郝鋮 牟晶晶 趙彬 趙晶晶 方真華

(1武漢市第四醫(yī)院足踝外科,湖北 武漢 430000;2湖北省腫瘤醫(yī)院放療科)

股骨頭壞死(ONFH)是一種病因復(fù)雜的進(jìn)行性疾病,其特征是血液供應(yīng)中斷、軟骨下骨壞死,最終股骨頭塌陷,導(dǎo)致嚴(yán)重的髖關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙〔1,2〕。已有研究證實(shí),大劑量糖皮質(zhì)激素與ONFH的發(fā)生有關(guān),是激素性股骨頭壞死(SONFH)的重要誘發(fā)因素〔3,4〕。地塞米松是最常用的糖皮質(zhì)激素藥物之一,長期高濃度使用會(huì)產(chǎn)生許多不良反應(yīng),導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和SONFH〔5〕。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是一類具有自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞,可分化為成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,影響骨修復(fù)和血管生成〔6〕。外泌體是直徑為30～100 nm的膜囊泡,是細(xì)胞間通訊的主要參與者,可攜帶蛋白分子、mRNA、miRNA和lncRNA等,介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)傳遞、促進(jìn)壞死組織修復(fù)和調(diào)控體內(nèi)微環(huán)境等〔7,8〕。miRNA是進(jìn)化上保守的內(nèi)源性非編碼RNA,長度約為22個(gè)核苷酸,可調(diào)控細(xì)胞多種生理過程〔9〕。本研究通過分離正常MSC外泌體和地塞米松干預(yù)MSC來源外泌體,并將其與MSC共培養(yǎng),探討外泌體miRNA對(duì)MSC的影響。

1 材料和方法

1.1試劑與儀器 hMSC無血清培養(yǎng)液套裝購自中科院;DMEM-LG購自美國HyClone公司;地塞米松購自美國Sigma公司;成骨誘導(dǎo)分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自廣州Cyagen公司;茜素紅法鈣質(zhì)染色試劑盒購自上海歌凡;CCK-8購自北京Solarbio公司;碘化丙啶(PI)/Rnase染色緩沖液購自美國BD公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自金克隆公司;聚偏氟乙烯(PVDF)轉(zhuǎn)移膜購自廣州Doclab公司;化學(xué)發(fā)光試劑購自上海Rongbai公司;兔抗CD63抗體和GAPDH購自武漢Bioswamp公司;Trizol購自上海Ambion公司;SYBR FAST qPCR Master Mix購自上海KAPA Biosystems公司。倒置熒光顯微鏡購自東莞瑞顯光學(xué)儀器有限公司;透射電鏡購自日本日立公司;高速冷凍離心機(jī)和酶標(biāo)儀購自杭州奧盛儀器有限公司;全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀購自上海嘉鵬科技有限公司;聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀購自杭州柏恒科技有限公司;熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng) 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;將凍存于液氮罐中的MSC置于37 ℃水浴中至完全融化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中,400 r/min離心3 min,棄上清,加入1 ml培養(yǎng)液后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中。加入4 ml完全培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3外泌體提取 參考文獻(xiàn)進(jìn)行外泌體提取〔10〕:將MSC按5 000 cm2的密度接種于12孔板內(nèi),在不含胎牛血清的DMEM-LG完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后,將MSC分為兩組:對(duì)照組和地塞米松干預(yù)組。分別將0 和10 μmol/L地塞米松〔9〕加入細(xì)胞培養(yǎng)基中,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h。收集上述兩組培養(yǎng)基,500 r/min離心10 min,收集上清。2 000 r/min離心20 min,收集上清,1×105r/min離心70 min。20 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸后,1×105r/min離心70 min。所得沉淀與PBS按照1∶20比例稀釋,2 000 r/min離心200 min。40%蔗糖梯度1×105r/min離心70 min;收集上清。1×105r/min離心70 min,收集沉淀。最終得到兩種外泌體:Exo-1(對(duì)照組MSC分泌的外泌體)和Exo-2(地塞米松干預(yù)組MSC分泌的外泌體)。

