鮑 寧 ，陳子超，劉名玉，趙春芹，李 肖*，張 振*

1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，山東 濟南 250355

2.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟南 250355

3.山東中醫(yī)藥大學(xué) 實驗中心，山東 濟南 250355

原發(fā)性肝癌是我國第4 位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因，其中約90%為肝細胞癌[1]。肝癌的發(fā)生、發(fā)展機制復(fù)雜，涉及多個原癌基因以及信號通路[2]。近年來，中藥在肝癌的預(yù)防、控制轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)等方面所具有的優(yōu)勢，使其成為抗肝癌新藥研發(fā)的熱點和方向[3-5]。目前中醫(yī)藥界對于肝癌的理論及治療研究逐漸增多，并形成了較為統(tǒng)一的認識，其病機在于氣虛血瘀，其治法以益氣活血為主[6]。黃芪-莪術(shù)是益氣活血法代表性藥對，源于張錫純所著《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中的理沖湯，主治氣虛血瘀證[7]。從中醫(yī)理論講，黃芪味甘性微溫，可補氣升陽，為“補中益氣之要藥”[8]；莪術(shù)辛散苦泄，能破血散瘀，又能行氣化積，是“破血化瘀之重藥”[9]；兩藥配伍使用“破中有補，補中有行，相得益彰”從而達到“補而不滯”之效，為益氣活血配伍的典型代表[10]。孫桂芝教授擅用桃紅芪術(shù)軟肝煎起益氣活血之效，認為黃芪-莪術(shù)配伍治療肝癌時能夠補脾胃、破癥消積，對肝癌有很好的抑制作用，在臨床實踐中運用此法與化療聯(lián)合使用，能夠明顯改善肝癌患者的生存質(zhì)量，在提高肝癌遠期療效上具有一定優(yōu)勢[11-13]。黃芪-莪術(shù)藥對配伍治療肝癌的作用確切，在抗肝癌中藥中具有重要地位，但是黃芪-莪術(shù)藥對抗肝癌的配伍機制尚不明確。本研究整合生物信息學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測黃芪-莪術(shù)藥對治療肝癌的相關(guān)靶點和通路，將篩選得到的核心成分與靶點進行分子對接，探究黃芪-莪術(shù)藥對的多成分、多靶點、多通路的配伍協(xié)同作用機制，并采用體外細胞實驗對核心成分和靶點進行驗證。系統(tǒng)研究黃芪-莪術(shù)藥對抗肝癌配伍機制，不僅可為含有該藥對的抗肝癌系列類方的研究提供參考，而且有利于指導(dǎo)中醫(yī)臨床的合理用藥，同時為該類方的質(zhì)量控制和新藥研發(fā)提供重要的科學(xué)依據(jù)，為肝癌這一發(fā)病率日趨升高、嚴重威脅人類健康的重大疑難疾病治療做出貢獻。

1 材料

1.1 細胞株

人肝癌HepG2 細胞、人正常LO2 肝細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.2 藥品與試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號G4511-500ML）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號GC203002-100ml）購自武漢塞維爾生物科技有限公司；胰蛋白酶（批號C0208-500ml）、RIPA 強裂解液（批號P0013B）、MTT（批號ST316）購自上海碧云天生物科技有限公司；黃芪皂苷II（批號SJMN1426）、黃芪甲苷（批號SJ-MN0659）、芒柄花素（批號SJ-MN0281）、姜黃素（批號SJ-MN0060）、莪術(shù)醇（批號SJ-MN0198）、雙去甲氧基姜黃素（批號SJ-MN1811）購自山東思科捷生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量分數(shù)均≥98%；細胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）抗體（批號db12527）、細胞周期蛋白B1（cyclin B1，CCNB1）抗體（批號db13323）購自杭州戴格生物技術(shù)有限公司；β-actin 抗體（批號PTG81115-1-RR）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；HRP 標記的山羊抗兔單克隆抗體（批號AS014）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.3 儀器

BB150 型CO2細胞恒溫培養(yǎng)箱、NanoDrop?Lite 微量分光光度計、Multiskan SkyHigh 全波長酶標儀號（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；電泳儀、ChemiDoc XRS＋凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司）；Centrifuge 5425R 型低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司）；Accuri C6 Plus 型流式細胞儀（美國BD 公司）。

