溫 健，劉 文*，宋朔堯，李和蓉，金 陽, ，張 環(huán)，石惠云，王守莉

1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025

2.易慧生物技術(shù)（上海）有限公司，上海 200120

3.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州 貴陽 550004

口服給藥由于具備便捷性、順應(yīng)性等優(yōu)勢，是目前治療胃潰瘍最常用、最有效的給藥方式[1-2]，但在復(fù)雜的胃內(nèi)環(huán)境中，藥物常規(guī)劑型的治療效果往往不太理想[3-6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[7-9]，吳茱萸堿（evodiamin，Evo）對胃部疾病的治療效果極為明顯。但由于吳茱萸堿存在水溶性差，缺乏靶向治療作用等缺點，極大地限制了其臨床應(yīng)用[10-11]。針對吳茱萸堿口服制劑在應(yīng)用中存在的問題，本研究設(shè)計了吳茱萸堿磷脂復(fù)合物自微乳給藥系統(tǒng)（evodiamine phospholipid complex self-emulsifying drug delivery system，Evo-PC-SMEDDS）以改善其性質(zhì)，在前期實驗中，確定了Evo-PC-SMEDDS 最佳的制備工藝，對所制得的藥物進行了表征，并對其胃黏膜滲透性進行了評價[12]，證實所制得的Evo-PC-SMEDDS 具備良好的穩(wěn)定性，并可顯著改善吳茱萸堿的體外釋放能力和胃黏膜滲透性，具有進一步深入研究的潛力。

對于Evo-PC-SMEDDS 跨黏膜轉(zhuǎn)運效應(yīng)的評價僅僅只停留在體外水平，缺乏體內(nèi)驗證過程。關(guān)于Evo-PC-SMEDDS 是否具備胃潰瘍靶向能力，能否實現(xiàn)在胃內(nèi)的特異性富集仍然需要進行深入研究。同時，所制得制劑對胃潰瘍的改善作用相比于原藥與陽性藥物是否存在優(yōu)勢，也需要通過動物體內(nèi)實驗進行驗證。強滲透長滯留（enhanced permeability and retention，EPR）效應(yīng)是指藥物通過病灶部位血管的異常結(jié)構(gòu)實現(xiàn)靶向遞送與特異性富集的現(xiàn)象[13]，其發(fā)現(xiàn)是最近數(shù)十年來被動靶向藥物研發(fā)領(lǐng)域重要推動[14]，有學(xué)者認為大分子靶向藥物可以利用EPR效應(yīng)實現(xiàn)相較于小分子藥物更強的靶向，進而延長藥物在病灶的富集時間，增強靶向療效[15]。激光共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM）是在藥物傳遞系統(tǒng)中被廣泛應(yīng)用的近代生物醫(yī)學(xué)成像儀器，在藥物傳遞系統(tǒng)進入細胞及藥物釋放過程中，可以對遞藥系統(tǒng)在細胞內(nèi)的分布情況進行觀察，從而為遞藥系統(tǒng)的應(yīng)用提供重要依據(jù)。因此，本研究旨在前期研究基礎(chǔ)上，進一步探究Evo-PC-SMEDDS 在體內(nèi)的胃滯留情況，并應(yīng)用LSCM 技術(shù)對其胃潰瘍靶向效應(yīng)做出評價，探究Evo-PC-SMEDDS 對乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍模型的保護作用，為胃潰瘍新型遞送系統(tǒng)的研究開發(fā)和合理應(yīng)用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

5810R 型臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；JEM-1400PLUS 型透射電子顯微鏡，日本電子株式會社；EMTP 型組織切片機，德國徠卡公司；Pannoramic 250 型數(shù)字切片掃描系統(tǒng)，濟南丹吉爾電子有限公司；RS36 型全自動染色機，常州派斯杰醫(yī)療設(shè)備有限公司；XH-C 型漩渦混合器，金壇市白塔新寶儀器廠；T18 digital 型高速剪切機，德國IKA Ultra-Turrax 公司；馳久08-2G 型磁力攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；ME104/02 型萬分之一電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；IKA-10 型多功能組織勻漿器械，德國IKA 集團；PHY-III 型病理組織漂烘儀，常州市中威電子儀器有限公司；EXL800型多功能酶標(biāo)儀，美國BLO-TEK公司；XP-75 型倒置熒光顯微鏡、FV1000-IX81 型激光共聚焦顯微鏡，日本Olympus 公司；IVIS Lumina LT 型PE 小動物活體光學(xué)成像系統(tǒng)，美國珀金埃爾默公司。