1.4外泌體鑒定 外泌體電鏡觀察 將收集得到的外泌體用PBS制成懸液,取3 μl外泌體懸液滴加在formvar-carbon載樣銅網(wǎng)上,靜置5 min,醋酸雙氧鈾避光染色5 min。PBS洗滌3次,室溫半干燥后進(jìn)行透射電鏡觀察并拍照。Western印跡檢測外泌體中CD63蛋白水平,收集各組細(xì)胞,加入200 μl裂解液,BCA測定蛋白濃度,以每孔20 μg蛋白上樣量進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜,加入兔抗CD63和兔抗GAPDH(稀釋比均為1∶1 000),與膜室溫孵育1 h。洗膜后,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG,與膜室溫孵育1 h。洗膜后,加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑,與膜充分接觸,置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測,TANON GIS軟件讀取蛋白條帶灰度值。

1.5檢測外泌體中miR-708表達(dá) 收集細(xì)胞沉淀,約1×106個(gè)細(xì)胞,加1 ml Trizol提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列:miR-708-正向:5′-GGGGAAGGAGCTTACAA TCTA-3′,反向:5′-AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′;U6正向:5′-CTCGCTTCGGCAGCACATAT ACT-3′,反向:5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。使用2-ΔΔCt法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6細(xì)胞分組與處理 將MSC分為對(duì)照組、Exo-1組和Exo-2組。外泌體處理組分別加入20 μg/ml Exo-1或Exo-2〔11〕,進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。對(duì)照組加入等量PBS正常成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。

1.7MSC成骨誘導(dǎo)分化 取對(duì)數(shù)生長期MSC置于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí),用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化。將消化下來的MSC按照2×104/cm2的細(xì)胞密度接種在事先包被10×多聚賴氨酸的6孔板中,每孔加入2 ml完全培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%時(shí),將孔內(nèi)完全培養(yǎng)基吸走,向六孔板中加入2 ml MSC成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基,誘導(dǎo)7 d后進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.8茜素紅染色觀察成骨分化能力 取各組細(xì)胞PBS洗3次后,用4%多聚甲醛固定30 min。加入2 ml茜素紅染色液,室溫染色30 min后,蒸餾水速洗,置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.9CCK-8檢測細(xì)胞增殖 收集各組細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度,分于96孔板,3×103個(gè)細(xì)胞/孔,每孔100 μl,置于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜,使細(xì)胞貼壁。取出細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔加入10 μl CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度(OD)值。

1.10劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 用marker筆在6孔板背后,比對(duì)直尺豎直均勻畫5條直線,每條相隔0.5 cm。收集各組細(xì)胞,每孔接種1×106個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)過夜待細(xì)胞鋪滿孔板。用槍頭垂直于孔板背后的直線劃痕,然后用PBS沖洗去除劃下的細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)。在0 h和24 h分別拍照,觀察細(xì)胞遷移情況。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1外泌體鑒定 透射電鏡觀察到提取的細(xì)胞外囊泡有典型的茶托樣結(jié)構(gòu);且檢測到了外泌體標(biāo)志物CD63的表達(dá)。表明實(shí)驗(yàn)中分離得到的MSC外囊泡為外泌體。與正常MSC分泌的外泌體即Exo-1(1.00±0.05)相比,經(jīng)地塞米松干預(yù)的MSC分泌的外泌體中miR-708相對(duì)表達(dá)(3.97±0.32)顯著升高(P<0.05)。見圖1。

A:外泌體TEM圖像(×30 000),B:Western印跡檢測外泌體標(biāo)志物CD63蛋白表達(dá)圖1 外泌體鑒定

2.2外泌體miR-708對(duì)成骨分化能力的影響 對(duì)照組與Exo-1組MSC著色明顯,鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量較多;而Exo-2組MSC著色較淺,鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量較少。表明經(jīng)地塞米松干預(yù)的MSC外泌體miR-708可抑制成骨分化能力。見圖2。

圖2 各組細(xì)胞成骨分化能力(茜素紅染色,×100)

