陳聰慧,段春輝,楊欣雨,夏 翠,郭云霞,紀守坤,嚴 慧,劉月琴,張英杰

(河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院, 保定 071000)

動物在流動、轉(zhuǎn)群、屠宰過程中不可避免要經(jīng)歷運輸應激[1],運輸應激是多種應激原共同作用的結果,包括運輸前抓捕、裝車,運輸過程中溫濕度和環(huán)境變化等。研究表明,運輸應激會導致動物呼吸急促、心跳加速、驚懼不安,隨著機體水分及營養(yǎng)物質(zhì)的大量流失,內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂、免疫功能下降,易引起各種呼吸性及消化性疾病,不同程度地影響畜禽的生產(chǎn)性能和經(jīng)濟效益[2-3]。因此,探索運輸應激影響動物健康及代謝的機制,對運輸應激的緩解及防治具有重要的生產(chǎn)意義。動物在運輸過程中為了適應應激帶來的不利影響,機體能量代謝加強,無氧糖酵解及脂質(zhì)過氧化等反應加劇[4]。機體維持能量動態(tài)平衡的同時積累了大量代謝產(chǎn)物,肌肉中乳酸的累積使肉品質(zhì)劣化[5]。研究表明,腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK)在畜禽宰后肌肉糖酵解過程中起重要調(diào)節(jié)作用[6]。AMPK是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關鍵分子,也是影響肌肉纖維類型轉(zhuǎn)化的主要信號轉(zhuǎn)導途徑,可調(diào)節(jié)細胞能量水平[7]。AMPK可通過調(diào)節(jié)肌肉中的乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase, ACC)/丙二酰輔酶A肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(carnitine palmitoyl transferase 1, CPT)途徑,影響脂肪酸代謝[8]。因運輸而引發(fā)的應激性疾病嚴重損害了羊肉品質(zhì)及養(yǎng)殖場經(jīng)濟效益,運輸應激已變成養(yǎng)羊業(yè)迅速發(fā)展過程中迫切需要解決的生產(chǎn)問題。揭示運輸應激影響糖酵解的機制是減緩應激、改善肉質(zhì)、提高動物福利和經(jīng)濟效益的關鍵,目前關于羊的運輸應激機制研究較少。本試驗擬研究運輸后羔羊肌肉糖酵解及能量代謝水平的變化規(guī)律及不同干預方式對能量代謝的影響,為緩解羔羊運輸應激、改善羊肉品質(zhì)、提高動物福利提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及管理

本試驗于2021年6月1日—2021年6月30日在張家口蘭海畜牧養(yǎng)殖有限公司進行。試驗前對圈舍、飼養(yǎng)工具等進行徹底消毒。選用體況良好、健康無病、4月齡、平均體重為(19.06±0.76) kg的湖羊公羔60只,所有試驗羊均在同一棟舍內(nèi)。由羊場提供基礎飼糧,每日7:00和17:00飼喂2次,保證每日所有羔羊的料槽中均有剩料,飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 全混合日糧(Total Mixed Rations; TMR)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)Table 1 TMR diet composition and nutrient levels(DM basis) %

1.2 試驗設計

60只羔羊隨機分為3組,每組20只,每組5個重復,運輸當天記為試驗第0天,在第0、7、14天每組每個重復中任選1只羔羊,每組共5只進行屠宰。對照組飼喂基礎飼糧,電解多維組于運輸前2 d至運輸后7 d在飼糧中給每只羔羊添加電解多維375 mg·d-1,新霉素組于第0～7天在飼糧中給每只羔羊添加200 mg·d-1新霉素進行治療。飼喂前先將電解多維粉和新霉素粉充分混合少量飼糧后,確保添加物被每只羔羊完全攝入,再自由采食基礎飼糧。各組羔羊分群飼養(yǎng)。電解多維主要成分及含量見表2。

試驗羔羊于2021年6月8日09:00—17:00經(jīng)歷8 h運輸:采用三層半掛車裝載,車廂長13 m,寬2.55 m,高4 m,車廂內(nèi)無間隔,沒有進行栓系等任何措施。運輸距離約為350 km,運輸途中禁食禁水,運輸結束回圈舍12 h內(nèi)僅提供飲水。