1.2 藥品與試劑

Evo-PC-SMEDDS、Evo-PC 由實驗室自制；無水乙醇（分子生物學(xué)專用，批號D2121155）購自上海阿拉丁試劑公司；4%多聚甲醛組織固定液（批號BL539A）和中性樹膠（批號69120060 BL704A）購自Biosharp 生物試劑公司；羧甲基纖維素鈉（批號20191021）購自光復(fù)精細化工研究所；蘇木素、伊紅染液（批號C200301）購自海貝索生物技術(shù)有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、過氧化氫酶（catalase，CAT）檢測試劑盒購自南京建成科技有限公司；Xenolight?DiR 熒光素購自美國珀金埃爾默公司；香豆素-6（coumarin-6，C6）購自上海譜振生物科技有限公司；膠體果膠鉍膠囊，批號20200603，購自山西新寶源制藥有限公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）和4?,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（4?,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI）購自索萊寶生物科技有限公司。

1.3 動物

SPF 級雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，總計75 只，由貴州醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（黔）2021-0021。本研究動物實驗方案通過貴州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會的審查（編號2020069），課題中所使用的動物嚴格按照批準(zhǔn)的研究方案開展。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好，飼養(yǎng)在溫度23～25 ℃、濕度50%～60%環(huán)境下，并進行12 h 明暗循環(huán)。

2 方法與結(jié)果

2.1 Evo-PC-SMEDDS 的制備

參考本課題組前期優(yōu)選出的方法制備Evo-PCSMEDDS[15]。將2.0 g 吳茱萸堿原料藥與2.0 g 卵磷脂置于50 mL 乙醇-四氫呋喃混合有機溶液中反應(yīng)，溫度為55 ℃，時間為3 h；反應(yīng)結(jié)束后，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收有機溶劑，將殘余混合物真空冷凍干燥48 h；將干燥后的混合物加入150 mL 氯仿中復(fù)溶至完全溶解，再抽濾過0.22 μm 有機膜去除未復(fù)合的雜質(zhì)；所得濾液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收氯仿，再真空冷凍干燥48 h，即得Evo-PC。固定SMEDDS 總質(zhì)量為1 g，其中油酸乙酯25%、聚山梨酯80 和HS15 組成的混合乳化劑（質(zhì)量比為2∶1）55%、無水乙醇20%。然后將40 mg Evo-PC 加入SMEDDS 中，超聲30 min 助溶，再置于37 ℃水浴條件下攪拌，直至獲得穩(wěn)定的透明液體，即得Evo-PC-SMEDDS（載藥量為 1.93%，包封率為95.28%）。

2.2 Evo-PC-SMEDDS 動物熒光成像實驗

2.2.1 DiR-EPC 的制備 將25 mg 的DiR 染料溶于3 mL 無水乙醇，制備DiR 染料儲備液（按照試劑商Xenolight?DiR 方案）。為使DiR 熒光染料與PC-SMDDES 組分結(jié)合，按照Evo-PC-SMEDDS 最優(yōu)處方工藝，將DiR 染料儲備液與“2.1”項中制備的混合乳化劑充分混勻，于避光狀態(tài)下制備含DiR標(biāo)記的Evo-PC-SMEDDS（DiR-EPC），在DiR-EPC中加入適量清水乳化分散即得。

2.2.2 動物分組與給藥 將9 只雄性SD 大鼠隨機分為3 組，即①正常大鼠DiR 游離染料組（Free-DiR）；②正常大鼠DiR-EPC 組（DiR-EPC）；③模型大鼠DiR-EPC 組（DiR-EPC＋M），作為胃潰瘍對照組。模型組大鼠按5 mL/kg 劑量ig 給予75%乙醇，以形成大鼠胃潰瘍模型。每組大鼠DiR 給藥量為5 mg/kg，ig 體積均為2 mL。利用動物熒光成像儀的IVIS 軟件進行熒光強度定量分析，分析每張照片的熒光強度。固定每張照片的熒光強度的最小值，利用Origin 9.0 軟件計算特定區(qū)域內(nèi)熒光的輪廓所覆蓋的面積和該區(qū)域內(nèi)的最大熒光強度值[16-17]。每組大鼠在ig 藥物后，分別于0、2、4、6 h 對大鼠活體DiR-EPC 分布進行成像分析。

2.2.3 熒光成像實驗結(jié)果 每組大鼠在進行ig 給藥及活體成像分析后，分別于0、2、4、6 h 將大鼠麻醉處死，取大鼠胃及其余全部消化道，隨后沿胃大彎切開，將胃內(nèi)殘留物用生理鹽水洗凈后鋪平，使用IVIS 成像技術(shù)對制劑消化道分布、制劑的胃內(nèi)分布進行熒光成像分析[18]。為確定Evo-PC-SMEDDS在病理狀態(tài)下的胃潰瘍的特異性分布，利用親脂性染料DiR 追蹤和顯示Evo-PC-SMEDDS 在大鼠體內(nèi)的位置[16]。

