危冬昱 穆玉雪 許馨月 蘇玉婷 李少衡,3 曹瑞丹 張作明 陳 濤

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系航空航天臨床醫(yī)學(xué)中心,西安 710032)(2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院空勤科,西安 710032) (3.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院眼科,西安 710032)

1956年以來(lái),我國(guó)的航天事業(yè)蓬勃發(fā)展,從順利發(fā)射自主研發(fā)的第一顆人造地球衛(wèi)星“東方紅1號(hào)”到自主培養(yǎng)的航天員首次進(jìn)入太空僅用了33年的時(shí)間。近期,我國(guó)航天員已經(jīng)在空間站中開(kāi)展了180 d的航天飛行。值得慶賀的同時(shí)也預(yù)示未來(lái)長(zhǎng)期航天飛行工作將是航天員面對(duì)的重要任務(wù)。航天事業(yè)的快速發(fā)展給航天醫(yī)學(xué)帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。太空失重的環(huán)境中,由于全身體液的頭向轉(zhuǎn)移,機(jī)體各系統(tǒng)均受到不同程度的影響[1]。但由于現(xiàn)實(shí)條件限制,研究學(xué)者們廣泛采取地面尾吊大鼠模型模擬微重力環(huán)境下的機(jī)體改變[2-4]。良好的視覺(jué)功能是宇航員準(zhǔn)確獲得外界信息并有效完成各項(xiàng)航天任務(wù)的重要保障。微重力暴露條件下眼部的改變一直是航天醫(yī)學(xué)的重要研究問(wèn)題。在前期的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,通過(guò)相應(yīng)的眼部檢測(cè)技術(shù),在原有尾吊大鼠模型的基礎(chǔ)上,建立了模擬長(zhǎng)期失重所致眼損傷Sprague-Dawley(SD)大鼠疾病動(dòng)物模型[5]。

SD大鼠屬于白化大鼠,其虹膜及視網(wǎng)膜色素上皮(retina pigment epithelium,RPE)細(xì)胞中均不含黑色素,因此在很多眼科疾病的研究中白化大鼠動(dòng)物模型的應(yīng)用嚴(yán)重受限。為了完善和補(bǔ)充前期建立的模擬長(zhǎng)期微重力暴露所致眼部損傷疾病動(dòng)物模型的構(gòu)建方法,有必要在非白化大鼠中進(jìn)行驗(yàn)證。Brown-Norway大鼠(BN大鼠,非白化)其生命力強(qiáng),繁殖率高,在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中運(yùn)用廣泛[6]。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在BN大鼠上驗(yàn)證已建立的模擬長(zhǎng)期失重所致眼損傷動(dòng)物模型構(gòu)建方法,了解白化與非白化大鼠在模擬長(zhǎng)期微重力暴露后眼部損傷是否存在差異,為該模型的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

正常雄性SD大鼠12只,體質(zhì)量(170±10)g,購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證【SCXK(陜)2019-001】;雄性BN大鼠12只,體質(zhì)量(170±10)g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證【SCXK(京)2016-0011】。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組:SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Normal,NS組)與模型組(Model,MS組),每組6只。BN大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Normal,NB組)與模型組(Model,MB組),每組6只。

1.2.2模擬長(zhǎng)期失重:MS組與MB組大鼠均按已發(fā)表模型方法[5]進(jìn)行造模,具體方法為:預(yù)飼養(yǎng)一周后,將大鼠置于大鼠固定器中,外露其尾部。尾部清潔后,依次用安息香酊和松香酊涂抹并晾干,增加尾部粘合力同時(shí)減少尾部損傷。待尾巴稍干后,準(zhǔn)備長(zhǎng)約20 cm的醫(yī)用膠帶將大鼠尾部吊起,使大鼠始終處于約30°頭低位,懸吊于特制的單籠中,時(shí)長(zhǎng)為8周。懸吊期間大鼠前爪可自由活動(dòng),但后爪即使伸直也無(wú)法觸及籠的觸桿,大鼠可在籠中自由進(jìn)食飲水,SD大鼠與BN大鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等級(jí)均為SPF級(jí)別,動(dòng)物房?jī)?nèi)溫度控制在(23±1)℃,濕度控制在45%～55%,采用12 h/12 h晝夜間斷照明。8周造模結(jié)束后進(jìn)行眼部視覺(jué)功能檢測(cè),眼底照相,眼球取材并測(cè)量大鼠右下肢比目魚(yú)肌質(zhì)量及體質(zhì)重。