2.3外泌體miR-708對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響 與對(duì)照組(2.41±0.09)和Exo-1組MSC(2.35±0.09)相比,Exo-2組MSC增殖能力的OD值(2.02±0.08)顯著降低(P<0.05)。表明經(jīng)地塞米松干預(yù)的MSC外泌體miR-708可抑制細(xì)胞增殖。

2.4外泌體miR-708對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響 對(duì)照組和Exo-1組MSC劃痕間距較小,遷移細(xì)胞數(shù)較多;Exo-2組MSC劃痕間距較大,遷移細(xì)胞數(shù)較少。表明經(jīng)地塞米松干預(yù)的MSC外泌體miR-708可抑制細(xì)胞遷移。見圖3。

3 討 論

近年來,ONFH的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢,其中,SONFH占30%～50%〔12〕。SONFH是由于長期過量服用激素類藥物導(dǎo)致股骨頭缺血缺氧引起的代謝性病變,與骨髓脂肪生成增多、脂肪細(xì)胞增生引起的骨內(nèi)壓力升高有關(guān),可減慢股骨頭的血流速度,最終導(dǎo)致缺血性骨壞死〔13〕。MSC功能異常在SONFH發(fā)病中的作用已成為目前的研究熱點(diǎn),研究表明,激素可引起股骨頭內(nèi)MSC成骨分化不足和成脂分化增多等,最終導(dǎo)致成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的比例失衡〔14〕。MSC是一種具有分化形成脂肪、骨骼、軟骨、肌肉、神經(jīng)、心肌和內(nèi)皮組織等的功能細(xì)胞,由于其來源廣泛、易于分離和培養(yǎng)及具有強(qiáng)大的分化潛能,可作為修復(fù)衰老和疾病引起的組織和器官受損的理想細(xì)胞〔15〕。Zhao等〔16〕研究了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自體移植治療早期ONFH,結(jié)果顯示,自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增可以為股骨頭植入提供更多的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,可有效避免股骨頭塌陷。研究表明,miRNA在ONFH的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防和治療中也起著重要作用〔17,18〕。Wu等〔19〕通過miRNA表達(dá)譜鑒定了非創(chuàng)傷性骨壞死中差異表達(dá)的miRNA,結(jié)果顯示,非創(chuàng)傷性骨壞死樣本中有22個(gè)miRNA顯著上調(diào),17個(gè)miRNA顯著下調(diào),且生物信息學(xué)分析表明,toll樣受體、神經(jīng)營養(yǎng)因子和NOD樣受體可能受到這些差異miRNA的調(diào)控,此外,在非創(chuàng)傷性骨壞死的發(fā)病機(jī)制中也起重要作用。

外泌體是由多個(gè)細(xì)胞釋放到細(xì)胞外間隙的囊泡,當(dāng)外泌體循環(huán)時(shí),外泌體攜帶的miRNA可調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物學(xué)活性〔20〕。Qin等〔21〕研究表明,MSC來源外泌體可通過直接調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖和活性參與骨重塑。研究表明,MSC來源外泌體能上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)9和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1的表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)MSC成骨分化〔22,23〕。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)地塞米松干預(yù)的MSC外泌體高表達(dá)miR-708,這也與前期研究結(jié)果一致。Gao等〔24〕研究發(fā)現(xiàn),miR-708在缺血再灌注大鼠中高表達(dá),可影響細(xì)胞增殖和凋亡。Zhao等〔25〕研究發(fā)現(xiàn),在結(jié)直腸癌中,miR-708可靶向ZNF549調(diào)控細(xì)胞增殖和遷移,參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。推測miR-708對(duì)ONFH也有同樣的影響。本研究表明,經(jīng)地塞米松干預(yù)的MSC外泌體顯著抑制MSC成骨分化能力、增殖活力和遷移能力。本研究初步探討了MSC外泌體對(duì)MSC的作用,但MSC外泌體miR-708對(duì)MSC成骨分化的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上,用地塞米松干預(yù)的MSC來源外泌體miR-708可抑制MSC成骨分化、增殖和遷移。為MSC治療SONFH提供了一定的理論基礎(chǔ)。