付晴晴, 劉婷婷, 易念華

湖北省婦幼保健院婦女保健科,武漢 430070

宮頸癌是僅次于乳腺癌和結(jié)直腸癌的全球第3大女性惡性腫瘤,主要由持續(xù)性人乳頭瘤病毒感染引起[1]。目前宮頸癌的治療包括化療、手術(shù)和放療,其中以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療是晚期宮頸癌最常用的化療方案[2]。研究發(fā)現(xiàn),多種天然產(chǎn)物對(duì)宮頸癌具有較好的療效,其作用機(jī)制包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制血管生成、抑制轉(zhuǎn)移、降低耐藥性和調(diào)節(jié)miRNAs等,天然產(chǎn)物可能是新型抗癌藥物的主要候選者[3]。水飛薊賓是從菊科草本植物水飛薊的種子中提取出來(lái)的黃酮木質(zhì)素類化合物,具有抗腫瘤、抑菌、保護(hù)心血管等藥理活性[4]。研究顯示,水飛薊賓對(duì)人宮頸癌細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用,其可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡,進(jìn)而抑制宮頸癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)[5-6]。但關(guān)于水飛薊賓影響宮頸癌細(xì)胞侵襲能力的作用及機(jī)制尚未完全明確。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路參與了宮頸癌的進(jìn)展[7],抑制ERK/MAPK信號(hào)通路可阻斷宮頸癌細(xì)胞的遷移、自噬與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。為了探究水飛薊賓是否能通過(guò)調(diào)控ERK/MAPK信號(hào)通路影響宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力,本研究采用不同濃度水飛薊賓干預(yù)宮頸癌細(xì)胞,檢測(cè)其增殖、侵襲能力以及ERK/MAPK信號(hào)通路蛋白表達(dá)變化,以期為宮頸癌抗癌藥物研發(fā)提供一定的數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人宮頸癌細(xì)胞HeLa源自中科院細(xì)胞庫(kù)。主要試劑:MEM培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司(貨號(hào):c11095500bt、10270-106),PBS、0.25%胰蛋白酶、CCK-8、結(jié)晶紫染液購(gòu)自Solarbio公司(貨號(hào):P1010、T1350、CA1210、C8470),水飛薊賓購(gòu)自阿拉丁公司(貨號(hào):S109808;純度:98%),順鉑、甲醛、氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(貨號(hào):SP439401、10010018、10006818、80109218、10009218),ERK1/2信號(hào)抑制劑PD98059、p38 MAPK抑制劑SB202190購(gòu)自美國(guó)MCE公司(貨號(hào):HY-12028、HY-10295),Matrigel膠購(gòu)自BD公司(貨號(hào):354230),Trizol購(gòu)自Ambion公司(貨號(hào):15596026),反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司(貨號(hào):2690A),SYBR FAST qPCR Master Mix購(gòu)自KAPA Biosystems公司(貨號(hào):KM4101),兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)抗體、兔抗MMP-9抗體、兔抗ERK1/2抗體、兔抗p38抗體、兔抗GAPDH抗體購(gòu)自Bioswamp公司(貨號(hào):PAB30618、PAB30102、PAB43936、PAB38871、PAB36269),兔抗p-ERK1/2抗體、兔抗p-p38抗體購(gòu)自Abcom公司(貨號(hào):ab184699、ab195049)。

1.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將HeLa細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM中,調(diào)整細(xì)胞密度,接種于96孔板中,每孔3×103個(gè)細(xì)胞,100 μL,培養(yǎng)過(guò)夜,使細(xì)胞貼壁。采用0、25、50、100、200、400、800、1000 μmol/L水飛薊賓處理細(xì)胞[9],繼續(xù)培養(yǎng)24 h,取出細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔加入10 μL CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。于酶標(biāo)儀中檢測(cè)450 nm處各孔的吸光度值(A),并計(jì)算細(xì)胞增殖率=(A藥物孔-A空白孔)/(A對(duì)照孔-A空白孔)×100%。

1.3 細(xì)胞分組與處理

將HeLa細(xì)胞分為對(duì)照組、水飛薊賓低劑量組(SB-L)、水飛薊賓中劑量組(SB-M)、水飛薊賓高劑量組(SB-H)、PD98059組、SB202190組、PD98059+SB組、SB202190+SB組和順鉑組。對(duì)照組細(xì)胞采用正常的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),低、中、高劑量組采用含有25、50、100 μmol/L水飛薊賓的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),PD98059組采用含有30 μmol/L PD98059的培養(yǎng)液培養(yǎng)[10],SB202190組采用含有10 mmol/L PD98059的培養(yǎng)液培養(yǎng)[11],PD98059+SB組采用含有30 μmol/L PD98059和50 μmol/L水飛薊賓的培養(yǎng)液培養(yǎng),SB202190+SB組采用含有10 mmol/L PD98059和50 μmol/L水飛薊賓的培養(yǎng)液培養(yǎng),順鉑組作為陽(yáng)性對(duì)照,采用含有10 μmol/L順鉑的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞[12],培養(yǎng)24 h后CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖。