2 方法

2.1 生物信息學(xué)分析

2.1.1 肝癌靶點篩選 以“ hepatocellular carcinoma”為關(guān)鍵詞在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）GEO 數(shù)據(jù)庫中檢索并下載與肝癌相關(guān)的GSE57957[14]、GSE60502[15]、GSE84402[16]基因表達譜，芯片平臺分別為 GPL10558、GPL96[HGU133A]、GPL570[HG-U133_Plus_2]，共收集142（78、36、28）例樣本，其中肝癌組織樣本71（39、18、14）例，癌旁組織樣本71（39、18、14）例。將以上3 個基因表達譜通過歸一化和基于log2轉(zhuǎn)化進行定量，之后使用R 軟件包stats（version 3.6.0）進行主成分分析（principal component analysis，PCA）[17]，同時使用R 軟件包“Limma”包[18]（version 3.40.6）進行差異表達基因（differential expression genes，DEGs）篩選，篩選條件為|log2FC|＞1[FC 表示倍數(shù)變化（fold change）]和P值＜0.05，將3 組數(shù)據(jù)集篩選得到的DEGs 合并，作為肝癌靶點。

2.1.2 肝癌關(guān)鍵靶點篩選 通過STRING（https://cn.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫對“2.1.1”項下肝癌靶點進行分析，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，所有參數(shù)選擇默認值，導(dǎo)出tsv 格式的數(shù)據(jù)并輸入到Cytoscape（version 3.9.1）軟件中構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，然后利用MCODE 插件對PPI 網(wǎng)絡(luò)中聯(lián)系緊密的功能模塊進行分析，分析條件為“Degree Cutoff＝2、Node Score Cutoff＝0.2、k-Core＝2、Max.Depth＝100”。將得分最高的功能模塊的子網(wǎng)中所含靶點作為肝癌關(guān)鍵靶點[19]。

2.1.3 黃芪、莪術(shù)化學(xué)成分收集及潛在活性成分篩選 在TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫中對黃芪、莪術(shù)成分進行檢索；將人體口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18 的成分作為潛在活性成分，并結(jié)合文獻報道，將具有體內(nèi)外抗癌活性的黃芪、莪術(shù)成分補充到潛在活性成分中[20-21]。

2.1.4 黃芪、莪術(shù)活性成分靶點預(yù)測與抗肝癌靶點篩選 在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中檢索“2.1.3”項下活性成分的Isomeric SMILES 數(shù)據(jù)，將該數(shù)據(jù)輸入SEA（http://sea.bkslab.org/）和 SwissTargetPrediction（http://www.swiss targetprediction.ch/）2 個數(shù)據(jù)庫，預(yù)測成分靶點，與TCMSP 數(shù)據(jù)庫中的靶點取并集得到潛在活性成分作用靶點，并在Uniprot 數(shù)據(jù)庫中對靶點基因名稱進行校正，使蛋白質(zhì)靶點信息標準化[22]。將成分作用靶點與“2.1.1”項下所篩選肝癌靶點取交集，得到黃芪、莪術(shù)抗肝癌靶點。

2.1.5 黃芪、莪術(shù)抗肝癌關(guān)鍵成分篩選 將“2.1.4”項下潛在活性成分靶點與“2.1.2”項下所篩選肝癌關(guān)鍵靶點取交集，采取疾病關(guān)鍵靶點“反向鉤釣”關(guān)鍵潛在活性成分的方式，得到黃芪、莪術(shù)抗肝癌關(guān)鍵成分及其靶點。

2.1.6 黃芪、莪術(shù)抗肝癌靶點及關(guān)鍵靶點京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 通過KEGG rest API（https://www.kegg.jp/kegg/rest/keggapi.html）獲取最新KEGG 通路基因注釋，使用R 軟件包cluster Profiler（version 3.14.3）進行富集分析，設(shè)定閾值最小基因集為5、最大基因集為5 000、P＜0.05、FDR＜0.1，根據(jù)包含靶點數(shù)量篩選排名靠前的KEGG 富集信息[23]。