根據(jù)圖1 的動物活體熒光成像結(jié)果可知，在ig給藥0～6 h，DiR-EPC 在大鼠的胃部聚集，表明Evo-PC-SMEDDS 存在胃滯留效應(yīng)。Free-DiR 正常組的熒光強度由于受到胃排空效應(yīng)和復(fù)雜胃內(nèi)環(huán)境的影響，ig 給藥后，大鼠體內(nèi)的熒光強度逐漸衰減，而ig 給予DiR-EPC 的胃潰瘍模型大鼠胃內(nèi)的熒光保留強度高于Free-DiR 正常組和DiR-EPC 非潰瘍組，表明Evo-PC-SMEDDS 可能對胃潰瘍狀態(tài)下的局部病灶部位具有特異性滯留作用。

圖1 大鼠活體熒光強度分布 (n = 3)Fig.1 Fluorescence intensity distribution in vivo of rats(n = 3)

根據(jù)大鼠消化道熒光強度分布（圖2）可知，DiR-EPC＋M 組胃中熒光強度在整個消化道中最為明顯，而在小腸和結(jié)腸部位出現(xiàn)的熒光強度可忽略不計。且Free-DiR 組和DiR-EPC 非潰瘍組受胃排空效應(yīng)的干擾，熒光強度較弱，且隨時間向下消化道移動，胃部滯留性弱。Evo-PC-SMEDDS 即使在胃排空作用和胃蛋白酶降解作用下，仍能夠在胃中滯留較長時間，這有利于促進胃黏膜保護屏障黏膜修復(fù)和傷口愈合，起到胃黏膜保護作用。

圖2 給藥后6 h 后的大鼠消化道熒光強度分布 (n = 3)Fig.2 Distribution of fluorescence intensity in digestive tract of rats after 6 h administration (n = 3)

根據(jù)大鼠胃組織熒光強度分布（圖3）可知，在生理鹽水清洗胃內(nèi)容物后，仍能觀察到胃黏膜表層有明顯的熒光滯留，這可能是由于 Evo-PCSMEDDS 憑借的粒徑和負電荷優(yōu)勢在潰瘍暴露的胃黏膜層表面富集[17,19]。根據(jù)大鼠胃組織熒光強度定量分析結(jié)果（表1）可知，DiR-EPC＋M 組4 h的胃組織的熒光強度是Free-DiR 組的79 倍；DiREPC＋M 組6 h 時的胃組織的熒光強度是DiR-EPC組的9.3 倍；同樣證明了Evo-PC-SMEDDS 對胃潰瘍狀態(tài)局部病灶部位具有特異性滯留作用。通過動物活體熒光成像系統(tǒng)觀察，無論是在活體動物還是離體組織中均顯示，Evo-PC-SMEDDS 對胃潰瘍狀態(tài)局部病灶部位具有特異性滯留作用。

表1 胃組織熒光定量分析 (±s, n = 3)Table 1 Fluorescence quantitative analysis of gastric tissue(±s, n = 3)

表1 胃組織熒光定量分析 (±s, n = 3)Table 1 Fluorescence quantitative analysis of gastric tissue(±s, n = 3)

與相同時間Free-DiR 組比較：**P＜0.01；與相同時間DiR-EPC組比較：##P＜0.01；與同組4 h 時比較：ΔP＜0.05。**P < 0.01 vs Free-DiR group at the same time; ##P < 0.01 vs DiR-EPC group at the same time; ΔP < 0.05 vs same group 4 h.

組別輻射效率/(μW?cm?2)0 h 2 h 4 h 6 h Free-DiR 7.52×109 7.76×108 4.46×106 0 DiR-EPC 9.18×109 2.53×109** 8.05×108** 7.25×108**DiR-EPC＋M 2.55×1010 1.38×1010**## 1.74×1010**## 1.89×1010**##Δ

圖3 胃組織熒光分布 (n = 3)Fig.3 Fluorescence distribution in gastric tissue (n = 3)

2.3 Evo-PC-SMEDDS 胃黏膜層分布

2.3.1 FITC-EPC 的制備 FITC-EPC 的制備及操作方法與“2.2.1”項中DiR-EPC 的制備過程類似。

2.3.2 動物分組及給藥 設(shè)置3 只正常SD 大鼠為FITC-EPC 組，3 只胃潰瘍SD 大鼠為FITC-EPC＋M 組，2 組同時ig 相同劑量的FITC 標(biāo)記的Evo-PC-SMDDES。給藥2 h 后取大鼠胃竇部位進行冷凍切片，石蠟包埋處理，脫蠟后PBS 洗5 min；放入10% BSA 封閉1 h，PBS 漂洗5 min；加DAPI 核染3 min，漂洗后50%甘油封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。分別以激發(fā)光488 nm（觀察FITC 在518 nm的綠色熒光）和425 nm（觀察DAPI 在425 nm 的藍色熒光）在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。觀察時采用10 倍和40 倍物鏡，使用NIS 軟件進行圖像分析[20]。