1.4 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲

實(shí)驗(yàn)前24 h,對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行血清饑餓處理,將細(xì)胞培養(yǎng)在不含血清的培養(yǎng)液中。將Transwell小室和24孔板在PBS中浸泡5 min,在Transwell小室中鋪設(shè)80 μL Matrigel膠,靜置30 min。收集各組細(xì)胞,采用含1%胎牛血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)細(xì)胞/mL,以0.5 mL細(xì)胞/小室的比例接種于Transwell小室中,在下層24孔板中加入0.75 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液,PBS清洗,加入4%甲醛固定20 min。棄去固定液,PBS清洗,加入0.5%結(jié)晶紫溶液染色30 min。PBS清洗,晾干,擦去Transwell小室內(nèi)沒(méi)有侵襲的細(xì)胞,置于顯微鏡下觀察各組細(xì)胞侵襲情況,并計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)。

1.5 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)MMP-2、MMP-9、ERK1/2和p38 mRNA表達(dá)水平

取1×106個(gè)細(xì)胞,加入1 mL Trizol裂解細(xì)胞,采用氯仿、異丙醇提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列為:MMP-2上游引物為5′-GCTTCCAGGGCACATCC-3′,下游引物為5′-TTGCGGTCATCATCGTAGTT-3′;MMP-9上游引物為5′-GTCCTCGCCCTGAACCTG-3′,下游引物為5′-GGCACAGTAGTGGCCGTAGA-3′;內(nèi)參基因GAPDH上游引物為5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′,下游引物為5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′。以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.6 Western blot檢測(cè)MMP-2、MMP-9、p-ERK1/2和p-p38蛋白表達(dá)水平

取1×106個(gè)細(xì)胞,加入200 μL細(xì)胞裂解液于4 ℃中充分裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)定量后,沸水浴10 min使蛋白質(zhì)變性,離心取上清,取20 μg蛋白上樣,進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。將蛋白轉(zhuǎn)膜,采用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。按比例稀釋一抗(MMP-2、MMP-9、ERK1/2、p38、p-p38和GAPDH稀釋比1∶1000,p-ERK1/2稀釋比1∶10000),和膜室溫孵育1 h。洗膜,加入二抗,室溫孵育1 h。將膜轉(zhuǎn)移至暗室中,滴加化學(xué)發(fā)光液,于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測(cè),并讀取蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究全部實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù),計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水飛薊賓抑制HeLa細(xì)胞增殖

結(jié)果見(jiàn)圖1,隨著水飛薊賓干預(yù)濃度升高,宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖率逐漸降低。當(dāng)水飛薊賓濃度大于100 μmol/L時(shí),細(xì)胞增殖率低于50%,在保證后續(xù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)正常進(jìn)行的前提下,并能探討水飛薊賓的量效關(guān)系,本研究采用25、50、100 μmol/L作為低、中、高劑量組水飛薊賓的干預(yù)濃度。與對(duì)照組相比,其余組的細(xì)胞增殖率均顯著降低(均P<0.05);與SB-M組相比,PD98059+SB組和SB202190+SB組細(xì)胞增殖率進(jìn)一步降低(均P<0.05)。

A:不同濃度水飛薊賓對(duì)HeLa細(xì)胞增殖率的影響;B:各組細(xì)胞增殖率的比較;與對(duì)照組比較,*P<0.05;與SB-M組比較,#P<0.05

2.2 水飛薊賓抑制HeLa細(xì)胞侵襲

結(jié)果見(jiàn)圖2,與對(duì)照組比較,其余各組的侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少(均P<0.05);與SB-M組相比,PD98059+SB組和SB202190+SB組侵襲細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步降低(均P<0.05)。

1:Control;2:SB-L;3:SB-M;4:SB-H;5:PD98059;6:SB202190;7:PD98059+SB;8:SB202190+SB;9:Cisplatin;與對(duì)照組比較,*P<0.05;與SB-M組比較,#P<0.05

2.3 水飛薊賓抑制HeLa細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、p-ERK1/2和p-p38 mRNA的表達(dá)

結(jié)果見(jiàn)圖3,與對(duì)照組比較,除水飛薊賓低劑量組外,其余各組HeLa細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、ERK1/2和p38 mRNA表達(dá)量均顯著減少(均P<0.05);與SB-M組比較,PD98059+SB組和SB202190+SB組HeLa細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、ERK1/2和p38 mRNA表達(dá)量均顯著減少(均P<0.05)。

1:Control;2:SB-L;3:SB-M;4:SB-H;5:PD98059;6:SB202190;7:PD98059+SB;8:SB202190+SB;9:Cisplatin;與對(duì)照組比較,*P<0.05;與SB-M組比較,#P<0.05