2.1.7 拓撲網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 采用 Cytoscape（version 3.9.1）軟件構(gòu)建肝癌關(guān)鍵靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)、成分-靶點網(wǎng)絡(luò)、關(guān)鍵成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)。通過Network Analyzer 插件對關(guān)鍵成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)的拓撲性質(zhì)進行分析，獲取成分、靶點、通路相關(guān)介數(shù)值。

2.1.8 黃芪、莪術(shù)抗肝癌核心成分及其抗肝癌核心靶點篩選 通過1 種網(wǎng)絡(luò)貢獻指數(shù)（CI）評價黃芪-莪術(shù)抗肝癌成分發(fā)揮抗肝癌作用的貢獻大小[24]。

i為成分的數(shù)量；j為靶點的數(shù)量；ωei為網(wǎng)絡(luò)節(jié)點參數(shù)；Aij為根據(jù)ωei值確定的親和力指數(shù)；CAi為黃芪關(guān)鍵成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)中每種抗肝癌成分的介數(shù)；CBi為莪術(shù)關(guān)鍵成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)中每種抗肝癌成分的介數(shù)，Ci為每種抗肝癌成分的介數(shù)；Pj為每種靶點的介數(shù)，以參數(shù)由關(guān)鍵成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)中獲得；NEi為網(wǎng)絡(luò)中1 種抗肝癌成分的網(wǎng)絡(luò)貢獻；CI 為抗肝癌成分發(fā)揮抗肝癌作用的貢獻大小

以“hepatocellular carcinoma”和“l(fā)iver cancer”及活性成分的常用名稱用作為關(guān)鍵詞，檢索1990—2018 年出版于PubMed 和CNKI 數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)文獻。如果前N個成分的CI 總和超過50%，則認為這些相關(guān)的N個成分對黃芪和莪術(shù)發(fā)揮抗肝癌作用的貢獻最大；CI 總和超過90%，則認為這些相關(guān)的N個成分對黃芪和莪術(shù)發(fā)揮抗肝癌作用的貢獻最主要。核心成分在關(guān)鍵成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)中所調(diào)節(jié)的介數(shù)大于5 的靶點為抗肝癌核心靶點。

2.1.9 黃芪、莪術(shù)抗肝癌核心成分與靶點分子對接驗證 在PubChem 數(shù)據(jù)庫中獲得化合物的SDF 文件，然后通過Open Babel 3.1.1 軟件將獲得的SDF 文件轉(zhuǎn)化為MOL2 格式；從AlphaFold 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（AlphaFold Protein Structure Database，https://alphafold.ebi.ac.uk/）獲取抗肝癌核心靶點的PDB 文件；靶蛋白與化合物均使用Auto Dock Tools1.5.6 去除水分子、加氫、計算電荷等前處理，轉(zhuǎn)化為PDBQT格式；利用Autodock Vina 1.1.2 軟件進行分子對接，分子對接的結(jié)合能越低表示構(gòu)象越穩(wěn)定，對結(jié)果進行分析，繪制分子對接結(jié)合能熱圖[21]。

2.1.10 核心基因在腫瘤及正常組織表達量差異分析 在癌癥基因組圖譜（cancer genome atlas，TCGA）網(wǎng)站中得到核心基因在腫瘤組織及正常組織中的表達量，進行差異表達分析[25]。

2.2 細胞實驗驗證

2.2.1 MTT 實驗 將處于對數(shù)生長期的HepG2 和LO2 細胞分別以5 000 個/孔接種到96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，分別給予不同濃度的黃芪皂苷II、黃芪甲苷、芒柄花素、莪術(shù)醇、姜黃素、雙去甲氧基姜黃素，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，同時設(shè)置調(diào)零孔（不接種細胞），處理24、48、72 h，處理后每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL），37 ℃孵育4 h；去上清，加入100 μL DMSO 終止孵育，使用酶標儀測定570 nm 處的吸光度（A）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝(A給藥－A調(diào)零)/(A對照－A調(diào)零)

