閆亞敏，梁大偉，馬建偉，劉欣芊，肖裕玲，高錦運，田 怡，薛建邦，莫美華

（華南農業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642）

原生質體融合是生物工程育種的一項重要技術，該技術可以去除細胞壁的屏障，實現遠緣雜交，集雙親優(yōu)良遺傳性狀于一體，并定向篩選表現雙親優(yōu)良遺傳性狀的融合子，遺傳信息傳遞量大，操作方便，適用性強[1-3]。近年來食用菌原生質體融合技術在理論和應用上都取得了很大進展，國內許多研究者通過試驗已經獲得了食用菌種內、種間、屬間，甚至科間原生質體融合子，并結合分子生物學技術就食用菌育種進行了大量的研究，取得了令人矚目的進展[4-9]。通過原生質體融合技術，可以改善食用菌品質，提高產量，增強抗性，對食用菌的良種選育具有深刻意義[10-11]。

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus） 具有清熱解毒、消炎潤肺等多種保健功能，是目前世界上人工栽培最廣泛、產量最高、消費量最大的食用菌，產量約占世界食用菌總產量的40%[12-13]。巨大口蘑（Macrocybe gigantea） 是一種口感鮮美、營養(yǎng)豐富、產量高的珍稀食用菌，具有防癌抗癌、抗氧化、抑制高血壓、抑制細菌、抑制真菌、抑制艾滋病病毒、提高免疫力等多種功效[14-19]。而且貨架期長，在貯藏運輸中不易褐變和腐爛，8～12 ℃條件下保存30 d 不變色、不變味，適合鮮銷和加工，有很好的開發(fā)價值和應用前景。但實際生產中發(fā)現其生長速度慢、栽培周期長，該缺點嚴重制約了產業(yè)化與規(guī)?；陌l(fā)展[20-22]。為了解決巨大口蘑生長速度慢、栽培周期長、較難均衡供應市場的難題，選育生長速度快、栽培周期短的巨大口蘑新菌株顯得尤為重要。

將優(yōu)質、耐貯藏的巨大口蘑和高產、適應性強的雙孢蘑菇作為親本菌株，進行原生質體融合育種，建立巨大口蘑與雙孢蘑菇原生質體制備、融合及再生的優(yōu)化體系，以得到具有新的生理特性的融合菌株。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

巨大口蘑菌株，華南農業(yè)大學食品學院應用真菌實驗室保藏；雙孢蘑菇2796，購于廣東省微生物研究所。

1.2 試驗培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、MgSO40.05%、KH2PO40.15%、瓊脂2%。

再生培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、MgSO40.05%、KH2PO40.2%、VB10.001%、蛋白胨0.3%、瓊脂2%、0.6 mol·L-1甘露醇1 L，pH 7.0。

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%。

栽培料配方：棉籽殼30%、蔗渣60%、麩皮8%、石灰1%、輕質碳酸鈣0.2%、MgSO40.1%、KH2PO40.2%、酵母粉0.5%，pH 6.0～7.0。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌絲體制備

在巨大口蘑的PDA 培養(yǎng)基上用打孔器（直徑為1.2 cm） 取2～3 塊菌絲體最前端生長旺盛的菌絲塊，接種于160 mL 液體培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r·min-1條件下培養(yǎng)7～10 d，得到菌絲球。將菌絲球轉移到160 mL 液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)4 d 以上，無菌條件下挑取菌絲體，無菌濾紙吸干水分，得到巨大口蘑菌絲體。雙孢蘑菇菌絲培養(yǎng)溫度為26 ℃，其他方法同上。

1.3.2 原生質體制備

使用一定量的滲透壓穩(wěn)定劑（0.6 mol·L-1KCl 與0.6 mol·L-1的甘露醇以1 ∶1 復配） 將收集到的菌絲反復洗滌2～3 次。按照每0.3～0.5 克菌絲加入1 mL 酶液的比例，巨大口蘑采用5%纖維素酶和5%蝸牛酶作為混合酶系，在31 ℃條件下，酶解4.5 h；雙孢蘑菇采用7.6%纖維素酶和4%蝸牛酶作為混合酶系，在32 ℃條件下，酶解2.2 h。酶解完畢后，濾液低速離心棄上清液收集沉淀，用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌2 次，并加入與酶液等體積的滲透壓穩(wěn)定劑重懸原生質體，測定巨大口蘑和雙孢蘑菇原生質體的釋放量。

1.3.3 原生質體滅活

將巨大口蘑和雙孢蘑菇的原生質體的量調整到1×106個/mL。巨大口蘑原生質體使用紫外滅活：15 W 紫外燈，于25 cm 處照射18 min。雙孢蘑菇原生質體使用熱滅活：56 ℃水浴，熱滅活30 min。均達到100%滅活。