2.3.3 激光共聚焦顯微鏡熒光成像結(jié)果 DAPI 可與DNA 結(jié)合，廣泛應(yīng)用于活細胞和固定細胞的染色，F(xiàn)ITC 為熒光染料，用于標(biāo)記Evo-PC-SMEDDS在胃黏膜內(nèi)的位置。2 種熒光信號相結(jié)合可以驗證Evo-PC-SMEDDS 是否可以在胃潰瘍處靶向聚集。

根據(jù)激光共聚焦顯微鏡熒光成像的實驗結(jié)果（圖4）顯示，在10 倍鏡下，F(xiàn)ITC-EPC 組正常大鼠的胃組織可以觀察到FITC-EPC 在胃上皮細胞外邊緣的黏液層分布較多，熒光強度較強，但在胃上皮細胞區(qū)域的熒光強度較弱，且胃黏膜組織表面的胃壁細胞的輪廓模糊；在40 倍鏡下，僅能觀察到FITCEPC 在胃上皮細胞中心區(qū)域有較弱的制劑熒光分布。這可能是因為正常大鼠胃組織的黏液層較厚，與上皮細胞連接緊密，黏液屏障一定程度上阻礙了Evo-PC-SMEDDS 進入胃上皮細胞。

圖4 Evo-PC-SMEDDS 在胃潰瘍組織中的分布Fig.4 Distribution of Evo-PC-SMEDDS in gastric ulcer tissue

FITC-EPC＋M 組在10 倍鏡下可明顯觀察到，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的Evo-PC-SMEDDS 納米粒子在外層黏液層和內(nèi)層胃上皮細胞中均有明顯分布；在40 倍鏡下可明顯觀察到潰瘍大鼠胃上皮細胞輪廓清晰，相較于FITC-EPC 組，制劑熒光在胃上皮細胞中分布更多，且熒光強度較高；亦可明顯觀察到FITC 標(biāo)記的Evo-PC-SMEDDS 細小納米粒子在胃壁膜內(nèi)及膜外呈現(xiàn)顆粒狀分布。推測其可能是由于乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍模型表層胃黏液層缺失，且在乙醇的刺激作用下，胃上皮細胞的連接變疏松，細胞間隙及細胞膜的流動性增加，直徑小于100 nm 的納米乳則更容易以簡單擴散或細胞胞吞的方式進入胃上皮細胞[17]。結(jié)果表明，Evo-PC-SMEDDS 對胃潰瘍狀態(tài)下的胃上皮組織具有更高的遞送效率。

2.4 Evo-PC-SMEDDS 對乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍保護作用的研究

2.4.1 分組、給藥與造模 實驗前60 只雄性SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，期間自由進食和飲水[21]。將大鼠隨機分為空白組、模型組、膠體果膠鉍組（493.7 mg/kg，CBP）、吳茱萸堿混懸液組（100 mg/kg，1%羧甲基纖維素鈉混懸液，Evo-S）、Evo-PC 組（100 mg/kg）、Evo-PC-SMEDDS 組（100 mg/kg），每組6只。各組ig 體積均為10 mL/kg?？瞻捉M和模型組大鼠ig 等體積生理鹽水，每天給藥1 次，其余各組大鼠分別ig 等體積藥物。連續(xù)給藥7 d 后，動物禁食24 h，禁水4 h，排除食物和胃排空效應(yīng)的干擾[22]。最后一次給藥2 h 后，除空白組，其余各組大鼠給予同體積75%乙醇ig造模，以形成大鼠胃潰瘍模型，造模劑量為5 mL/kg[23-24]。