運輸后第0、7、14天每重復分別隨機挑選1只羔羊(每處理組5只)屠宰,宰前24 h禁食,2 h禁水。取右胴體背最長肌置于凍存管并標注,置于-80 ℃貯存。

1.3 檢測指標

1.3.1 糖酵解潛力(glycolysis potential; GP) 準確稱取肌肉組織并按重量(g)∶體積(mL)=1∶10比例加入預冷的生理鹽水,高速研磨后置于離心管中,2500 r·min-1,離心10 min,取上清液并用生理鹽水5倍稀釋。

采用酶聯(lián)免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測肌肉中AMPK活性。根據(jù)Monin和Sellier[9]的方法,測定肉中糖原、游離葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸(glucose 6-phosphate, G-6-P)及乳酸(lactic acid, LA)的含量,按如下公式計算肌肉GP:

糖酵解潛力(μmol·g-1)=2×[糖原含量(μmol·g-1)+游離葡萄糖含量(μmol·g-1)+G-6-P含量(μmol·g-1)]+LA含量(μmol·g-1)。

1.3.2 糖酵解酶活測定 肌酸激酶(creatine kinase, CK)、己糖激酶(hexokinase, HK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)采用生化方法檢測,試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3.3 基因及蛋白表達

1.3.3.1 引物設計:以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參基因,參照GenBank中肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)、AMPKα1、AMPKα2、脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FAS)、CPT-1、ACC、GAPDH基因的mRNA序列,運用Primer 6.0軟件設計特異性引物送至北京六合華大基因科技有限公司合成,見表3。

表3 用于實時熒光定量PCR的引物序列Table 3 Nucleotide sequences of specific primers for real-time quantitative PCR analysis

1.3.3.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄:TRIzol法提取肌肉中總RNA。超微量紫外可見分光光度計測定總RNA的濃度和純度,并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。依據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄,程序設置:25 ℃ 5 min;42 ℃ 30 min;85 ℃ 5 s。

1.3.3.3 反轉(zhuǎn)錄·聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT q-PCR):用熒光定量PCR儀(ABIStep One PlusTM),GAPDH基因為內(nèi)參,每個樣本分別用待檢測基因和內(nèi)參基因引物擴增,3個復孔。采用2-ΔΔCt計算法對實時定量PCR數(shù)據(jù)進行處理和分析,計算方法如公式所示:

ΔΔCt=ΔCt(試驗樣品)-ΔCt(基準樣品);

ΔCt(試驗樣品)=Ct(試驗樣品,目的基因)-Ct(試驗樣品,內(nèi)參基因);

ΔCt(基準樣品)=Ct(基準樣品,目的基因)-Ct(基準樣品,內(nèi)參基因)。

1.3.3.4 Western blot:提取肌肉組織總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。制備SDS-PAGE凝膠進行電泳,凝膠電泳結束后,從凝膠分離的蛋白質(zhì)帶分別用非標記一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗對其進行孵育和檢測。利用化學發(fā)光成像系統(tǒng)曝光拍照,AlphaEaseFC軟件對Western blot條帶進行灰度分析,結果以目的蛋白與GAPDH灰度值比值顯示。Western blot所用抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件中單因素ANOVA分析同時間不同處理、同處理不同時間各指標的變化差異,Duncan’s法進行多重比較。一般線性模型(GLM)分析處理及時間的影響。Western blot條帶結果利用AlphaEaseFC軟件對Western blot條帶進行灰度分析,結果以目的蛋白與GAPDH灰度值比值顯示,隨后用SPSS 23.0進行雙因素分析。數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標準誤(Mean±SE)”表示,以P<0.05作為差異顯著性判斷標準,P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 運輸應激不同干預方式對羔羊背最長肌糖酵解潛力及AMPK活性的影響

由表4可知,處理極顯著影響了羔羊肌肉糖原水平(P<0.01),第14天新霉素組糖原水平顯著高于其他兩組(P<0.05)。處理對LA、G-6-P、游離葡萄糖、GP、AMPK活性均無顯著影響(P>0.05)。時間極顯著影響了羔羊肌肉糖原和游離葡萄糖水平(P<0.01),肌肉糖原在運輸后呈上升趨勢,對照組和電解多維組在第7天最高,新霉素組第14天最高;游離葡萄糖在0～14 d先升高后降低,在第7天最高。時間對LA、G-6-P、GP、AMPK活性無顯著影響(P>0.05)。處理×時間交互作用對羔羊肌肉糖酵解潛力及AMPK活性無顯著影響(P>0.05)。

表4 運輸應激不同干預方式對羔羊肌肉糖酵解潛力及AMPK活性的影響Table 4 Effects of different treatments of transportation stress on glycolysis potential and AMPK activity of lamb muscle