1.3.4 原生質體的融合條件研究

使用分子量為6 000 的聚乙二醇（PEG） 為融合劑，研究PEG 濃度、融合時間和溫度對原生質體融合的影響。初始條件為30 ℃融合20 min，再以前一步篩選結果作為后一步試驗條件，分別逐步設置PEG 質量分數為10%、20%、30%、40%、50%；融合時間為5、10、15、20、25、30 min；融合溫度為20、25、30、35、40 ℃。

1.3.5 原生質體的融合與再生

分別將0.5 mL 純化滅活的巨大口蘑和雙孢蘑菇原生質體懸液按照體積比1 ∶1 混合，30 ℃條件預熱5 min 后加入一定濃度的PEG 1 mL，迅速置于30 ℃水浴中，按照設定時間取樣，3 000 r·min-1離心15 min，棄去上清液，加入滲透壓穩(wěn)定劑洗滌2 次去除PEG，得到原生質體融合物。取0.1 mL 原生質體融合物涂布于再生培養(yǎng)基上，26 ℃避光培養(yǎng)10～20 d，定期觀察融合子的生長情況并計算融合率。融合率（R，%） 的計算公式為[23]：

式中：N 為融合子的再生菌落數（個）；P 為雙親原生質體數（個）。

1.3.6 融合菌株的鑒定

融合菌株和親本菌株在PDA 培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，觀察、記錄菌落形態(tài)。采用插片法培養(yǎng)，待菌絲長滿蓋玻片后用乳酸石炭酸染色，于16×40 倍顯微鏡下觀察、記錄菌絲形態(tài)。根據融合子形態(tài)特征、拮抗試驗結果和菌絲生長速度進行初步鑒定，經過鑒定之后，選取與母種具有明顯形態(tài)差異、發(fā)生拮抗反應且具有鎖狀聯合的菌株，進行出菇試驗，記錄、比較其出菇時間和商品性狀。

2 結果與分析

2.1 巨大口蘑和雙孢蘑菇原生質體的制備

在前期研究的基礎上[24]，巨大口蘑和雙孢蘑菇分別以菌齡5 d 和4 d 的菌絲體作為材料，經過纖維素酶和蝸牛酶混合酶解后，巨大口蘑原生質體的釋放量為7.5×106個/mL，雙孢蘑菇原生質體的釋放量為9.9×106個/mL，制備得到的雙孢蘑菇和巨大口蘑的原生質體如圖1 所示。

圖1 巨大口蘑（A） 和雙孢蘑菇（B） 的原生質體（10×）Fig.1 Macrocybe gigantea (A) and Agaricus bisporus (B) protoplasts (10×)

2.2 PEG 濃度對原生質體融合的影響

PEG 濃度是影響原生質體融合的關鍵因素，研究表明分子量為4 000～6 000 的PEG 對原生質體的融合效果較好[25]。將分子量為6 000 的PEG 作為融合劑，不同PEG 質量分數下巨大口蘑和雙孢蘑菇的原生質體融合率見圖2。

圖2 PEG 濃度對巨大口蘑和雙孢蘑菇原生質體融合的影響Fig.2 Effect of PEG concentration on protoplast fusion between Macrocybe gigantea and Agaricus bisporus

由圖2 可知，當PEG 質量分數為30%時，巨大口蘑與雙孢蘑菇原生質體的融合率達到最高，為0.010 7%，在此基礎上PEG 的濃度再增大或者減小，融合率都開始下降。這是因為低濃度的PEG 會使原生質體破裂而失去穩(wěn)定性，濃度過高則會導致原生質體失水收縮，從而融合率降低，且高濃度的PEG 還有一定的毒性。因此巨大口蘑和雙孢蘑菇原生質體融合的最佳PEG（分子量為6 000） 的質量分數為30%，可觀察到出現2 個或2 個以上原生質體融合現象，見圖3。

圖3 PEG 質量分數為30%時融合子電鏡圖（100×）Fig.3 Electron micrograph of fusion at 30% PEG mass fraction (100×)

2.3 融合時間對原生質體融合的影響

不同融合時間下巨大口蘑和雙孢蘑菇的原生質體融合率見圖4。

圖4 融合時間對巨大口蘑與雙孢蘑菇原生質體融合的影響Fig.4 Effect of fusion time on protoplast fusion between Macrocybe gigantea and Agaricus bisporus

由圖4 可知，當融合時間為20 min 時，巨大口蘑與雙孢蘑菇原生質體融合率最高，為0.013 6%。融合時間過長或者過短都會使融合率下降，這是因為融合時間過短，原生質體沒有充分的融合；融合時間過長，可能使已經形成的原生質體橋斷裂，融合率和再生率都降低。因此，巨大口蘑與雙孢蘑菇原生質體融合的最佳時間為20 min。

