張榮，古麗吉合熱·阿布拉

新疆第二醫(yī)學(xué)院（克拉瑪依 834000）

黑枸杞（Lycium ruthenicum）是枸杞屬（Lycium）茄科（Solanceae）的多年灌木野生荒漠植物，果實(shí)成熟呈近卵球形，為藍(lán)紫色，有淡淡的甜味，屬平性藥物，能夠清熱解毒，擁有非常良好的藥用價(jià)值和食用價(jià)值[1]。黑枸杞主要在月經(jīng)不調(diào)、增強(qiáng)免疫功能、延緩肌體衰老等方面有顯著作用[2]。黑枸杞果實(shí)含有多糖、總黃酮、蛋白質(zhì)等[3-4]多種天然活性的營(yíng)養(yǎng)成分，其中原花青素的含量遠(yuǎn)高于其他天然植物，是最有效的天然抗氧化劑[5-9]。黑枸杞作為提取原花青素的理想植物，具有廣闊的應(yīng)用空間[10]。

20世紀(jì)50年代，法國(guó)科學(xué)家Jacque Masqulier首次從松樹皮中提取原花青素，之后原花青素被發(fā)現(xiàn)更多來源，并得到廣泛的研究和利用[11]。原花青素作為天然強(qiáng)有效的自由基清除劑，能有效清除OH-，O2-、NO-、DPPH等多種自由基，具有舒張血管、降糖、降血脂[12-16]、抑制腎功能和腸功能障礙、提高記憶力、抗肥胖、美白等保健食療作用[17-20]。原花青素分子結(jié)構(gòu)中含有不對(duì)稱的碳原子，具有旋光性；分子帶有多個(gè)酚羥基，極性較強(qiáng)，易溶于水、乙醇、甲醇等，不溶于乙醚、氯仿、苯等有機(jī)溶劑；分子中存在苯環(huán)結(jié)構(gòu)，在紫外光區(qū)吸收較強(qiáng)[21-22]。

原花青素具有很好的藥理作用，獲得原花青素的提取工藝就顯得尤為重要。故試驗(yàn)探究黑枸杞原花青素最優(yōu)提取工藝，并分別考察黑枸杞原花青素提取物對(duì)DPPH自由基清除作用、OH-自由基清除作用、總還原能力，以期為黑枸杞原花青素進(jìn)一步研究奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（98%，北京索萊寶科技有限公司）；NaOH（分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)試劑有限公司）；NaNO2、硝酸鋁（分析純，天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司）；無水乙醇（分析純，天津市鑫鉑特化工有限公司）；蒸餾水（實(shí)驗(yàn)室自制）；黑枸杞（新疆阿克蘇）；DPPH（分析純，Solarbio）；磷酸鹽緩沖溶液（分析純，Biosharp）；鐵氰化鉀（分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)試劑有限公司）；三氯乙酸（分析純，上海山蒲化工有限公司）；FeCl3、30%過氧化氫（分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)試劑有限公司）；FeSO4（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；水楊酸（分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)試劑有限公司）；抗壞血酸（分析純，天津市天新精細(xì)化工有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)（UV1801G，天津冠澤科技有限公司）；電子天平（YP202N，上海菁海儀器有限公司）；超聲儀（KQ3200DE，昆山市超聲儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）。

1.3 研究方法

1.3.1 原花青素含量的測(cè)定

1.3.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精確稱取5 mg干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯，加入少量的無水乙醇溶解，加入蒸餾水定容至25 mL容量瓶中，搖勻，配成0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.1.2 原花青素吸收峰確定

取一定量0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液于25 mL容量瓶中，加入0.4 mL 5%亞硝酸鈉，放置6 min后，加0.4 mL 10%硝酸鋁，放置6 min，加4 mL 4%氫氧化鈉，加蒸餾水至刻度搖勻，放置15 min，得顯色液。配成的顯色液使用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，并使之吸光度（A）在0.2～0.8范圍內(nèi)。確定在510 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。

1.3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液于25 mL容量瓶中，依次加入0.4 mL 5%亞硝酸鈉，0.4 mL 10%硝酸鋁，加各溶液后要放置6 min，加4 mL 4%氫氧化鈉，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，放置15 min，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，以對(duì)照品溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，根據(jù)文獻(xiàn)[22-23]藍(lán)莓花青素的提取工藝并稍作修改。