1.2.3視覺(jué)電生理檢測(cè):提前12 h對(duì)大鼠進(jìn)行暗適應(yīng),在標(biāo)準(zhǔn)暗室紅光環(huán)境下使用法國(guó)邁威視覺(jué)電生理檢查儀參照ISCEV國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行視覺(jué)電生理檢測(cè)。具體操作步驟如下:常規(guī)麻醉(3 mL/kg 1%戊巴比妥鈉 + 50 μL 50%速眠新)及復(fù)方托比卡胺滴眼液散瞳后,將麻醉好的大鼠置于電生理操作臺(tái)上固定,滴入1～2滴鹽酸奧布卡因滴眼液進(jìn)行眼球表面麻醉,隨后安放電極依次進(jìn)行視網(wǎng)膜電圖(ERG)和視覺(jué)誘發(fā)電位(VEP)的檢測(cè)。ERG作用電極(Ag-Cl環(huán)狀電極)放于角膜上,參考電極(不銹鋼針狀電極)插入大鼠臉頰皮下,接地電極(不銹鋼針狀電極)插入大鼠尾部皮下。VEP記錄電極均為不銹鋼針狀電極,作用電極置于兩耳連線中心皮下,參考電極和接地電極位置同ERG。ERG結(jié)果分析時(shí)選用暗適應(yīng)3.0反應(yīng)b波幅值、明適應(yīng)3.0反應(yīng)b波幅值和OPs 反應(yīng)的O2波幅值。VEP 反應(yīng)分析 P2波峰時(shí)值和波幅值。

1.2.4眼底照相:ERG檢查結(jié)束后將大鼠置于升降臺(tái)上固定,用復(fù)方托比卡胺滴眼液散瞳,鹽酸奧布卡因滴眼液進(jìn)行表面麻醉,擺好眼位,待瞳孔散大后(直徑4 mm)將醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉涂于測(cè)試眼角膜上,將小動(dòng)物眼底成像系統(tǒng)(S-5000、CANADA)顯微鏡鏡頭對(duì)準(zhǔn)瞳孔,選用白光模式,調(diào)整焦距,待成像清晰后進(jìn)行拍照。每只大鼠雙眼均進(jìn)行拍照。

1.2.5熒光素鈉眼底血管造影:常規(guī)眼底照相結(jié)束后,為進(jìn)一步觀察BN 大鼠眼底血管有無(wú)異常改變,對(duì)BN大鼠進(jìn)行熒光素鈉眼底照相,選用藍(lán)光模式,拍照方法同普通眼底照相,將10%濃度的熒光素鈉(0.1 mL/200 g)腹腔注射,于注射后1～2 min后采集眼底照片。每只大鼠雙眼均進(jìn)行拍照。拍照完成后用0.9%氯化鈉溶液清洗雙眼,并用加替沙星凝膠點(diǎn)眼預(yù)防感染。

1.2.6視網(wǎng)膜切片HE染色:在活體實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,過(guò)量麻藥注射處死大鼠,取眼球,于冰上處理眼球周圍多余組織,在角膜上用細(xì)針扎一小孔,將眼球放于眼球固定液中固定,4°過(guò)夜,24 h后取出眼球,進(jìn)行常規(guī)脫水并行石蠟包埋切片后完成HE染色。從視乳頭中心開(kāi)始每間隔500 μm測(cè)量一次視網(wǎng)膜外核層厚度,直至距離視乳頭3 500 μm處。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 尾部懸吊對(duì)兩個(gè)品系大鼠體質(zhì)量及比目魚(yú)肌質(zhì)量的影響

如圖1所示,尾部懸吊前及懸吊8周后SD大鼠和BN大鼠的體質(zhì)量與相應(yīng)對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),而兩個(gè)品系的模型組大鼠的比目魚(yú)肌質(zhì)量與相應(yīng)對(duì)照組相比明顯減輕(P<0.01),表明兩個(gè)品系的大鼠在尾部懸吊模擬失重8周后均出現(xiàn)了失重引起的骨骼肌的萎縮表現(xiàn)。

注:A.尾部懸吊前各組大鼠體質(zhì)量;B.尾部懸吊8周后各組大鼠體質(zhì)量;C.尾部懸吊8周后各組大鼠比目魚(yú)肌質(zhì)量;**P<0.01。Note: A. Comparison of body mass between SD and BN rats before tail suspension; B. Comparison of body weight between SD and BN rats with tail suspension for 8 weeks; C. Soleus muscle mass in SD and BN rats with tail suspension for 8 weeks; **P<0.01.