2.2 運輸應激不同干預方式對羔羊背最長肌糖酵解相關酶活性的影響

由表5可知,處理及處理×時間對羔羊肌肉糖酵解相關酶活性無顯著影響(P>0.05)。時間極顯著地影響了羔羊肌肉HK及LDH活性(P<0.01),各組肌肉HK活性在運輸后0～14天內(nèi)先升高后降低,第7天最高;肌肉LDH活性在運輸后呈上升趨勢,對照組和新霉素組在第7天最高,電解多維組第14天最高。時間對CK、PK活性無顯著影響(P>0.05)。

表5 運輸應激不同干預方式對羔羊肌肉糖酵解相關酶活性的影響Table 5 Effects of different treatments of transportation stress on glycolysis-related enzyme activities in lamb muscle

2.3 運輸應激不同干預方式對羔羊背最長肌LKB1、AMPKα1、AMPKα2基因表達量的影響

由表6可知,處理顯著影響了LKB1的基因表達量(P<0.05),第7天新霉素組LKB1基因量顯著高于電解多維組(P<0.05);處理對羔羊肌肉AMPKα1、AMPKα2基因表達無顯著影響(P>0.05)。時間極顯著地影響了AMPKα1、AMPKα2、LKB1表達量(P<0.01);各組AMPKα1、AMPKα2、LKB1基因表達量在0～14 天內(nèi)均呈下降趨勢。處理及時間交互對AMPKα1、AMPKα2、LKB1基因表達無顯著影響(P>0.05)。

表6 運輸應激不同干預方式對羔羊LKB1、AMPKα1、AMPKα2基因表達量的影響Table 6 Effects of different treatments oftransportation stress on gene expression of LKB1, AMPKα1 and AMPKα2 in lambs

2.4 運輸應激不同干預方式對羔羊背最長肌FAS、CPT-1、ACC基因表達量的影響

由表7可知,處理及處理×時間對羔羊肌肉FAS、CPT-1、ACC基因表達均無顯著影響(P>0.05)。時間極顯著地影響了CPT-1基因表達量(P<0.01),顯著影響了ACC基因表達量(P<0.05),各組CPT-1及ACC在運輸后7、14 d基因表達量均高于第0天;時間對羔羊肌肉FAS基因表達無顯著影響(P>0.05)。

表7 運輸應激不同干預方式對羔羊FAS、CPT-1、ACC基因表達量的影響Table 7 Effects of different treatments of transportation stress on gene expression of FAS, CPT-1 and ACC in lambs

2.5 運輸應激不同干預方式對羔羊背最長肌LKB1、AMPKα1、AMPKα2蛋白表達量的影響

由表8可知,處理及處理×時間交互作用對羔羊肌肉AMPKα1、AMPKα2、LKB1蛋白表達均無顯著影響(P>0.05)。時間顯著地影響了LKB1蛋白表達量(P<0.05)。處理有影響AMPKα1的趨勢(P<0.10)。各組AMPKα1、AMPKα2、LKB1蛋白表達量在0～14天內(nèi)均呈下降趨勢,與基因表達基本一致。Western blot檢測結果如圖1所示。

從左至右依次為第0天對照組、電解多維組、新霉素組;第7天對照組、電解多維組、新霉素組;第14天對照組、電解多維組、新霉素組From left to right in turn, there were 0 d control group, multivitamin electrolysis group and neomycin group; Control group, multivitamin electrolysis group and neomycin group on the 7th day; Control group, multivitamin electrolysis group and neomycin group on 14th day圖1 Western blot檢測LKB1、AMPKα1、AMPKα2蛋白表達Fig.1 Protein expression levels of LKB1, AMPKα1, and AMPKα2 analyzed by Western blot

表8 運輸應激不同干預方式對羔羊LKB1、AMPKα1、AMPKα2蛋白表達量的影響Table 8 Effects of different treatments of transportation on stress proteins expression of LKB1, AMPKα1 and AMPKα2 in lambs