2.2.2 藥物協(xié)同作用研究 根據(jù)“2.2.1”項結(jié)果，從黃芪、莪術(shù)各成分中各選1 個作用效果最佳的單體，進行藥物協(xié)同作用研究。細胞存活率的結(jié)果通過Chou-Talalay 模型進行分析，以評價黃芪-莪術(shù)成分配伍的協(xié)同作用，明確最佳協(xié)同劑量，CompuSyn軟件采用Chou-Talalay 模型計算藥物組合的組合指數(shù)，組合指數(shù)＝1 為加和效應(yīng)，組合指數(shù)＜1 為協(xié)同作用，組合指數(shù)＞1 為拮抗作用[24]。

2.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 將HepG2 細胞以2.5×105個/孔接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后分別給予黃芪皂苷II（5 μmol/L）、雙去甲氧基姜黃素（5 μmol/L）及黃芪皂苷II（2.5 μmol/L）＋雙去甲氧基姜黃素（2.5 μmol/L），以不含藥液的培養(yǎng)基作為對照，處理24 h 后收集細胞，細胞密度調(diào)整為1×106個/mL，用預(yù)冷的PBS 洗滌2 次，然后加入500 μL預(yù)冷的70%乙醇固定，?4 ℃過夜，細胞離心后在沉淀中加入100 μL RNaseA 溶液，37 ℃孵育30 min，加入400 μL 碘化丙啶（PI）染色液，于4 ℃避光孵育30 min 后上機檢測[26]。

2.2.4 Western blotting 法檢測蛋白表達 選擇“2.2.2”項單體對應(yīng)的靶點在Pymol 軟件中進行分子對接可視化，并通過Western blotting 實驗驗證單體對蛋白表達的影響。分組與給藥同“2.2.3”項，收集藥物作用后的HepG2 細胞，加入細胞裂解液提取總蛋白，使用Nanodrop lite 檢測蛋白濃度，蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后，加入一抗，4 ℃孵育過夜；加入二抗，37 ℃孵育2 h，使用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，采用Image J 軟件分析條帶灰度值。

2.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism 9.5軟件處理，采用單因素方差分析進行組間統(tǒng)計。

3 結(jié)果

3.1 肝癌靶點及關(guān)鍵肝癌靶點

對GSE57957、GSE60502、GSE84402 肝癌基因表達數(shù)據(jù)進行PCA，結(jié)果顯示在3 個數(shù)據(jù)集中，肝癌組織與癌旁組織基因表達均能明顯區(qū)分（圖1-A～C）；進一步Limma 分析，結(jié)果顯示在3 組數(shù)據(jù)中DEGs 分別有353 個（上調(diào)85 個，下調(diào)268 個）、1 241 個（上調(diào)575 個，下調(diào)666 個）、1 689 個（上調(diào)1 031 個，下調(diào)658 個，圖1-D～F）；將以上3 組數(shù)據(jù)中的DEGs 取并集，共得到肝癌靶點2 766 個（圖1-G）；進一步疾病關(guān)鍵靶點分析，結(jié)果顯示PPI網(wǎng)絡(luò)中得分最大為97.33 的MCODE 功能模塊所含有的112 個靶點為肝癌關(guān)鍵靶點（圖1-H）。

3.2 黃芪、莪術(shù)活性成分及其抗肝癌靶點和KEGG通路

通過檢索TCMIP 數(shù)據(jù)庫，得到黃芪化學(xué)成分87 種，經(jīng)篩選潛在活性成分26 種，其中OB≥30%、DL≥0.18 的成分20 種（AR-1～AR-20），通過文獻補充的成分6 種（AR-21～AR-26）；得到莪術(shù)化學(xué)成分81 種，經(jīng)篩選潛在活性成分13 種，其中OB≥30%、DL≥0.18 的成分3 種（CR-1～CR-3），通過文獻補充的成分10 種（CR-4～CR-13），黃芪與莪術(shù)共有成分1 種（常春藤皂苷元），共得到黃芪-莪術(shù)藥對潛在活性成分38 種（表1）。

