馬璟婷，周杰，李彩琳，吳定宇，彭芳?

（1. 大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 671000； 2. 云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000）

肝細(xì)胞癌（hepatocellualar carcinoma，HCC），簡(jiǎn)稱肝癌，是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的癌癥之一，也是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因［1］。近年來(lái)，全球大部分國(guó)家和地區(qū)的肝癌發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)［2-3］。我國(guó)每年肝癌的增加患者達(dá)到40 萬(wàn)人，病死率是全球病死率的2.54 倍［4-5］。HCC 的發(fā)生是一個(gè)涉及多種危險(xiǎn)因素的復(fù)雜過(guò)程，治療方法主要包括藥物化療和手術(shù)治療，但肝癌患者在接受藥物化療后易產(chǎn)生耐藥性，甚至是產(chǎn)生多藥耐藥性（multiple drug resistance，MDR）［6］。MDR的產(chǎn)生不僅使本身治療的藥物產(chǎn)生耐藥，可能還會(huì)使其他具有不同結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制的化療藥物也產(chǎn)生耐藥性，已成為腫瘤化療成功的最大障礙［7］。目前，很多西藥在逆轉(zhuǎn)耐藥性方面多針對(duì)單一機(jī)制入手，但其不良反應(yīng)大，在臨床應(yīng)用中有很大的局限性。

中藥具有高效低毒、多靶點(diǎn)、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，可通過(guò)多個(gè)途徑逆轉(zhuǎn)腫瘤的MDR［8］。美洲大蠊（Periplaneta americanaL.）作為蜚蠊科體積最大的藥用昆蟲(chóng)在我國(guó)古代中醫(yī)藥書(shū)目中早有記載。本研究團(tuán)隊(duì)的前期實(shí)驗(yàn)研究表明，美洲大蠊提取物CⅡ-3和脫脂膏具有逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥的效果，且初步探明其可能是通過(guò)減少藥物外排、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、減少多藥耐藥相關(guān)基因和酶介導(dǎo)多藥耐藥途徑中相關(guān)基因的mRNA及其蛋白的表達(dá)等方式逆轉(zhuǎn)肝癌的MDR［9-11］，但對(duì)產(chǎn)生了MDR 的惡性腫瘤組織的高浸潤(rùn)和高轉(zhuǎn)移的特性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以肝癌敏感細(xì)胞BEL-7402 和耐藥細(xì)胞BEL-7402/5-FU（5-fluorouracil，5-FU）為試驗(yàn)對(duì)象，并給予CⅡ-3 和脫脂膏進(jìn)行干預(yù)，以此來(lái)探討這些美洲大蠊提取物是否具有影響耐藥細(xì)胞自噬和侵襲轉(zhuǎn)移的作用及其可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

人肝細(xì)胞癌敏感細(xì)胞株BEL-7402、5-FU人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株（BEL-7402/5-FU），批號(hào)均為：MXC050，由上海美軒生物科技有限公司提供。

1.2 主要樣品與試劑

美洲大蠊提取物脫脂膏系褐色黏稠膏狀，得率約為75.18%，批號(hào)：P14805-20171023，由美洲大蠊干燥蟲(chóng)體的醇提物制備的浸膏制得；美洲大蠊脫脂膏進(jìn)一步純化粗提取得CⅡ-3為黃褐色凍干粉末，得率約為0.2%，批號(hào)：17102125，以上兩種均由大理大學(xué)昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研究院張成桂博士提供。5-FU（美國(guó) Sigma公司，批號(hào)：WXBC0190V）；索拉非尼（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：819C021）；0.25% Trypsin-EDTA 胰酶（MESGEN 公司，批號(hào)：092619200313）；ECL 試劑盒（南京建成生物科技有限公司，批號(hào)：092019200325）。

1.3 主要儀器

PCR 儀（美國(guó)伯樂(lè)公司，型號(hào)：785BR15145）；激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)徠卡公司，型號(hào)：Leica TCS SP8 X）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Teck公司，型號(hào)：225939）。

2 方法

2.1 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)

常規(guī)培養(yǎng)BEL-7402 細(xì)胞，并選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 主要藥品配制

用二甲亞砜配制母液為100 mg/mL 的美洲大蠊提取物CⅡ-3 和脫脂膏，索拉菲尼則配成10 mg/mL 的藥物母液，以上均置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)基倍比稀釋為實(shí)驗(yàn)所需的各個(gè)濃度。

2.3 分組與給藥

試驗(yàn)分為敏感組、耐藥組、索拉菲尼組、CⅡ-3 組和脫脂膏組。其中，敏感組加入BEL-7402 細(xì)胞，其余各組加入BEL-7402/5-FU 細(xì)胞。給藥時(shí)，敏感組和耐藥組加入常規(guī)培養(yǎng)基，索拉菲尼組給予3 μg/mL索拉菲尼，CⅡ-3 組和脫脂膏組則分別加入200 μg/mL CⅡ-3和脫脂膏。