3 討 論

3.1 運輸應激不同干預方式對羔羊背最長肌糖酵解潛力及AMPK活性的影響

屠宰后氧氣供應中斷,肌肉中葡萄糖與糖原代謝方式從有氧轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧糖酵解[5]。運輸應激會使肌糖原無氧糖酵解加劇,肌肉中LA持續(xù)積累,pH下降,導致肉品質(zhì)劣化[10]。GP是動物肌肉中糖酵解產(chǎn)生乳酸的底物總量:GP=2×(糖原含量+游離葡萄糖含量+G-6-P含量)+LA含量[9]。畜禽宰后糖原耗盡時糖酵解停止,AMPK活性不再升高,糖原及LA決定了GP[9]。研究發(fā)現(xiàn),肌糖原含量占pH24 h變化結果的40%～60%[11],GP顯著影響了肌肉pH與肉色[12]。此外,低GP導致干硬DFD(dark,firm and dry,DFD)牛肉發(fā)生率顯著提高,口感變差[13]。Cheng等[14]研究表明,維生素C對應激動物機體內(nèi)細胞凋亡有一定的保護作用。電解多維能夠改善因應激引起機體內(nèi)環(huán)境變化,維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),增強機體抗病力,緩解應激。新霉素口服后可以透過受損的消化道黏膜,進入機體內(nèi)循環(huán)輸送到肝、腎、心、肺和腹腔等組織器官,有效減少疾病的發(fā)生并治療[15]。張挺[16]研究發(fā)現(xiàn),抗菌成分的添加使應激小鼠糖原顯著提高,對其LA、GP水平無顯著影響。本研究運輸前后應用電解多維、運輸后用新霉素使羔羊糖原水平提高,但對其GP沒有顯著影響,說明電解多維和新霉素可能對調(diào)節(jié)羔羊肌肉糖酵解速率有作用。電解多維組屠宰后LA含量高于對照組,而新霉素組低于對照組,說明電解多維及新霉素會影響機體糖酵解進程,第7、14天電解多維組羔羊使機體無氧糖酵解過程加快,而運輸后新霉素治療可能減緩了無氧糖酵解進程。AMPK活性變化既反映機體正常能量代謝情況,也反映細胞應激情況。AMPK可通過調(diào)節(jié)機體物質(zhì)代謝以維持細胞能量、調(diào)節(jié)機體的產(chǎn)能和耗能[17],通常在營養(yǎng)缺乏、低氧、劇烈運動等狀況下被激活。研究表明,AMPK激活降低了畜禽肉色穩(wěn)定性、系水力、剪切力等品質(zhì)[18]。本試驗中,隨著羔羊應激后飼養(yǎng)時間的延長,運輸前后用電解多維及運輸后用新霉素均未顯著影響AMPK活性,AMPK處于活化狀態(tài)。

3.2 運輸應激不同干預方式對羔羊背最長肌糖酵解相關酶活性的影響

宰后糖酵解代謝速率直接影響pH的下降程度和速率,而糖酵解速率與控制其糖酵解的限速酶HK、PK和LDH等有關[19]。CK是機體應激狀態(tài)下調(diào)節(jié)能量代謝的重要靶點[20],存在于動物肌肉、心與腦等組織的線粒體和細胞漿中。維生素A、C和E可清除自由基緩解機體氧化應激,保護機體細胞膜免受損害[21]。本試驗中,電解多維及新霉素對肌肉CK活性無影響,運輸后14 d內(nèi)各組肌肉CK活性也無顯著變化,而在之前的研究中,運輸后14 d內(nèi)各組羔羊血清CK活性均上升,且電解多維組及新霉素組血清CK含量均低于對照組,運輸應激使血清CK持續(xù)性升高,說明血清CK更能反映機體應激情況[22-23]。HK是糖酵解途徑中的第1個關鍵酶,可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為G-6-P,促進糖酵解的發(fā)生并有效補充細胞ATP能量[24]。PK和LDH作為糖酵解途徑的關鍵末端酶,厭氧條件下分別將磷酸烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸、丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸[25]。LDH主要存在于心肌、肝、腎、骨骼肌或肺等動物組織中,其升高說明骨骼肌損傷或疲勞、存在肝炎等疾病[26]。肌肉LA的積累取決于細胞膜酶LDH和線粒體之間對來自糖酵解的丙酮酸的競爭[27]。Zhang等[28]研究表明,3 h的運輸應激后肉雞肌肉中HK、PK、LDH均顯著上升,表明肌肉ATP的耗竭可能通過激活HK活性觸發(fā)糖酵解機制,隨后PK和LDH的活性增加,代謝物磷酸烯醇-丙酮酸和丙酮酸累積。本試驗中處理有影響PK的趨勢,電解多維組PK活性最低。本研究中,各組羔羊肌肉HK活性在運輸后第0～14天先升高后降低,第7天最高;運輸后第0、7、14天,三組間PK均無顯著變化,電解多維及新霉素治療對PK活性沒有明顯的調(diào)控作用,說明羔羊應激的糖酵解機制調(diào)節(jié)和肉雞一樣可能更依賴于HK,較高的HK活性可能代表著較高的糖酵解速率。運輸后第0天,電解多維組肌肉LDH顯著高于對照組和新霉素組,其可能的原因是電解多維的預防性添加有助于保護細胞膜完整性,防止肌細胞損傷。對照組及新霉素組第0天LDH顯著低于第7、14天,說明運輸應激使肌肉損傷或疲勞,LDH大量釋放,隨著運輸后飼養(yǎng)時間的延長逐漸修復。