采用TCMSP、SEA、SwisstargetPrediction 數(shù)據(jù)庫預(yù)測得到38 種潛在活性成分靶點1 177 個，與“3.1”項下2 766 個肝癌靶點取交集，得到黃芪-莪術(shù)抗肝癌活性成分33 個，其中黃芪22 個（無AR-7、AR-13、AR-15、AR-20），莪術(shù)12 個（無CR-9），兩者共有成分1 個（AR-3、CR-1），對應(yīng)抗肝癌靶點180 個，其中黃芪獨有靶點77 個、莪術(shù)獨有靶點14 個、兩者共有靶點89 個（圖2-A）。

圖2 黃芪-莪術(shù)抗肝癌成分-靶點網(wǎng)絡(luò) (A) 和KEGG 富集分析 (B)Fig.2 Anti-hepatocellular carcinoma component of Astragali Radix-Curcumae Rhizoma-target network (A) and KEGGenrichment analysis (B)

分別對黃芪166 個靶點、莪術(shù)103 個靶點進行KEGG 富集分析，根據(jù)包含靶點數(shù)量篩選排名前20的通路，結(jié)果顯示，黃芪與莪術(shù)所調(diào)節(jié)的20 條通路中，共有通路有9 條；其中黃芪中排名前5 位的通路分別為代謝途徑、癌癥的通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路、細胞周期，莪術(shù)中排名前5 位的通路分別為代謝途徑、癌癥的通路、類固醇激素生物合成、膽汁分泌、化學(xué)致癌（圖2-B）。

3.3 黃芪、莪術(shù)抗肝癌關(guān)鍵成分及其靶點和KEGG通路

通過肝癌關(guān)鍵靶點進行“反向鉤釣”，得到黃芪-莪術(shù)抗肝癌關(guān)鍵成分29 種，其中黃芪抗肝癌關(guān)鍵成分22 種、莪術(shù)抗肝癌關(guān)鍵成分8 種，兩者共有抗肝癌關(guān)鍵成分1 種（常春藤皂苷元，圖3-A）。29 種黃芪-莪術(shù)抗肝癌關(guān)鍵成分所調(diào)節(jié)抗肝癌關(guān)鍵靶點15 個，對以上靶點進行KEGG 富集分析，共得到17 條通路，其中最為重要的細胞過程包含細胞周期、細胞衰老、p53 信號通路、卵母細胞減數(shù)分裂、細胞凋亡-多個物種共5 條信號通路（圖3-B）。

圖3 黃芪-莪術(shù)抗肝癌關(guān)鍵成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò) (A) 和KEGG 富集分析 (B)Fig.3 Key component of Astragali Radix-Curcumae Rhizoma against hepatocellular carcinoma-target-pathway network (A)and KEGG enrichment analysis (B)

3.4 黃芪、莪術(shù)抗肝癌核心成分和靶點的分子對接

通過網(wǎng)絡(luò)貢獻指數(shù)模型，計算黃芪-莪術(shù)抗肝癌29 種關(guān)鍵成分的抗肝癌作用貢獻指數(shù)。根據(jù)計算結(jié)果，CI 值合計為55.67%的前6 種成分均為黃芪成分，表明其抗腫瘤作用貢獻最大；CI 值合計為90.64%的前17 種成分中莪術(shù)成分有2 種，在一定程度上表明黃芪-莪術(shù)配伍發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用（圖4-A）。根據(jù)成分CI 值及其所在中藥中的相對特異性，選取黃芪中的黃芪皂苷II、黃芪甲苷、芒柄花素與莪術(shù)中的莪術(shù)醇、姜黃素、雙去甲氧基姜黃素共6 種成分作為黃芪-莪術(shù)藥對的核心代表性成分，與之相對應(yīng)的 CDK1、DNA 拓撲異構(gòu)酶 2A（topoisomerase 2A，TOP2A）、極光激酶B（aurora B，AURKB）、檢查點蛋白激酶1（check point kinase 1，CHEK1）、AURKA 共5 個靶點為核心靶點。對分子對接得分進行熱圖分析，結(jié)果顯示CDK1 與這6 個核心成分均有較好的結(jié)合活性（結(jié)合能均＜?5 kJ/moL，圖4-B）。將上述5 個靶點在腫瘤組織與正常組織之間的表達量差異進行分析，結(jié)果顯示以上5 個靶點在肝癌組織及正常組織中的表達均有較大差異（圖4-C）。

