按照1.3中的Zea Longa分級(jí)法對(duì)其神經(jīng)功能缺損狀況進(jìn)行評(píng)分。

1.5檢測(cè)CI情況及收集標(biāo)本 神經(jīng)功能缺損評(píng)分完成后,按照1.3中方法麻醉各組大鼠,抽取頸動(dòng)脈血離心15 min(1 000 r/min,4 ℃),吸出上清分組標(biāo)記后保存在-80 ℃;斷頭取出大腦,每組隨機(jī)選6只大鼠的大腦沿冠狀面切開(kāi)后孵育TTC溶液,對(duì)其梗死部位進(jìn)行染色,以多聚甲醛溶液固定后拍照,采用Image pro軟件分析圖片,計(jì)算CI面積=全腦梗死面積/全腦片面積×100%。各組剩余的6只大鼠大腦清洗后,各取0.4 g腦組織保存在液氮中;再次各取0.5 g腦組織制為勻漿液后離心20 min(3 000 r/min,4 ℃),以BCA試劑盒測(cè)量上清中總蛋白濃度,分組標(biāo)記,保存在-80 ℃?zhèn)溆?剩余腦組織包埋、沉糖、速凍(液氮,1 min)成塊、切片備用。

1.6檢測(cè)海馬神經(jīng)元凋亡情況 取1.5中腦組織切片,選出其中具有完整海馬結(jié)構(gòu)的,浸入預(yù)冷的丙酮中固定,TUNEL染色,顯微鏡下觀察,選任意3個(gè)視野拍照,以Image pro軟件分析圖片,計(jì)算神經(jīng)元凋亡率=凋亡神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7檢測(cè)血清ROS及炎癥因子COX-2、IL-17水平 取1.5中血清,經(jīng)冰水浴解凍后,以試劑盒測(cè)定其中ROS及炎癥因子COX-2、IL-17水平,具體步驟依照說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)進(jìn)行。

1.8檢測(cè)腦組織miR-124表達(dá) 取1.5中保存在液氮中的腦組織塊,以試劑盒提取其中總RNA后,進(jìn)行一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn),具體步驟與反應(yīng)條件設(shè)定依照說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)進(jìn)行,miR-124的內(nèi)參基因選擇U6,采用2-ΔΔCt算法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后得到其相對(duì)表達(dá)量,引物序列:miR-124正向5′-GCGCTGGAGGAGAAGGAAG-3′,反向5′-GCTGTCAACGATACGCTACG-3′;U6正向5′-CGCTTCGGCA GCACATATAC-3′,反向5′-AAATATGGAACGCTTC ACGA-3′。

1.9檢測(cè)大鼠腦組織凋亡與TLR4/NF-κB/CCL2通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取1.5中的各組腦組織蛋白樣品液,經(jīng)冰水浴解凍后各取20 μg蛋白,經(jīng)變性,上樣,電泳,濕轉(zhuǎn),可將其按分子量大小于硝酸纖維素膜上分離開(kāi),然后封閉其非特異位點(diǎn),孵育一抗(Bcl-2、Bax、β-actin、TLR4、NF-κB、PCNA、CCL2),孵育二抗,顯影,拍照,以Image pro軟件分析蛋白圖片,對(duì)其灰度值進(jìn)行定量后統(tǒng)計(jì)分析,最終得到各組蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組神經(jīng)功能缺損情況檢測(cè) 與假手術(shù)組比較,模型組、miR-124 agomir陰性對(duì)照+空載質(zhì)粒組、miR-124 agomir+TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高(P<0.05)。與模型組、miR-124 agomir+TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組分別比較,miR-124 agomir組神經(jīng)功能缺損評(píng)分均顯著降低(P<0.05),TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組神經(jīng)功能缺損評(píng)分均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,miR-124 agomir陰性對(duì)照+空載質(zhì)粒組神經(jīng)功能缺損評(píng)分無(wú)顯著變化(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2各組血清ROS及炎癥因子COX-2、IL-17水平的檢測(cè)結(jié)果 與假手術(shù)組比較,模型組、miR-124 agomir陰性對(duì)照+空載質(zhì)粒組、miR-124 agomir+TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組血清ROS及炎癥因子COX-2、IL-17水平顯著升高(P<0.05)。與模型組、miR-124 agomir+TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組分別比較,miR-124 agomir組血清ROS及炎癥因子COX-2、IL-17水平均顯著降低(P<0.05),TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組血清ROS及炎癥因子COX-2、IL-17水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,miR-124 agomir陰性對(duì)照+空載質(zhì)粒組大鼠血清ROS及炎癥因子COX-2、IL-17水平無(wú)顯著變化(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分、血清ROS及炎癥因子COX-2、IL-17水平比較