1.3.2 黑枸杞原花青素的提取

將黑枸杞粉碎，過0.250 mm（60目）篩，稱取2.0 g于圓底燒瓶中，按一定超聲提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)處理，待提取液冷卻后過濾，將提取液置于容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度后，配成供試品溶液。取1.0 mL按1.3.1.2項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度，帶入回歸方程計(jì)算原花青素濃度，按照式（1）計(jì)算其得率。

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1.1 不同提取時(shí)間對(duì)原花青素得率的影響

稱取5份2.0 g過0.250 mm（60目）篩的黑枸杞粉末，分別置于圓底燒瓶中，使用70%乙醇作為溶劑在提取溫度60 ℃下，用超聲儀測(cè)定提取時(shí)間15，30，60，90和120 min對(duì)黑枸杞原花青素得率的影響。

1.3.2.1.2 不同提取溫度對(duì)原花青素得率的影響

稱取5份2.0 g過0.250 mm（60目）篩的黑枸杞粉末，分別置于圓底燒瓶中，使用70%乙醇作為溶劑在提取時(shí)間60 min下，用超聲儀測(cè)定提取溫度30，40，50，60和70 ℃對(duì)黑枸杞原花青素得率的影響。

1.3.2.1.3 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素得率的影響

稱取5份2.0 g過0.250 mm（60目）的黑枸杞粉末，分別置于圓底燒瓶中，使用70%乙醇作為溶劑在提取時(shí)間60 min下，用超聲儀測(cè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)10%，30%，50%，70%和95%對(duì)黑枸杞原花青素得率的影響。

1.3.2.2 正交試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)，篩選出最佳提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)，并分別選取最佳條件的前后1組條件進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)。

1.3.3 黑枸杞原花青素的抗氧化活性試驗(yàn)

1.3.3.1 黑枸杞原花青素對(duì)DPPH自由基的清除作用

參考張欣[24]采用DPPH自由基清除率法，精密稱取4.4 mg DPPH，使用70%乙醇溶解并定容至100 mL，得到0.04 mg/mL的DPPH溶液。將黑枸杞原花青素提取物分別配制成0.002，0.004，0.006，0.008和0.010 mg/mL系列濃度。分別取2 mL不同質(zhì)量濃度的待測(cè)液，加2 mL DPPH溶液，在室溫下反應(yīng)30 min后于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度，此處吸光度為A1。取2 mL DPPH溶液和2 mL 70%乙醇在室溫下反應(yīng)30 min后于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度，此處吸光度為A0。分別取2 mL不同質(zhì)量濃度的待測(cè)液，加2 mL 70%乙醇，在室溫下反應(yīng)30 min后于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度，此處吸光度為A2。以維生素C對(duì)照品為陽性對(duì)照，按式（2）計(jì)算清除率。

1.3.3.2 黑枸杞原花青素對(duì)OH-自由基的清除作用

參考閆莉莉等[25]采用的OH-自由基清除率法，將黑枸杞原花青素提取物，分別配制成0.002，0.004，0.006，0.008和0.010 mg/mL系列濃度。分別取1 mL不同質(zhì)量濃度的待測(cè)液，加6 mmol/L FeSO4溶液和6 mmol/L H2O2溶液各2 mL，混勻，加入3.0 mL 6.0 mmol/L水楊酸，搖勻，于37 ℃水浴加熱30 min，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，此處吸光度為Ax。取1 mL蒸餾水，其中加6 mmol/L FeSO4溶液和6 mmol/L H2O2溶液各2 mL混勻，加入3.0 mL 6.0 mmol/L水楊酸，搖勻，于37 ℃水浴加熱30 min，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，此處吸光度為A0。以維生素C對(duì)照品為陽性對(duì)照，按式（3）計(jì)算清除率。

1.3.3.3 黑枸杞原花青素的總還原能力

將原花青素提取物分別配制成0.002，0.004，0.006，0.008和0.010 mg/mL系列濃度。分別取1 mL不同質(zhì)量濃度的待測(cè)液，加6 mmol/L FeSO4溶液和6 mmol/L H2O2溶液各2 mL，混勻，加入3.0 mL 6.0 mmol/L水楊酸，搖勻，于37 ℃水浴加熱30 min，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸光度，此處吸光度為Ax。取1 mL蒸餾水，其中加6 mmol/L FeSO4溶液和6 mmol/L H2O2溶液各2 mL，混勻，加入3.0 mL 6.0 mmol/L水楊酸，搖勻，于37 ℃水浴加熱30 min，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，此處吸光度為A0。測(cè)定的樣品吸光度越大，表示樣品的總還原能力越強(qiáng)，以維生素C對(duì)照品為陽性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=10.742x+0.004 1（R2=0.999 6），在0.008～0.05 mg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 黑枸杞原花青素的提取試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.11 不同提取時(shí)間對(duì)原花青素得率的影響