2.4.2 胃潰瘍形態(tài)學(xué)評價 如圖5 所示，大鼠乙醇ig 造模后，解剖時發(fā)現(xiàn)，模型組的大鼠胃腸脹氣嚴重，個別脹氣程度較重的胃壁明顯變薄，部分出血嚴重，胃體顏色瘀紫。各給藥組的大鼠脹氣程度有所減輕，胃內(nèi)表面出血情況較輕?？瞻捉M大鼠胃黏膜完好，色澤勻凈，無水腫，無出血點，而模型組的大鼠胃損傷程度嚴重，黏膜呈現(xiàn)出血、糜爛、充血、水腫以及形態(tài)改變，損傷部位出血呈現(xiàn)明顯的塊狀、線狀分布，嚴重者接連成片。各給藥組與模型組相比，大鼠胃潰瘍情況均有減輕，胃潰瘍損傷主要呈條狀和點狀、偶有塊狀；其中 Evo-PCSMEDDS 組胃損傷部位最少，胃黏膜表層完整無損傷，幾乎無塊狀出血，潰瘍部位僅零星分布。結(jié)果表明，Evo-PC-SMEDDS 預(yù)保護可以有效減輕胃潰瘍。這可能與Evo-PC-SMEDDS 中油酸乙酯和磷脂具有良好的生物相容性有關(guān)；油酸乙酯可增強胃黏膜層的流動性，減輕了乙醇對胃黏膜層的侵蝕；磷脂與防御和修復(fù)屏障-黏液/碳酸氫鹽層成分相似相容，提高了胃黏膜保護屏障的結(jié)構(gòu)剛性[25]。

圖5 各組大鼠胃潰瘍組織圖Fig.5 Histopathology of rat gastric ulcer in each group

2.4.3 胃潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率評估 根據(jù)參考文獻中的“Guth”標(biāo)準(zhǔn)[26]，對大鼠的胃潰瘍指數(shù)和潰瘍抑制率進行計算，并對各組大鼠胃潰瘍情況進行量化評分，利用光學(xué)相機觀察各組大鼠胃組織病理形態(tài)，并用微距鏡頭拍照記錄胃黏膜表面的損傷情況，以游標(biāo)卡尺測定潰瘍病灶長度和寬度，計算潰瘍指數(shù)。評估標(biāo)準(zhǔn)如表2 所示，病灶寬度[0，1] mm計為1 分，寬度(1，2] mm 計2 分，寬度(2，3] mm計3 分，寬度(3，4] mm 計4 分，病灶寬度＞4 mm計為5 分；如果病灶寬度≤2 mm，按上述方法記分；當(dāng)病灶發(fā)生穿孔且寬度＞2 mm 時，加倍計分。

表2 胃潰瘍指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Gastric ulcer index scoring criteria

以胃潰瘍指數(shù)評價胃潰瘍的程度，潰瘍抑制率（ulcer inhibition rate，UIR）表示某種治療藥物對潰瘍或黏膜損傷的修復(fù)效果，抑制率越高，則說明藥物的保護效果越好[27]。胃潰瘍抑制率（gastric ulcer inhibition rate，UIR）計算公式如下。

UIR＝(模型組的潰瘍指數(shù)－預(yù)防給藥組的潰瘍指數(shù))/模型的潰瘍指數(shù)

評估結(jié)果表3 所示。與正常組相比，模型組胃潰瘍指數(shù)顯著升高（P＜0.01），提示胃潰瘍造模成功。各給藥組與模型組相比，各給藥組的胃潰瘍指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。其中Evo-PC-SMEDDS 組的胃潰瘍指數(shù)最低，且相較于陽性藥物組，潰瘍指數(shù)也有明顯降低（P＜0.05）。

表3 各組大鼠胃潰瘍指數(shù)和胃潰瘍抑制率的情況(±s, n = 6)Table 3 Gastric ulcer index and gastric ulcer inhibition rate of rats in each group (±s , n = 6)

表3 各組大鼠胃潰瘍指數(shù)和胃潰瘍抑制率的情況(±s, n = 6)Table 3 Gastric ulcer index and gastric ulcer inhibition rate of rats in each group (±s , n = 6)

與空白組比較：ΔP＜0.05 ΔΔP＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05**P＜0.01；與CBP 組比較：#P＜0.05。ΔP < 0.05 ΔΔP < 0.01 vs blank group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs model group; #P < 0.05 vs CBP group.

組別 給藥劑量/(mg?kg?1) 潰瘍指數(shù) 潰瘍抑制率/%空白 ? ? ?模型 ? 61.20±5.40ΔΔ ?Evo-S 100 38.20±2.10* 37.58*CBP 498 23.87±1.90** 61.14**Evo-PC 100 25.55±4.20** 58.25**Evo-PC-SMEDDS 100 18.48±2.90**# 70.49**#

表3 結(jié)果提示，各組給藥對乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍均具有一定的保護作用。其中，與陽性藥物組相比，Evo-PC-SMEDDS 胃潰瘍抑制效果更加明顯（P＜0.05），抗胃潰瘍藥效在所有組中最佳。結(jié)果表明，Evo-PC-SMEDDS 對乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍具有良好的保護作用，這可能與納米級自微乳的分散度高，與潰瘍部位接觸面積大有關(guān)。此外，磷脂也具有修復(fù)胃黏膜損傷的功能，這可能進一步增強了胃黏膜保護的效果[27]。