2.3各組CI情況的檢測(cè)結(jié)果 與假手術(shù)組比較,模型組、miR-124 agomir陰性對(duì)照+空載質(zhì)粒組、miR-124 agomir+TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組CI面積顯著升高(P<0.05)。與模型組、miR-124 agomir+TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組分別比較,miR-124 agomir組CI面積均顯著降低(P<0.05),TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組CI面積均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,miR-124 agomir陰性對(duì)照+空載質(zhì)粒組CI面積無(wú)顯著變化(P>0.05)。見(jiàn)圖1、表2。

2.4各組腦組織miR-124與凋亡蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 與假手術(shù)組比較,模型組、miR-124 agomir陰性對(duì)照+空載質(zhì)粒組、miR-124 agomir+TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組大鼠腦組織miR-124 mRNA與Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與模型組、miR-124 agomir+TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組分別比較,miR-124 agomir組腦組織miR-124與Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05),Bax表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05),而TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組腦組織miR-124與Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05),Bax表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,miR-124 agomir陰性對(duì)照+空載質(zhì)粒組大鼠腦組織miR-124與Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著變化(P>0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

1～6:假手術(shù)組、模型組、miR-124 agomir組、TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組、miR-124 agomir陰性對(duì)照+空載質(zhì)粒組、miR-124 agomir+TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組;圖2～4同圖1 TTC染色觀察各組CI情況

表2 各組CI面積及腦組織miR-124與凋亡蛋白相對(duì)表達(dá)比較

圖2 Western印跡檢測(cè)各組腦組織凋亡蛋白表達(dá)

2.5各組海馬神經(jīng)元凋亡率的檢測(cè) 與假手術(shù)組比較,模型組、miR-124 agomir陰性對(duì)照+空載質(zhì)粒組、miR-124 agomir+TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組海馬神經(jīng)元凋亡率顯著升高(P<0.05)。與模型組、miR-124 agomir+TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組分別比較,miR-124 agomir組海馬神經(jīng)元凋亡率均顯著降低(P<0.05),TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組海馬神經(jīng)元凋亡率均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,miR-124 agomir陰性對(duì)照+空載質(zhì)粒組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率無(wú)顯著變化(P>0.05)。見(jiàn)圖3、表3。

圖3 各組海馬神經(jīng)元凋亡(TUNEL染色,×200)

2.6各組腦組織TLR4/NF-κB/CCL2通路蛋白表達(dá)的檢測(cè) 與假手術(shù)組比較,模型組、miR-124 agomir陰性對(duì)照+空載質(zhì)粒組、miR-124 agomir+TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組腦組織TLR4、核內(nèi)NF-κB p65、CCL2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與模型組、miR-124 agomir+TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組分別比較,miR-124 agomir組腦組織TLR4、核內(nèi)NF-κB p65、CCL2通路蛋白均顯著降低(P<0.05),TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組大鼠腦組織TLR4、核內(nèi)NF-κB p65、CCL2通路蛋白均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,miR-124 agomir陰性對(duì)照+空載質(zhì)粒組腦組織TLR4、核內(nèi)NF-κB p65、CCL2蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著變化(P>0.05)。見(jiàn)表3、圖4。

表3 各組凋亡率及腦組織TLR4/NF-κB/CCL2通路蛋白相對(duì)表達(dá)比較

圖4 Western印跡檢測(cè)各組腦組織TLR4/NF-κB/ CCL2通路蛋白表達(dá)

3 討 論

本文采用線栓閉塞大腦中動(dòng)脈法建立CI大鼠模型,結(jié)果顯示,造模大鼠CI面積、血清ROS及炎癥因子COX-2、IL-17水平顯著升高,引發(fā)強(qiáng)烈的腦組織炎癥,導(dǎo)致腦組織抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著降低,促凋亡蛋白Bax表達(dá)顯著增加,引起海馬神經(jīng)元大量凋亡,造成神經(jīng)功能缺損,揭示CI模型建立成功。