圖4 黃芪-莪術(shù)抗肝癌關(guān)鍵成分貢獻指數(shù)圖 (A)、分子對接得分熱圖 (B)、正常組織和腫瘤組織核心靶點基因表達 (C)Fig.4 Contribution index plot of key components of Astragali Radix-Curcumae Rhizoma against hepatocellular (A),molecular docking score heat map (B), gene expressions of core targets between normal and tumor tissues (C)

3.5 黃芪、莪術(shù)活性成分對HepG2 細胞增殖的抑制作用

如圖5 所示，不同濃度的黃芪皂苷II、黃芪甲苷、芒柄花素、姜黃素、莪術(shù)醇、雙去甲氧基姜黃素對HepG2 細胞均有一定的抑制作用，且呈劑量相關(guān)性，應(yīng)用Graphpad Prism 9.5 軟件計算各單體作用于HepG2 細胞 24 h 的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）分別為黃芪皂苷II 12.22 μmol/L、芒柄花素34.03 μmol/L、黃芪甲苷223.9 μmol/L、雙去甲氧基姜黃素9.797 μmol/L、姜黃素46.31 μmol/L、莪術(shù)醇206.7 μmol/L。黃芪甲苷（0～25 μmol/L）、黃芪皂苷II（0～20 μmol/L）、芒柄花素（0～20 μmol/L）、姜黃素（0～20 μmol/L）、雙去甲氧基姜黃素（0～20 μmol/L）、莪術(shù)醇（0～50 μmol/L）在一定的濃度范圍內(nèi)對LO2 細胞活性幾乎無影響。

圖5 黃芪-莪術(shù)藥對活性成分對HepG2 (A) 及LO2 (B) 細胞活性的影響 (±s, n = 3)Fig.5 Effect of active ingredients of Astragali Radix-Curcumae Rhizoma herb pair on viability of HepG2 (A) and LO2 (B)cells (±s , n = 3)

3.6 藥物協(xié)同作用研究

為了評價黃芪-莪術(shù)藥對成分配伍的體外抗腫瘤協(xié)同作用，選擇雙去甲氧基姜黃素和黃芪皂苷II進行協(xié)同作用研究，通過Chou-Talalay 數(shù)學(xué)模型進行協(xié)同作用效果評價[27]。結(jié)果如圖6 所示，與單獨藥物作用相比，聯(lián)合組的細胞活力顯著降低（P＜0.05、0.01）。為了查明該組合是否起到加和作用或協(xié)同作用，使用CompuSyn 軟件進一步分析細胞活性數(shù)據(jù)，結(jié)果表明各濃度的雙去甲氧基姜黃素和黃芪皂苷II 在中位有效劑量（組合指數(shù)＜1）時均表現(xiàn)出協(xié)同作用，其最佳協(xié)同劑量為0.625 μmol/L 黃芪皂苷II 和0.625 μmol/L 雙去甲氧基姜黃素。

圖6 雙去甲氧基姜黃素和黃芪皂苷II 的協(xié)同抗肝癌作用 (±s, n = 3)Fig.6 Synergistic anti-hepatocellular carcinoma effect of bisdemethoxycurcumin and astragaloside II (±s, n = 3)

3.7 雙去甲氧基姜黃素與黃芪皂苷II 對Hep G2 細胞周期的影響

細胞周期檢測結(jié)果顯示，黃芪皂苷II（5 μmol/L）和雙去甲氧基姜黃素（5 μmol/L）以及聯(lián)合給藥（黃芪皂苷 II 2.5 μmol/L＋雙去甲氧基姜黃素 2.5 μmol/L）處理HepG2 細胞24 h 后可導(dǎo)致細胞周期異常。如圖7 所示，與對照組比較，不同組別藥物處理HepG2 細胞24 h 后，各組G2/M 期的細胞比例均升高。與單用黃芪皂苷II 和雙去甲氧基姜黃素組相比，聯(lián)合組G2/M 期細胞比例顯著升高（P＜0.01），上述結(jié)果提示黃芪皂苷II 與雙去甲氧基姜黃素均能誘導(dǎo)HepG2 細胞周期停滯于G2/M 期，且聯(lián)用效果更佳（P＜0.01）。