2.4 融合溫度對原生質體融合的影響

不同融合溫度下巨大口蘑和雙孢蘑菇的原生質體融合率見圖5。

圖5 融合溫度對巨大口蘑與雙孢蘑菇原生質體融合的影響Fig.5 Effect of fusion temperature on protoplast fusion between Macrocybe gigantea and Agaricus bisporus

由圖5 可知，當溫度從20 ℃升高到30 ℃時，巨大口蘑與雙孢蘑菇原生質體融合率一直處于上升的趨勢，說明融合過程中適當提高溫度能促進原生質的融合，溫度高于30 ℃時融合率開始下降。考慮到低溫原生質體的活性低，而高溫又對原生質體有一定的損傷，因此，巨大口蘑與雙孢蘑菇原生質體融合時溫度應以30 ℃為宜。

2.5 融合子的再生

在pH 為8.5、PEG 質量分數為30%、融合時間為20 min、融合溫度為30 ℃、三羥甲基氨基甲烷（Tris）濃度為0.016 mol·L-1、CaCl2的濃度為0.014 mol·L-1的條件下，巨大口蘑與雙孢蘑菇原生質體的融合率為0.038 7%，顯微鏡觀察下的融合子見圖6。

如圖6 所示，挑選出14 個融合子進行再生培養(yǎng)，從中篩選出有利于穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的7 個融合菌株進行下一步培養(yǎng)鑒定試驗。

2.6 融合菌株的鑒定

2.6.1 菌落特征觀察

對2 個親本菌株和篩選出的7 個融合菌株進行培養(yǎng)，菌落特征見圖7。

圖7 7 個融合菌株與2 個親本菌株的菌落形態(tài)Fig.7 Colony morphology of 7 fusion strains and 2 parent strains

由圖7 可知，親本巨大口蘑的菌絲潔白且粗壯，菌落邊緣較整齊，表面平坦、光滑，呈絨毛狀；而雙孢蘑菇的菌絲細密，菌落邊緣不規(guī)整，呈菌束狀并且疏松。融合菌株的菌落形態(tài)介于2 個親本之間，菌株H49、H99、H100 菌絲形態(tài)接近巨大口蘑，菌絲致密、粗壯，表面呈絨毛狀，貼合培養(yǎng)基生長；而菌株612、41、710、75 的菌絲形態(tài)接近雙孢蘑菇，菌絲細密，呈菌束狀并且疏松，菌落邊緣大多不整齊。

2.6.2 拮抗試驗結果

7 個融合菌株分別與2 個親本菌株進行拮抗試驗，結果見圖8。

圖8 融合菌株與親本菌株的拮抗試驗結果Fig.8 Results of antagonism test between fusion strains and parent strains

如圖8 所示，7 個融合菌株均與親本菌株形成明顯的拮抗線。其中融合菌株H49、H99、H100 與親本巨大口蘑發(fā)生強烈的拮抗反應，菌絲接觸位置形成明顯隆起的拮抗線，并且通過菌落形態(tài)可以觀察出與巨大口蘑的同源性較大。融合菌株612、41、710、75 與親本雙孢蘑菇的拮抗線明顯，并且通過菌落形態(tài)可以觀察出與雙孢蘑菇的同源性較大。

2.6.3 菌絲形態(tài)觀察

對菌絲形態(tài)進行觀察，具有鎖狀聯合的4 個融合菌株和2 個親本菌株的菌絲形態(tài)見圖9。

圖9 4 個融合菌株與2 個親本菌株的菌絲顯微圖片（16×40）Fig.9 Mycelial micrograph of 4 fusion strains and 2 parent strain (16×40)

由圖9 可知，親本巨大口蘑的菌絲較細，有鎖狀聯合體。親本雙孢蘑菇菌絲較巨大口蘑菌絲粗，沒有鎖狀聯合體，橫隔膜較明顯。融合菌株H99 鎖狀聯合較多，菌絲細密，而融合菌株H49、H100、612 菌絲有較少鎖狀聯合，菌絲寬度介于巨大口蘑與雙孢蘑菇之間。融合菌株41、710、75 的菌絲無鎖狀聯合，且結合前期菌落特征觀察和拮抗試驗結果，表明融合菌株41、710、75 與雙孢蘑菇較為接近，因此后續(xù)不再進行研究。

2.6.4 母種的菌絲生長速度

篩選出的4 個融合菌株與2 個親本菌株的母種生長情況見表1。

表1 4 個融合菌株與2 個親本菌株的母種菌絲生長情況比較Tab.1 Comparison of the mycelial growth of stock culture between 4 fusion strains and 2 parent strains