2.4.4 胃潰瘍病理學(xué)評估 大鼠胃組織HE 染色病理如圖6 所示，空白組大鼠的胃黏膜平整，表面光滑，有大量胃腺的開口，胃表面可見完整的胃小凹。上皮細胞排列整齊完好，無黏膜缺損，組織各層分界清楚，未見炎性細胞浸潤。模型組大鼠胃黏膜破損嚴重，凹凸不平，出血點明顯甚至可見片狀瘀斑，表面可見火山口樣損傷，胃小凹消失，腺體結(jié)構(gòu)紊亂，組織黏膜各層松散，有明顯的表層上皮細胞脫落、壞死，炎性細胞浸潤，黏膜下水腫，結(jié)構(gòu)變寬，血管擴張充血，血細胞溢出至胃黏膜各層。與模型組相比，各給藥組大鼠胃黏膜病理損傷得到明顯改善，大鼠胃黏膜上皮細胞排列更整齊，黏膜缺損減少，黏膜下水腫也相對減輕。其中CBP 組較模型組胃黏膜上皮細胞相對排列整齊，缺損撕裂脫落情況減少，但有明顯的火山口樣損傷和大片狀出血瘀斑，炎性細胞浸潤雖有所減少但仍明顯，損傷大多局限于黏膜表層。吳茱萸堿組出現(xiàn)胃黏膜相關(guān)損傷如出血、黏膜水腫和炎性細胞浸潤等也可明顯觀察到，但較模型組稍有減弱。Evo-PC 組出現(xiàn)胃黏膜情況和特征陽性藥組相似，僅少量壁細胞壞死，病變程度也較輕。Evo-PC-SMEDDS 組的黏膜下血細胞溢出最少，僅見零星血細胞，胃黏膜表面有黏液層保護，黏膜表面基本完整，炎性細胞較少，呈散亂分布，以淋巴細胞為主，黏膜下層水腫最輕，血管輕微擴張，損傷僅局限于黏膜上皮層和固有層，接近正常大鼠的胃黏膜層情況。實驗結(jié)果表明，Evo-PCSMEDDS 通過抑制炎癥聚集和減輕黏膜下?lián)p傷抑制乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍。

圖6 各組大鼠胃黏膜組織病理變化 (HE, ×200)Fig.6 Histopathological changes of gastric mucosa of rats in each group (HE, × 200)

2.4.5 胃分泌物的測定 采用pH 計測定胃液的pH值，將采集的胃液置于離心機，以4 000 r/min 離心10 min，收集上清液，平行測定3 份。測定總游離酸度采用酸堿滴定法總原理：加入適量托弗氏酚酞指示劑，若顯色為紅色，則含有未反應(yīng)游離H+；若顯色為黃色，則無游離H+，反應(yīng)完全。取澄清胃液2 mL 置三角燒瓶中，用滴定管慢慢用0.02 mol/L 的NaOH 滴定，同時不斷搖動，至紅色消失，出現(xiàn)姜黃色為止，即為游離酸滴定終點，記錄消耗NaOH溶液的總體積。胃液總酸度計算公式如下。

總酸度＝氫氧化鈉溶液的體積×氫氧化鈉濃度×1 000

胃液酸度檢測結(jié)果如表4 所示，胃潰瘍模型大鼠胃液酸度明顯低于空白組大鼠（P＜0.05），表明乙醇誘導(dǎo)的潰瘍大鼠胃黏膜H+的釋放明顯增加，胃液呈強酸性。與模型組比較，給予的CBP、Evo-PC和Evo-PC-SMEDDS 預(yù)保護的胃潰瘍大鼠胃液pH值均顯著升高（P＜0.01）；其中Evo-PC-SMEDDS組胃液pH 值更加接近中性。結(jié)果表明，CBP、Evo-PC和Evo-PC-SMEDDS 可抑制或中和胃潰瘍大鼠胃酸，降低胃液酸性。

表4 各組大鼠分泌胃液各項指標(biāo) (±s, n = 6)Table 4 Various indexes of gastric juice secretion of rats in each group (±s , n = 6)

表4 各組大鼠分泌胃液各項指標(biāo) (±s, n = 6)Table 4 Various indexes of gastric juice secretion of rats in each group (±s , n = 6)

與空白組比較：ΔP＜0.05 ΔΔP＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05**P＜0.01；與CBP 組比較：#P＜0.05。ΔP < 0.05 ΔΔP < 0.01 vs blank group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs model group; #P < 0.05 vs CBP group.