圖7 雙去甲氧基姜黃素、黃芪皂苷II 以及聯(lián)合組對HepG2 細胞周期的影響 (±s , n = 3)Fig.7 Effect of bisdemethoxycurcumin, astragaloside II and combination group on cycle of HepG2 cells (±s , n = 3)

3.8 分子對接及Western blotting 法檢測蛋白表達

利用Pymol 軟件將“3.4”項的黃芪皂苷II、雙去甲氧基姜黃素與CDK1 的對接情況進行可視化，結(jié)果如圖8-A 所示，黃芪皂苷II 與CDK1 結(jié)合能力較強，分別在ASP-92、GLN-132、THR-14 形成H 鍵，結(jié)合能為?6.27 kJ/mol；雙去甲氧基姜黃素與CDK1結(jié)合能力較強，分別在THR-14、THR-47 形成H 鍵，結(jié)合能為?7.04 kJ/mol。蛋白表達結(jié)果顯示，黃芪皂苷II（5 μmol/L）組、雙去甲氧基姜黃素（5 μmol/L）組以及聯(lián)合組細胞CDK1 和CCNB1 蛋白表達水平均顯著低于對照組（P＜0.05、0.01），且聯(lián)合組效果較單藥組顯著（P＜0.05、0.01，圖8-B）。

圖8 雙去甲氧基姜黃素、黃芪皂苷II 與CDK1 的分子對接 (A) 和雙去甲氧基姜黃素、黃芪皂苷II 以及聯(lián)合組對HepG2細胞周期蛋白表達 (B) 的影響 (±s , n = 3)Fig.8 Docking of bisdemethoxycurcumin and astragaloside II to CDK1 (A), effect of bisdemethoxycurcumin, astragaloside II and combination group on cyclin protein expressions (B) in HepG2 cells (±s , n = 3)

4 討論

古今醫(yī)家多認為正氣虧虛為肝癌的發(fā)病內(nèi)因和前提，瘀血凝滯是肝癌發(fā)病的基本病理因素，正氣不足、瘀血阻滯始終伴隨著肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[28]。因此臨床治療肝癌常將黃芪、莪術(shù)等益氣藥與活血藥配伍使用，不僅可輔助正氣，同時能行氣活血，兩者兼顧，共湊扶正祛邪之效[11-13,29-30]。

本研究利用生物信息學(xué)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)探究黃芪-莪術(shù)藥對治療肝癌的活性成分、潛在靶點和信號通路，進而揭示其配伍機制。結(jié)果顯示，黃芪-莪術(shù)抗肝癌活性成分33 種，其中黃芪22 種、莪術(shù)12 種、兩者共有成分1 種；對應(yīng)抗肝癌靶點180 個，其中黃芪調(diào)節(jié)77 個、莪術(shù)調(diào)節(jié)14個、兩者共同調(diào)節(jié)89 個；KEGG 通路富集分析顯示黃芪-莪術(shù)藥對調(diào)節(jié)抗肝癌通路31 條，其中黃芪調(diào)節(jié)20 條、莪術(shù)調(diào)節(jié)20 條、共同調(diào)節(jié)9 條。以上結(jié)果從成分、靶點、通路3 個方面揭示了黃芪、莪術(shù)配伍協(xié)同抗肝癌的科學(xué)內(nèi)涵。

KEGG 通路結(jié)果顯示黃芪-莪術(shù)藥對主要通過細胞周期、細胞衰老、p53 信號通路、細胞凋亡、代謝通路等發(fā)揮抗肝癌作用。其中細胞周期、p53 信號通路是與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號通路，在調(diào)控肝癌細胞周期、增殖、凋亡、細胞代謝等行為上發(fā)揮重要作用。p53 作為一種轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)其下游基因的表達來調(diào)控細胞周期阻滯、細胞衰老、DNA 修復(fù)和細胞凋亡等過程，p53 缺失不僅會引起細胞分裂的增加和細胞存活率的提高，還會引起更具侵襲性的行為和基因組不穩(wěn)定性的增加[31]。p53 下游靶蛋白p21 和CDK2 調(diào)控細胞周期的進行，CDK2 與CCNA、CCNE 相互作用可使Rb 蛋白磷酸化，從而促進細胞從G1期進入S 期，p21 可以抑制其相互作用從而抑制細胞周期進程[32-33]。