3.3 運輸應激不同干預方式對羔羊背最長肌相關基因及蛋白表達的影響

AMPK是異源三聚體酶,在感應細胞內(nèi)能量平衡和調(diào)控肌肉糖酵解方面發(fā)揮著重要作用[29]。AMPK可通過兩種信號激活:肝激酶B1(LKB1)介導和鈣調(diào)素依賴蛋白激酶介導[30]。在應激情況下,LKB1是引起AMPK活化的主要原因,尤其是在肌肉組織中。而鈣調(diào)素依賴蛋白激酶激活AMPK主要與肝細胞中磷酸和鈣、氫陽離子濃度增加密切相關,與肌細胞能量代謝相關性較小[31]。本試驗中,處理顯著影響了LKB1基因表達量,電解多維抑制了LKB1基因及蛋白表達,應激緩解效果最好。Hu等[32]研究表明,饑餓應激使雞PM[33](快速糖酵解肌肉)的AMPKα2基因表達量顯著降低。Zhang等[28]研究表明,宰前運輸應激顯著增加了雞胸大肌LKB1和AMPKα2基因水平,對AMPKα1表達無顯著影響,應激通過上調(diào)LKB1和AMPKα2表達激活AMPK。本研究中,隨著運輸后飼養(yǎng)時間的延長,各組羔羊肌肉AMPKα1、AMPKα2、LKB1基因及蛋白表達量均逐漸下降,機體應激逐漸緩解;運輸后14 d內(nèi)新霉素組AMPKα1、AMPKα2、LKB1基因及蛋白表達量持續(xù)高于電解多維組及對照組,在第7天停止用藥后AMPK途徑基因表達量仍處于較高水平,新霉素治療可能并未有效抑制AMPK途徑的激活。

低能量條件下AMPK可以磷酸化特異性的酶和位點,增加ATP生成,降低ATP消耗。研究表明,AMPK可通過促進大分子分解補充機體能量,并能保持脂肪代謝處于穩(wěn)定狀態(tài)[34]。AMPK途徑的激活可通過磷酰化ACC調(diào)節(jié)脂肪酸代謝,減少機體丙二酰輔酶A含量,促進CPT-1蛋白活化,加速脂肪酸氧化。FAS是機體碳水化合物合成代謝轉(zhuǎn)化為脂肪酸的關鍵酶,可催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A形成長鏈脂肪酸[35]。本研究中,運輸應激后隨著飼養(yǎng)時間延長,羔羊肌肉FAS表達量無變化,運輸后14 d脂肪合成情況未受影響。在脂肪酸的代謝途徑中,ACC是丙二酰輔酶A合成的關鍵限速酶。丙二酰輔酶A又是脂肪酸關鍵合成前體物,也是CPT-1進入線粒體進行β氧化的高效抑制物質(zhì)。ACC失活,CPT-1的抑制減少,糖原和脂肪酸合成減少,脂肪酸氧化增加,釋放大量能量[36]。Désert等[37]研究表明,饑餓應激抑制了肉雞肝組織中的脂肪酸合成并促進了脂肪酸β氧化。本研究中,運輸后第0天電解多維組CPT-1表達量顯著高于其余兩組,電解多維的補充一定程度上可間接為機體供能。Hu等[32]研究表明,禁食24 h組ACC水平低于自由采食組,禁食24 h后補飼24 h組肉雞ACC水平高于自由采食組及禁食24 h組,應激顯著下調(diào)了ACC基因表達,誘導了骨骼肌中脂肪酸生物合成的抑制,再補飼ACC表達逐漸上升。與本研究結果一致,運輸后ACC和CPT-1表達量上升,表明脂肪酸氧化仍在加劇進行,持續(xù)為機體補充能量。

4 結 論

綜上所述,羔羊運輸前、后添加電解多維可改善肌肉能量代謝狀態(tài),抑制運輸誘導的AMPK途徑激活。