CI患者腦組織的缺血缺氧及血液再灌注均會(huì)顯著增強(qiáng)促炎細(xì)胞因子表達(dá),降低抗炎細(xì)胞因子表達(dá),激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)并促進(jìn)其進(jìn)展,進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的腦損傷,抗炎治療是減輕CI臨床癥狀的有效方法〔6,15〕。TLR4是重要的炎癥調(diào)節(jié)分子,可通過(guò)激活NF-κB信號(hào),促進(jìn)CCL2表達(dá),參與介導(dǎo)結(jié)腸炎、變應(yīng)性鼻炎、抑郁等炎癥相關(guān)疾病的發(fā)病過(guò)程,下調(diào)TLR4/NF-κB信號(hào)通路表達(dá)可減少炎性因子表達(dá)及炎癥細(xì)胞數(shù)量,有效減輕結(jié)腸炎癥及變應(yīng)性鼻炎小鼠癥狀〔16,17〕,并抑制急性CI患者腦組織炎癥,進(jìn)而改善患者神經(jīng)功能損傷〔8〕。抑制TLR4/NF-κB信號(hào)還可下調(diào)CCL2表達(dá),抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活,減輕神經(jīng)炎癥,緩解腦缺血損傷〔9,18〕。由此可知,TLR4/NF-κB/CCL2信號(hào)是CI的重要治療靶點(diǎn)。miR-124是一種重要的神經(jīng)保護(hù)因子,可顯著減少腦缺血后梗死面積,減輕缺血性腦損傷并促進(jìn)神經(jīng)元存活〔19〕,并可改善腦卒中后的腦組織修復(fù)〔11〕。研究顯示,miR-124可調(diào)控TLR4信號(hào)傳導(dǎo),可通過(guò)抑制TLR4/NF-κB/CCL2信號(hào)激活進(jìn)而增強(qiáng)抗炎介質(zhì)表達(dá),阻止炎癥進(jìn)展〔12,20〕。因此推測(cè)抑制TLR4/NF-κB/CCL2信號(hào)可能是miR-124改善CI腦損傷的分子機(jī)制。本文結(jié)果顯示,CI模型大鼠腦組織miR-124表達(dá)水平顯著降低,TLR4、NF-κB p65、CCL2蛋白表達(dá)水平顯著升高。以miR-124 agomir上調(diào)CI模型大鼠miR-124表達(dá),可降低其腦組織Bax、TLR4、核內(nèi)NF-κB p65、CCL2蛋白表達(dá),降低CI面積,減少活性氧及促炎因子合成釋放,抑制腦組織炎癥,減輕海馬神經(jīng)元凋亡及神經(jīng)功能缺損癥狀。而以TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)CI模型大鼠TLR4表達(dá),起到相反作用,與miR-124 agomir合用可減弱過(guò)表達(dá)miR-124抑制CI大鼠腦組織炎癥及海馬神經(jīng)元凋亡的功效,逆轉(zhuǎn)其對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺損的修復(fù)作用,表明miR-124可通過(guò)抑制TLR4/NF-κB/CCL2信號(hào)減輕CI大鼠腦損傷,修復(fù)其神經(jīng)功能。

綜上所述,miR-124可通過(guò)下調(diào)TLR4/NF-κB/CCL2通路蛋白表達(dá),減少炎性細(xì)胞因子及活性氧的產(chǎn)生釋放,阻止炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活,抑制CI大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,減輕腦組織損傷,改善CI癥狀,修復(fù)其神經(jīng)功能,表明miR-124因子具有較強(qiáng)的腦保護(hù)活性,抑制TLR4/NF-κB/CCL2激活是其分子機(jī)制之一。本文為CI的發(fā)病機(jī)制的探明做出了一定貢獻(xiàn),提供了新的治療靶點(diǎn),后續(xù)會(huì)對(duì)miR-124調(diào)控TLR4/NF-κB/CCL2信號(hào)的具體作用機(jī)制做更深入全面的研究。