2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)自噬標(biāo)志性蛋白p62的生成

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BEL-7402和BEL-7402/5-FU細(xì)胞經(jīng)處理后制成單細(xì)胞懸液，然后按2 × 106個(gè)/皿的細(xì)胞密度接種于事先放有細(xì)胞爬片的12 孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后按照上述實(shí)驗(yàn)分組分別加入含相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。經(jīng)過(guò)一定的孵育、清洗、顯色、脫水、封片等系列處理后，在倒置顯微鏡下觀察拍照。通過(guò)Image J 軟件計(jì)算灰度值，結(jié)果圖采用Graphpad Prism 8軟件繪制。

2.5 激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞自噬蛋白LC3形成

細(xì)胞前期處理及加受試藥等操作基本同“2.4”項(xiàng)，按每皿3 × 104個(gè)的細(xì)胞密度進(jìn)行接種。隨后按照LC3檢測(cè)的基本程序進(jìn)行操作。第2 天于激光共聚焦顯微鏡下拍照觀察。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)細(xì)胞自噬和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子mRNA水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BEL-7402 和BEL-7402/5-FU 細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按每皿1 × 107個(gè)的細(xì)胞的密度接種于皿中，按照上述分組給藥。加入Trizol 試劑提取RNA，然后按第一鏈合成試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。分別在42 ℃ 60 min、80 ℃ 10 min 的反應(yīng)條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。隨后在建立20 μL 反應(yīng)體系、落實(shí)自噬和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子引物后觀察RT-PCR 反應(yīng)，并按照以下公式計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列表見(jiàn)表1 和表2。

表1 自噬相關(guān)因子引物序列表

表2 侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子引物序列表

2.7 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BEL-7402 以及BEL-7402/5-FU 制成單細(xì)胞懸液后，按6 × 105個(gè)/皿的細(xì)胞密度接種于在底部（背面）畫(huà)直線的小皿中，按照上述分組給藥進(jìn)行處理。按劃痕試驗(yàn)操作步驟進(jìn)行操作，并分別在24、48 h顯微鏡下拍照記錄劃痕的愈合情況，并按照以下公式計(jì)算細(xì)胞劃痕的愈合率。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組對(duì)p62蛋白水平的比較

結(jié)果顯示，與敏感組相比，耐藥組細(xì)胞中p62 蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜ 0.01），提示耐藥組細(xì)胞自噬作用增強(qiáng)。給予索拉菲尼、CⅡ-3 和脫脂膏后，耐藥細(xì)胞中p62 蛋白表達(dá)量則顯著升高（P＜ 0.01），表明CⅡ-3 和脫脂膏可明顯抑制肝癌耐藥細(xì)胞的自噬作用。見(jiàn)圖1和表3。

表3 各組細(xì)胞中p62蛋白水平比較（±s）

注：與敏感組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與耐藥組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

p62（相對(duì)表達(dá)量）0.16 ± 0.01 0.09 ± 0.01**0.11 ± 0.01**#0.13 ± 0.01**##0.12 ± 0.01**##組別敏感組耐藥組索拉非尼組CⅡ-3組脫脂膏組n6 6 6 6 6

3.2 各組對(duì)LC3蛋白形成的影響

本研究采用熒光標(biāo)記法來(lái)觀察LC3蛋白。與敏感組相比，耐藥組細(xì)胞具有更多的綠色熒光斑點(diǎn)，提示耐藥組細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的自噬作用。在使用CⅡ-3和脫脂膏處理后，耐藥組中的綠色熒光部分減少，表明CⅡ-3 可顯著抑制細(xì)胞的自噬作用，而脫脂膏組的作用效果并不顯著。見(jiàn)圖2。

圖2 各組對(duì)細(xì)胞中LC3蛋白形成的影響（× 200）

3.3 各組對(duì)自噬相關(guān)因子mRNA的影響

與敏感組細(xì)胞相比，耐藥組中自噬相關(guān)因子自噬相關(guān)蛋白5（autophagy related 5，ATG 5）、自噬相關(guān)蛋白7（autophagy related 7，ATG 7）、磷酸肌醇-3-激酶3（phosphoinositide-3-kinase class 3，PIK3C3）、BECLIN 蛋白（BECLIN protein，BECLIN）、LC3B 均呈現(xiàn)高表達(dá)，而p62的表達(dá)量顯著降低；給予CⅡ-3和脫脂膏處理后，可顯著抑制ATG5、PIK3C3、BECLIN、LC3B的表達(dá)，升高耐藥組中p62的表達(dá)。其中，CⅡ-3對(duì)ATG7的表達(dá)無(wú)顯著影響，而脫脂膏則可明顯升高其表達(dá)。見(jiàn)表4。