由表1 可知，各菌株菌絲生長速度顯著快于親本巨大口蘑（P＜0.05）。在相同的培養(yǎng)條件下，親本雙孢蘑菇的菌絲生長速度較快，巨大口蘑的菌絲生長速度較慢。融合菌株H49、H99、H100 菌絲生長速度與雙孢蘑菇相比較慢，但顯著快于巨大口蘑菌絲生長速度，且菌絲長勢濃密，形態(tài)接近巨大口蘑。融合菌株612 的生長速度顯著快于雙孢蘑菇，且菌絲形態(tài)接近于雙孢蘑菇，因此后續(xù)沒有進行進一步研究。

2.6.5 栽培種的菌絲生長速度

對篩選出的融合菌株H49、H99、H100 與親本巨大口蘑開展進一步的比較試驗，記錄從接種到不同培養(yǎng)時間段栽培種的平均菌絲生長速度，結果見表2。

表2 融合菌株與親本巨大口蘑栽培種的菌絲生長速度比較Tab.2 Comparison of spawn mycelial growth rates between fusion strains and parent Macrocybe gigantea

由表2 可知，3 個融合菌株的栽培種菌絲生長速度顯著快于親本巨大口蘑（P＜0.05）。并且在試驗過程中發(fā)現，接種后培養(yǎng)7 d，融合菌株即可明顯觀察到菌絲生長，而親本巨大口蘑的菌絲生長不明顯，說明融合菌株的菌絲活性明顯優(yōu)于親本巨大口蘑。

2.6.6 出菇試驗

對3 個融合菌株與親本巨大口蘑進行出菇試驗，結果見表3 和圖10。

表3 3 個融合菌株與親本菌株巨大口蘑出菇時間比較Tab.3 Comparison of fruiting time between 3 fusion strains and parent Macrocybe gigantea

圖10 3 個融合菌株與親本菌株巨大口蘑出菇圖Fig.10 Fruiting of parental strain Macrocybe gigantea and 3 fusion strains

由表3 和圖10 可知，在相同的培養(yǎng)條件下，融合菌株的出菇時間明顯短于母本菌株巨大口蘑。栽培試驗中，融合菌株在溫度和濕度都隨天氣改變的條件下也能正常出菇，只是出菇量相對減少，表現出明顯的抗逆性，進一步說明融合菌株具有與母本優(yōu)勢互補的優(yōu)良性狀。融合菌株與母本菌株相比菌柄更加粗壯，朵形優(yōu)美，菇形整齊，長勢較好。

3 結論與討論

食用菌原生質體融合根據誘導因子不同，分為化學融合、物理融合和生物融合三大類，目前PEG誘導的化學融合應用最為廣泛，影響原生質體PEG融合的因素主要有PEG 的濃度、融合時間、融合溫度等[26]。PEG 誘導原生質體融合機制主要是通過氫鍵和原生質體的結合水結合，引起膜結構的改變，導致原生質體失水，引起原生質體凝集作用，發(fā)生原生質體融合。分子量為4 000～10 000 的PEG 均能誘導原生質體的全融合，小分子量的PEG 較大分子量的PEG 處理的融合率低，而大分子量的PEG 處理則易出現多核融合。在食用菌原生質體融合過程中，質量分數為25%～45%的PEG 處理可獲得較高的原生質體融合率，與本試驗中得到的PEG（分子量為6 000） 質量分數為30%時融合率高的結果相符[27-30]。融合時間和融合溫度都會對原生質體的融合率產生影響，融合時間過長PEG 對原生質體的毒性增加，融合溫度直接影響原生質體的流動和活性。本試驗中篩選的融合時間為20 min，融合溫度為30 ℃，與前人的研究基本相符。最終在pH 8.5、Tris 濃度為0.016 mol·L-1、Ca2+濃度為0.014 mol·L-1條件下，融合率達0.038 7%，建立了巨大口蘑與雙孢蘑菇原生質體PEG 融合體系。

融合子的驗證可以從多個方面進行，本試驗從形態(tài)學特征、拮抗試驗結果、菌絲生長速度和出菇試驗多個角度和層次，確切地表明了融合菌株是不同于親本的新菌株。形態(tài)學是菌種鑒定的基礎，形態(tài)的差異表明菌株的生理代謝存在差異；通過拮抗線說明融合菌株和親本菌株之間存在排異現象；再通過母種和栽培種生長速度的測定更確切地驗證了融合菌株是不同于親本的新菌株，比親本菌株具有更多優(yōu)勢；最后應用出菇試驗進一步證明了融合是成功的，實現了科間融合成功。試驗中雖然獲得了多株融合菌株，但是沒有對類似于雙孢蘑菇的菌株進行進一步研究。

本試驗中選育出的穩(wěn)產、栽培周期較短的巨大口蘑融合新菌株，為食用菌的生產提供了可穩(wěn)定擴繁的優(yōu)良雜交菌系，這對巨大口蘑品種的更新換代和在原生質體水平上成功開展巨大口蘑雜交育種提供了范例，可為巨大口蘑育種、栽培提供一定的指導。