組別 胃液pH 值 胃蛋白酶活性/(U?mL?1)總游離酸度/(mEq?L?1)空白 4.86±0.78 0.40±0.11 1.23±1.60模型 3.67±1.34Δ 1.20±0.40ΔΔ 3.62±0.70Δ Evo-S 4.52±1.64 0.66±0.34* 1.62±1.78 CBP 4.90±0.94** 0.80±0.20 1.47±0.21**Evo-PC 5.79±0.36** 0.51±0.19**# 1.40±0.19**Evo-PC-SMEDDS 6.19±0.20** 0.48±1.03**# 1.31±0.25**

胃蛋白酶活性測定采用改良“Mett 氏”法[25]。將12 cm 長，內(nèi)徑l mm 毛細玻璃管洗凈烤干。將上述毛細玻璃管置于新鮮蛋清液中，利用虹吸作用，灌滿至管內(nèi)無氣泡，放在85 ℃熱水中使蛋白凝固，冷卻后，將制好的蛋白管裁成4 cm 長，用石蠟將其兩端封固，置冰箱中備用。取胃液1 mL 放于50 mL的三角燒瓶中，加0.05 mol/L 鹽酸溶液15 mL 搖勻，放進2 根蛋白管中，塞好瓶口，在37 ℃恒溫水浴裝置中孵育24 h，取出蛋白管，用游標(biāo)卡尺測量蛋白管兩端透明部分的長度，以四端之值求其平均值。胃蛋白酶活性計算公式如下。

胃蛋白酶活性＝蛋白管兩端透明部分長度平均值2×16

胃蛋白酶檢測結(jié)果（表4）顯示，與空白組相比，模型大鼠胃液中胃蛋白酶活性明顯增加（P＜0.01），表明乙醇誘導(dǎo)模型大鼠的胃蛋白酶分泌增加。與模型組比較，給予的CBP、Evo-PC 和Evo-PCSMEDDS 預(yù)保護的胃潰瘍大鼠胃蛋白活性均明顯降低（P＜0.01），提示Evo-PC-SMEDDS 可通過降低胃液中胃蛋白酶活性保護胃黏膜。結(jié)果表明，Evo-PC-SMEDDS 通過中和胃潰瘍大鼠H+釋放，抑制胃蛋白活性來緩解乙醇誘導(dǎo)大鼠胃潰瘍損傷。

2.4.6 氧化應(yīng)激相關(guān)因子測定 各項指標(biāo)均使用試劑盒按照說明書進行相應(yīng)檢測。大鼠胃潰瘍組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果如表5 所示，與空白組相比，模型組大鼠GSH、CAT 和SOD 水平降低，MDA、NO 和MPO 含量顯著增加（P＜0.01），表明乙醇ig造模后大鼠胃部出現(xiàn)氧化應(yīng)激現(xiàn)象。與模型組大鼠相比，Evo-S 組、CBP 組、Evo-PC 組和Evo-PCSMEDDS 組預(yù)保護后大鼠胃部MDA 含量顯著降低（P＜0.01），且Evo-PC-SMEDDS 相較于其他組對過氧化脂質(zhì)產(chǎn)物MDA 具有更強的回調(diào)能力。

表5 各組大鼠胃組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的情況 (±s, n = 6)Table 5 Indexes of oxidative stress in gastric tissue of rats in each group (±s , n = 6)

表5 各組大鼠胃組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的情況 (±s, n = 6)Table 5 Indexes of oxidative stress in gastric tissue of rats in each group (±s , n = 6)

與空白組比較：ΔΔP＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與CBP 組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01。ΔP < 0.05 ΔΔP < 0.01 vs blank group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs model group; #P < 0.05 ##P < 0.01 vs CBP group.

組別 MDA/(nmol?mL?1) MPO/(nmol?mL?1) NO/(U?mL?1) SOD/(U?mL?1) GSH/(μmol?g?1 protein) CAT/(U?mL?1)空白 3.76±0.62 3.54±0.17 1.78±0.25 386.43±46.51 42.78±3.68 3.68±0.30模型 13.65±1.39ΔΔ 0.85±0.33ΔΔ 3.86±0.71ΔΔ 156.87±49.46ΔΔ 20.85±3.57ΔΔ 0.96±0.37ΔΔ CBP 10.26±0.45** 0.74±0.23 2.94±0.24 185.59±39.17* 27.91±1.93 1.31±0.48 Evo-S 9.73±0.98** 0.57±0.25 2.25±0.24 306.00±24.18 28.18±1.61 1.45±0.34 Evo-PC 6.08±1.30** 0.42±0.13* 2.06±0.56 286.80±18.41 35.84±3.50 1.40±0.43 Evo-PC-SMEDDS 5.07±0.30**# 0.62±0.14** 1.84±0.49** 330.12±31.02** 37.81±1.40** 2.35±0.20**##