表4 各組對(duì)自噬相關(guān)因子mRNA的影響比較（±s）

表4 各組對(duì)自噬相關(guān)因子mRNA的影響比較（±s）

注：與敏感組比較，*P ＜ 0.05， **P ＜ 0.01；與耐藥組比較，#P ＜ 0.05， ##P ＜ 0.01；與索拉非尼組比較，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01。

組別敏感組耐藥組索拉菲尼組CⅡ-3組脫脂膏組p62 1.86 ± 0.25 1.00 ± 0.00*0.14 ± 0.02*##0.74 ± 0.14##1.61 ± 0.29**##n 6 6 6 6 6 ATG7 0.8 ± 0.07 1.00 ± 0.00 1.12 ± 0.21*0.96 ± 0.15 1.52 ± 0.31*##△ATG5 0.85 ± 0.11 1.00 ± 0.00 0.25 ± 0.05**##0.63 ± 0.10**##0.52 ± 0.10**##PIK3C3 0.49 ± 0.09 1.00 ± 0.00**0.29 ± 0.05*##0.42 ± 0.14##△0.74 ± 0.15*##△△BECLIN 0.25 ± 0.05 1.00 ± 0.00**0.13 ± 0.01**##0.10 ± 0.02**##△0.22 ± 0.03**##LC3B 0.59 ± 0.06 1.00 ± 0.00**0.30 ± 0.03**##0.83 ± 0.05**#0.61 ± 0.19#

3.4 各組對(duì)侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子mRNA的影響比較

與敏感組細(xì)胞相比，耐藥組中侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子除哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)（mammalian target of rapamycin，mTOR）的表達(dá)降低外，金屬基質(zhì)蛋白酶2（metal matrix proteinase-2，MMP-2）、金屬基質(zhì)蛋白酶9（metal matrix proteinase-9，MMP-9）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）蛋白、真核細(xì)胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋1（eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4EBP1）的表達(dá)均顯著升高；給予CⅡ-3和脫脂膏后可顯著降低耐藥細(xì)胞中MMP-9、Akt、4EBP1 的表達(dá)，而升高M(jìn)MP-2、mTOR的表達(dá)。以上結(jié)果表明CⅡ-3和脫脂膏均可影響耐藥肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移因子。見(jiàn)表5。

表5 各組對(duì)細(xì)胞侵襲相關(guān)因子mRNA的影響比較（±s）

表5 各組對(duì)細(xì)胞侵襲相關(guān)因子mRNA的影響比較（±s）

注：與敏感組比較，*P ＜ 0.05， **P ＜ 0.01；與耐藥組比較，#P ＜ 0.05， ##P ＜ 0.01；與索拉非尼組比較，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01。

組別敏感組耐藥組索拉非尼組CⅡ-3組脫脂膏組4EBP1 0.72 ± 0.12 1.00 ± 0.00*0.14 ± 0.02#0.80 ± 0.09△0.29 ± 0.05#n 6 6 6 6 6 MMP-2 0.13 ± 0.05 1.00 ± 0.00**0.02 ± 0.01##1.43 ± 0.57**#△△1.20 ± 0.19**△△MMP-9 0.11 ± 0.02 1.00 ± 0.00**0.00 ± 0.01##0.65 ± 0.14**##△△0.05 ± 0.01##mTOR 1.25 ± 0.2 1.00 ± 0.00*0.24 ± 0.05*##1.15 ± 0.39 1.25 ± 0.41△Akt 0.48 ± 0.12 1.00 ± 0.00**0.18 ± 0.04**##0.36 ± 0.09##△0.24 ± 0.13*##△

3.5 各組對(duì)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響比較

在劃痕試驗(yàn)中，細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)細(xì)胞劃痕的愈合速度越快，愈合率越高。和敏感細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞在24、48 h時(shí)細(xì)胞的劃痕愈合率較高，表明耐藥細(xì)胞比敏感細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力；給予陽(yáng)性藥索拉菲尼和CⅡ-3作用24、48 h后劃痕愈合率顯著降低，說(shuō)明CⅡ-3 可顯著抑制細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，而脫脂膏則無(wú)顯著的抑制效果。見(jiàn)表6。

表6 各組對(duì)細(xì)胞劃痕愈合率的影響比較（±s）

表6 各組對(duì)細(xì)胞劃痕愈合率的影響比較（±s）

注：與敏感組比較，*P ＜ 0.05；與耐藥組比較，#P ＜ 0.05；與索拉非尼組比較，△P ＜ 0.05。

劃率組別48 h 55.98 ± 5.20 75.06 ± 9.79*41.40 ± 3.45*#50.13 ± 5.77#△67.51 ± 6.92*△n 6 6 6 6 6 24 h 23.79 ± 5.77 38.69 ± 6.20*27.01 ± 4.37#28.15 ± 5.60#36.21 ± 6.53*△敏感組耐藥組索拉非尼組CⅡ-3組脫脂膏組