經(jīng)篩選得到的6 個核心成分（黃芪甲苷、黃芪皂苷II、芒柄花素、姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、莪術(shù)醇），均具有不同程度的抗腫瘤作用，其調(diào)控的5 個核心基因（CDK1、CHEK1、TOP2A、AURKA、AURKB），在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中同樣具有重要的調(diào)控作用。研究表明，AURK 是一類絲/蘇氨酸激酶，可以通過干擾中心體、紡錘體以及染色體的功能影響細胞的有絲分裂，AURKA 調(diào)節(jié)有絲分裂早期中心體成熟，參與建立雙極紡錘體，其功能的有效發(fā)揮離不開周期蛋白B 與CDK 復(fù)合物（cyclin BCDK1）的正常作用，活化的cyclin B-CDK1 可以使蛋白磷酸酶1（protein phosphatase 1，PP1）失活，PP1 可以抑制AURKA 活性[34]。CDK1 是調(diào)控細胞周期的關(guān)鍵蛋白，CHEK1 為調(diào)控CDK 蛋白的上游蛋白，CHEK1 的磷酸化能夠?qū)е录毎至阎芷谝蜃?5A/C（cell division cyclin 25A/C，CDC25A/C）的磷酸化失活，從而抑制CDK1 進入有絲分裂G2/M期[35]。分子對接結(jié)果顯示核心成分（黃芪甲苷、黃芪皂苷II、芒柄花素、姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、莪術(shù)醇）與核心靶點（CDK1、CHEK1、TOP2A、AURKB、AURKA）結(jié)合能較強，可能存在較好的結(jié)合活性。研究發(fā)現(xiàn)，芒柄花素通過環(huán)氧合酶-2/CCND 軸將人肝癌Bel-7402 細胞和HepG2 細胞阻滯于G0/G1期[36-37]；莪術(shù)醇可以阻滯HepG2 細胞于G1期[38]；黃芪甲苷能夠上調(diào)具有低轉(zhuǎn)移潛能和高轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌Huh7 細胞和人肝癌MHCC97-H 細胞中E-鈣黏蛋白的蛋白水平并促進其在細胞膜上積累，使得細胞間連接更加緊密從而降低轉(zhuǎn)移擴散能力；姜黃素能夠通過激活Huh7 細胞內(nèi)死亡受體介導(dǎo)的通路誘導(dǎo)凋亡[39]；且黃芪甲苷與姜黃素聯(lián)用對血管生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metallopeptidase 2，MMP2）、成纖維細胞生長因子-2（fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2）、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）以及血栓形成相關(guān)因子組織因子（tissue factor，TF）和凝血因子VII 有協(xié)同抑制作用[40]。

通過體外細胞實驗驗證了黃芪-莪術(shù)藥對6 個核心成分對HepG2 細胞的增殖均具有明顯的抑制作用。協(xié)同作用分析結(jié)果顯示，黃芪中的黃芪皂苷II 和莪術(shù)中的雙去甲氧基姜黃素配伍有協(xié)同作用，其最佳協(xié)同劑量為黃芪皂苷II 0.625 μmol/L、雙去甲氧基姜黃素0.625 μmol/L。2 個成分配伍使用可協(xié)同增效抑制周期調(diào)控蛋白CDK1 和CCNB1 的表達，進而誘導(dǎo)HepG2 細胞停滯于G2/M 期。

本研究基于生物信息學(xué)數(shù)據(jù)，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法與分子對接技術(shù)及細胞實驗證明了黃芪、莪術(shù)配伍能夠通過多成分、多靶點、多通路在肝癌治療中發(fā)揮協(xié)同作用，為更準確尋找、確認和優(yōu)化黃芪、莪術(shù)發(fā)揮抗肝癌效應(yīng)的有效成分與靶點的作用，推動臨床應(yīng)用提供新的見解。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突