與模型組大鼠相比，Evo-PC-SMEDDS 預(yù)處理后大鼠胃部MPO 和NO 含量顯著降低（P＜0.01），說明Evo-PC-SMEDDS 能明顯改善炎癥因子和炎性細胞浸潤造成的胃組織氧化損傷。Evo-PC-SMEDDS處理后大鼠胃SOD 和CAT 活力增加，且大鼠胃MDA 含量顯著降低（P＜0.01）。與吳茱萸堿原料藥組相比，Evo-PC-SMEDDS 給藥后胃組織中GSH 水平顯著提高，Evo-PC-SMEDDS 組SOD 活力更強，且MDA 含量更低。結(jié)果表明Evo-PC-SMEDDS 具有提高吳茱萸堿原料藥抑制乙醇誘導(dǎo)大鼠胃組織處氧化應(yīng)激損傷的能力。

3 討論

吳茱萸堿具有鎮(zhèn)痛抗炎、抗菌、抗胃潰瘍、保護胃黏膜等多重藥理活性，但由于水溶性極差、口服生物利用度低，限制了其在臨床中的應(yīng)用。SMEDDS 是由油相、乳化劑和助乳化劑組成的液體制劑，具有良好的黏膜滲透性和生物相容性，可以在一定程度上改善藥物的溶解性，提高藥物的生物利用度。本課題組在前期實驗中確定了Evo-PCSMEDDS 的最佳制備條件，并對制得的藥物表征及體外胃黏膜滲透性進行了評價，發(fā)現(xiàn)其在體外較原藥具有更強的胃黏膜滲透能力。

在課題組前期研究基礎(chǔ)上，本研究進一步應(yīng)用熒光成像技術(shù)與激光共聚焦技術(shù)，從體內(nèi)維度以及動物整體和器官分布不同水平探究了該制劑的胃潰瘍靶向性。結(jié)果表明，Evo-PC-SMEDDS 對乙醇導(dǎo)致的胃潰瘍具有明顯的靶向遞送性，并以胃潰瘍靶向方式實現(xiàn)了吳茱萸堿在潰瘍氧化應(yīng)激損傷部位的靶向聚集。推測是由于其在胃潰瘍處發(fā)生了EPR 效應(yīng)，從而形成了靶向聚集。藥效學(xué)結(jié)果表明Evo-PCSMEDDS 對乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍具有一定的預(yù)防性保護作用，并增強了吳茱萸堿的胃黏膜保護作用。

目前構(gòu)建大鼠胃潰瘍模型的方法主要有非損傷應(yīng)激性胃潰瘍模型、損傷應(yīng)激性胃潰瘍模型、藥物胃潰瘍模型、乙醇胃潰瘍模型、幽門結(jié)扎型大鼠胃潰瘍模型等[28]。其中，乙醇胃潰瘍模型的潰瘍外形、組織學(xué)特點、愈合和復(fù)發(fā)過程與人胃黏膜損傷類似，且制作方便，重復(fù)性好。因此本實驗選用乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍模型。

有報道指出[29]，胃潰瘍常發(fā)生在暴露于攻擊性因素（例如酸和胃蛋白酶）的胃黏膜處，這種暴露可能是由于胃粘膜中的破壞因子與防御因子的不平衡造成的。保護因素包括碳酸氫鹽和前列腺素的分泌，抗氧化劑水平的提高和低水平的NO。研究表明[30]，脂質(zhì)過氧化和MDA 升高與乙醇誘發(fā)的大鼠胃潰瘍有關(guān)。有研究表明[31]，吳茱萸堿與姜黃素制備的納米乳（EJPCN）可通過提高胃粘膜中SOD 含量，降低MDA 含量來減少氧化應(yīng)激，以及降低促炎性細胞因子（IL-6、TNF-α）水平，提高抗炎因子IL-4 水平發(fā)揮胃黏膜保護作用。

由此，推測Evo-PC-SMEDDS 發(fā)揮改善胃潰瘍及胃黏膜保護作用的機制一方面是通過提高胃黏膜中SOD、CAT 以及GSH 含量，降低胃黏膜MDA含量來減少氧化應(yīng)激；另一方面是通過抑制胃酸以及胃蛋白酶分泌，抑制NO、MPO 炎癥信號因子水平來減少炎性細胞浸潤。

綜上所述，本研究證明了Evo-PC-SMEDDS 具備較好的胃潰瘍靶向能力，且對胃潰瘍有較為良好的治療效果，為其日后可能的開發(fā)與應(yīng)用提供了一定的數(shù)據(jù)支撐，為驗證藥物的胃潰瘍靶向能力的實驗設(shè)計提供了較為全面的參考方案。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突