2.4 水飛薊賓抑制HeLa細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、p-ERK1/2和p-p38蛋白的表達(dá)

結(jié)果見(jiàn)圖4,與對(duì)照組比較,除SB-L組外,其余各組HeLa細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、p-ERK1/2和p-p38蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著減少(均P<0.05);與SB-M組比較,PD98059+SB組和SB202190+SB組HeLa細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、p-ERK1/2和p-p38蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著減少(均P<0.05)。

1:Control;2:SB-L;3:SB-M;4:SB-H;5:PD98059;6:SB202190;7:PD98059+SB;8:SB202190+SB;9:Cisplatin;與對(duì)照組比較,*P<0.05;與SB-M組比較,#P<0.05

3 討論

宮頸癌是全世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的婦科腫瘤之一,可影響到患者的卵巢、泌尿系統(tǒng)和腸道功能,其治療方法主要包括早期的手術(shù)治療和晚期的放、化療[13]。晚期的放、化療對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一定損傷的同時(shí)也會(huì)增加患者的痛苦,因此嚴(yán)重影響患者的身體健康與生活質(zhì)量[14]。

西醫(yī)常規(guī)治療方法在宮頸癌治療方面取得了較為顯著的療效,但仍存在一些毒副作用及耐藥等問(wèn)題,中醫(yī)藥在宮頸癌治療中具有明顯優(yōu)勢(shì),可從整體出發(fā),辨證論治,前景良好[14]。水飛薊賓為水飛薊素的主要生物活性成分[15],是一種天然黃酮類化合物,通過(guò)靶向多種分子靶點(diǎn)和途徑,在不同的腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出抗腫瘤作用,如非小細(xì)胞肺癌[16]、三陰性乳腺癌[17]和皮膚癌[18]等。水飛薊賓在宮頸癌中同樣也發(fā)揮著抗癌作用,體外研究表明水飛薊賓可通過(guò)激活Caspase-3/7相關(guān)途徑抑制HeLa細(xì)胞增殖,并促進(jìn)凋亡[5];體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)水飛薊賓可抑制裸鼠移植瘤腫瘤組織的生長(zhǎng)[6]。You等[19]發(fā)現(xiàn)水飛薊賓能夠介導(dǎo)線粒體裂變功能障礙的發(fā)生,誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞G2/M細(xì)胞周期阻滯。本研究采用不同濃度的水飛薊賓處理宮頸癌HeLa細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)水飛薊賓對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖具有劑量依賴性的抑制作用,該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述水飛薊賓抗腫瘤作用一致。

腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是癌癥患者死亡的主要原因之一,取決于癌細(xì)胞侵入原發(fā)性腫瘤周圍的細(xì)胞外基質(zhì)并進(jìn)入血管的能力,MMPs在基質(zhì)蛋白降解過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用,阻斷MMPs活性可有效防止癌細(xì)胞的侵襲和逃逸[20]。研究發(fā)現(xiàn),水飛薊賓可通過(guò)抑制p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá),從而降低胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[21]。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用[22],MAPK超家族包括ERK1/2、p38和c-Jun氨基末端激酶等,影響著腫瘤細(xì)胞的增殖、周期、凋亡及放射敏感性等[23]。研究顯示,水飛薊賓可抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與侵襲,其機(jī)制與抑制ERK激活,降低MMP-9表達(dá)有關(guān)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)水飛薊賓對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的侵襲能力具有抑制作用,進(jìn)一步通過(guò)分子實(shí)驗(yàn)檢測(cè),結(jié)果顯示水飛薊賓可顯著抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的表達(dá)以及ERK1/2和p38的磷酸化水平,且隨著水飛薊賓處理濃度的升高,其抑制作用越顯著,呈現(xiàn)出劑量依賴性,提示水飛薊賓抑制HeLa細(xì)胞增殖和侵襲可能與ERK/p38 MAPK有關(guān)。我們又進(jìn)一步檢測(cè)了ERK1/2信號(hào)抑制劑PD98059和p38 MAPK抑制劑SB202190對(duì)HeLa細(xì)胞增殖和侵襲的影響,結(jié)果顯示PD98059和SB202190與水飛薊賓效果相同,均能降低MMP-2、MMP-9、p-ERK1/2和p-p38的表達(dá),且聯(lián)合作用較水飛薊賓單獨(dú)作用時(shí)的效果更顯著,表明水飛薊賓可通過(guò)抑制ERK/p38 MAPK信號(hào)通路的激活來(lái)抑制體外HeLa細(xì)胞的增殖和侵襲。

綜上所述,水飛薊賓在體外可抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖,降低細(xì)胞侵襲能力,其作用機(jī)制可能與抑制ERK/p38 MAPK信號(hào)通路的激活,進(jìn)而下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)有關(guān)。