4 討論

針對(duì)目前高發(fā)的HCC，臨床上治療主要手段還是以化學(xué)治療為主，如目前臨床效果較好的索拉非尼。但由于化學(xué)治療藥物的長(zhǎng)期使用造成了MDR，而新的藥物研究成本大，研究時(shí)間長(zhǎng)等使得我國(guó)HCC 目前的臨床治療現(xiàn)狀不容樂(lè)觀。作為HCC 發(fā)病率大國(guó)，提高HCC的有效治療，增加有效治愈率，克服HCC的多藥耐藥等已經(jīng)成為了HCC治療中亟待解決的問(wèn)題。而諸多中藥具有高效、低毒、作用靶點(diǎn)并不單一的特點(diǎn)，美洲大蠊作為昆蟲(chóng)藥物具有極其重要的作用，其化學(xué)成分非常豐富，主要含蛋白類、多肽類、糖類、脂肪酸類化合物［12-14］。豐富的化學(xué)成分為美洲大蠊發(fā)揮多樣的藥理活性提供了可能［15-17］。本研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)幾十年的研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊提取物CⅡ-3和脫脂膏具有抗腫瘤的作用，也有一定的對(duì)抗腫瘤MDR 的作用［9-11，18-19］，而對(duì)CⅡ-3和脫脂膏是否影響腫瘤的自噬與侵襲轉(zhuǎn)移則沒(méi)有深入的研究。因此，筆者就是針對(duì)這一問(wèn)題展開(kāi)研究。

細(xì)胞自噬是一種自我降解的機(jī)制，是依賴溶酶體的自我消化過(guò)程。其中LC3 蛋白和p62 蛋白均可作為在自噬起始階段自噬體的標(biāo)記蛋白，且在肝癌組織及癌旁組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)［20］。LC3是自噬體與溶酶體融合的關(guān)鍵分子。在自噬過(guò)程中，LC3 被蛋白酶ATG4 裂解產(chǎn)生LC3-Ⅰ，與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-Ⅱ，而LC3-Ⅱ能與p62 蛋白相互作用，p62 能把膜結(jié)合的LC3-Ⅱ蛋白將其送至自噬小體進(jìn)行降解。另外，p62 蛋白本身也能被自噬降解，因此p62 蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的積累被用作自噬通量減少的標(biāo)志［21］。自噬相關(guān)基因ATG 家族在自噬過(guò)程中也扮演了極其重要的角色，其中ATG5 能促進(jìn)自噬前體膜的延伸，如果其本身突變，還會(huì)影響自噬體的形成。ATG7在自噬體的形成過(guò)程中起到了重要的調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)用肝癌敏感細(xì)胞BEL-7402 和肝癌耐藥多藥耐藥細(xì)胞BEL-7402/5-FU 為試驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)法和激光共聚焦試驗(yàn)觀察細(xì)胞的自噬蛋白表達(dá)，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)自噬相關(guān)因子的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，美洲大蠊提取物CⅡ-3 和脫脂膏可對(duì)自噬相關(guān)因子產(chǎn)生不同程度的影響，其中對(duì)ATG5 影響最為明顯，而對(duì)ATG7以及p62 的影響較小，表明美洲大蠊提取物可能只能作用于自噬的某些階段。

侵襲轉(zhuǎn)移在腫瘤細(xì)胞生命活動(dòng)中具有重要作用。MMP家族可以通過(guò)降解膠原蛋白和層粘連蛋白來(lái)促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移［22-24］，而這個(gè)家族蛋白中尤以MMP-2和MMP-9與腫瘤的轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)密切相關(guān)，兩者在正常細(xì)胞及癌細(xì)胞中的高表達(dá)均能增加細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力［12，25-27］。另外mTOR、Akt、4EBP1等相關(guān)因子也能影響腫瘤細(xì)胞的凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等一系列生命活動(dòng)［13］。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達(dá)和利用劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力來(lái)間接反映美洲大蠊提取物CⅡ-3和脫脂膏是否通過(guò)影響細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移來(lái)發(fā)揮抗HCC的作用。試驗(yàn)結(jié)果表明耐藥肝癌細(xì)胞具有更強(qiáng)侵襲轉(zhuǎn)移能力，且美洲大蠊提取物能抑制耐藥細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，但僅僅能影響部分相關(guān)因子。本研究主要是基于mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)，仍存在一定的局限性，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，還需要對(duì)更多檢測(cè)水平進(jìn)行研究并進(jìn)一步探索美洲大蠊提取物對(duì)自噬和侵襲轉(zhuǎn)移的體內(nèi)影響，為美洲大蠊提取物逆轉(zhuǎn)肝癌 MDR的臨床研究奠定基礎(chǔ)。