由圖2可知，原花青素得率呈現(xiàn)先上升再下降的變化趨勢(shì)。在曲線頂部，即提取時(shí)間60 min處有最佳得率，為2.79%。時(shí)間大于60 min后，黑枸杞原花青素得率緩慢下降，故單因素試驗(yàn)選擇提取時(shí)間60 min。

圖2 不同提取時(shí)間對(duì)原花青素得率的影響

2.2.12 不同提取溫度對(duì)原花青素得率的影響

由圖3可得知，黑枸杞原花青素得率的曲線趨勢(shì)與時(shí)間單因素曲線相近，也呈現(xiàn)先上升再徐徐下降趨勢(shì)，其原花青素得率2.70%。故單因素試驗(yàn)選擇提取溫度60 ℃。

圖3 不同提取溫度對(duì)原花青素得率的影響

2.2.13 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素得率的影響

由圖4可知，原花青素得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，原花青素最佳得率為2.76%。故單因素試驗(yàn)提取選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)70%。

圖4 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素得率的影響

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以原花青素得率為指標(biāo)，選取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量，設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)表（表1），結(jié)合正交表的條件進(jìn)行試驗(yàn)，以確定黑枸杞原花青素的最佳提取工藝。

表1 正交設(shè)計(jì)因素水平

表2結(jié)果能展現(xiàn)黑枸杞原花青素得率的影響因子大小，即提取乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）＞提取時(shí)間（A）＞溫度（B）。正交表優(yōu)選的工藝為A2B2C2或A3B2C2，且提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑枸杞原花青素的提取率影響較為明顯。

表2 正交分布結(jié)果表

故綜合所有結(jié)果，按照最優(yōu)工藝A2B2C2，即提取時(shí)間60 mim、溫度60 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得原花青素的得率為2.72%，與單因素試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

2.3 黑枸杞原花青素的抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 黑枸杞原花青素對(duì)DPPH自由基的清除作用

由圖5可知，黑枸杞原花青素對(duì)DPPH自由基的清除率與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，隨著質(zhì)量濃度不斷增大，清除率隨之增大，且高于相同質(zhì)量濃度下維生素C的清除率，說明黑枸杞原花青素具有良好的抗氧化能力。

圖5 黑枸杞原花青素對(duì)DPPH自由基的清除作用

2.3.2 黑枸杞原花青素對(duì)OH-自由基的清除作用

由圖6可知，原花青素清除率隨著質(zhì)量濃度增加呈現(xiàn)直線上升趨勢(shì)，原花青素清除率高于相同質(zhì)量濃度下維生素C的清除率，表明原花青素是一種有效的自由基清除劑。

圖6 黑枸杞原花青素OH-自由基清除率作用

2.3.3 黑枸杞原花青素的總還原能力測(cè)定

由圖7可知，原花青素與維生素C具有明顯差異，并且吸光度呈隨著質(zhì)量濃度升高而增大趨勢(shì)，相同質(zhì)量濃度下原花青素的總還原能力高于維生素C的，表明原花青素具備較好的總還原能力。

圖7 黑枸杞原花青素總還原能力

3 結(jié)論

通過提取工藝優(yōu)化得出黑枸杞原花青素最佳提取條件：時(shí)間60 min、溫度60 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，原花青素得率為2.72%。原花青素得率受乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響最大。黑枸杞原花青素具有對(duì)DPPH、OH-自由基的清除作用，具有還原能力，結(jié)果表明原花青素的抗氧化能力與質(zhì)量濃度有關(guān)系，而且高于相同質(zhì)量濃度下維生素C。說明黑枸杞原花青素具有良好的抗氧化能力。試驗(yàn)結(jié)果為黑枸杞原花青素進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，為從黑枸杞中分離抗氧化活性成分和開發(fā)天然抗氧化劑提供一定依據(jù)，也為進(jìn)一步深入研究開發(fā)和利用新疆黑枸杞資源提供理論參考。