2.2 尾部懸吊8周對(duì)兩個(gè)品系大鼠視覺(jué)功能的影響

如圖2,SD大鼠尾部懸吊8周后,視覺(jué)功能明顯下降,Ns與Ms組相比,暗適應(yīng)3.0ERG反應(yīng)b波幅值降低【(997.50±24.53)μVvs. (504.83±52.53)μV,P<0.01】、振蕩電位OPS反應(yīng)O2波幅值降低【(195.00±17.25)μVvs. (70.90±8.56)μV,P<0.01】和明適應(yīng)3.0ERG反應(yīng)b波幅值降低【(161.50±7.94)μVvs.(80.67±2.72)μV,P<0.01】,VEP反應(yīng)P2波幅值無(wú)明顯改變【(16.08±1.49) μVvs. (15.27±0.84)μV,P>0.05】,但是VEP反應(yīng)P2波模型組峰時(shí)值明顯延長(zhǎng)【(83.30±1.96)msvs. (113.83±4.07)ms,P<0.01】。而B(niǎo)N大鼠在尾部懸吊8周后,與相應(yīng)對(duì)照組相比視覺(jué)功能無(wú)明顯改變,暗適應(yīng)3.0ERG反應(yīng)b波幅值、振蕩電位OPS反應(yīng)O2幅值、明適應(yīng)3.0ERG反應(yīng)b波幅值、VEP反應(yīng)P2幅值和VEP反應(yīng)P2峰時(shí)值均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

注:A.SD大鼠和BN大鼠ERG和VEP的典型波形圖;B.ERG暗適應(yīng)3.0反應(yīng)b波幅值統(tǒng)計(jì)結(jié)果;C.振蕩電位Ops反應(yīng)O2波幅值統(tǒng)計(jì)結(jié)果;D.ERG明適應(yīng)3.0反b波幅值統(tǒng)計(jì)結(jié)果;E.VEP反應(yīng)P2波峰時(shí)值統(tǒng)計(jì)結(jié)果;F.VEP反應(yīng)P2波幅值統(tǒng)計(jì)結(jié)果; **P<0.01。Note: A. Typical waveforms of ERG and VEP in SD and BN rats; B. Statistical results of the amplitude of b wave of dark-adapted 3.0 ERG;C. Statistical results of the amplitude of O2 wave of dark-adapted 3.0 oscillatory potentials; D. Statistical results of the amplitude of b wave of Light-adapted 3.0 ERG; E. Statistical results of the latency of P2 wave of VEP; F. Statistical results of the amplitude of P2 wave of VEP; **P<0.01.

2.3 尾部懸吊8周對(duì)兩品系大鼠眼底的影響

尾部懸吊8周時(shí)SD大鼠眼底未見(jiàn)明顯出血,視乳頭水腫等改變,模型組與對(duì)照組相比可見(jiàn)脈絡(luò)膜血流增多現(xiàn)象,尾部懸吊8周時(shí)BN大鼠眼底未見(jiàn)明顯視乳頭水腫、視網(wǎng)膜血管滲漏和脈絡(luò)膜血流增多現(xiàn)象(圖3)。

圖3 尾懸吊8周各組大鼠典型眼底圖像Fig.3 Typical fundus images of SD and BN rats in control group and model group after tail suspension for 8 weeks

2.4 尾部懸吊8周對(duì)兩個(gè)品系大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的影響

SD大鼠尾部懸吊8周后,大鼠視網(wǎng)膜外核層厚度與相應(yīng)對(duì)照組相比明顯變薄(P<0.01),表現(xiàn)為視網(wǎng)膜退行性改變;而B(niǎo)N大鼠在尾部懸吊8周后,大鼠視網(wǎng)膜各層厚度與相應(yīng)對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4)。

2.5 熒光素鈉眼底血管造影

尾部懸吊8周時(shí),BN大鼠視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜血管未見(jiàn)滲漏等異常改變(圖5)。

圖5 尾部懸吊8 周BN大鼠熒光素鈉眼底血管造影Fig.5 FFA of BN rat after tail suspension for 8 weeks

3 討論

以往的研究[5]表明,SD大鼠在尾部懸吊模擬失重8周后可以出現(xiàn)以視網(wǎng)膜外核層變薄為特征的視網(wǎng)膜退行性改變。本實(shí)驗(yàn)中也觀察到SD大鼠在尾部懸吊8周后視網(wǎng)膜的功能和結(jié)構(gòu)均發(fā)生了退行性改變,再次證實(shí)了尾部懸吊模擬失重導(dǎo)致眼部損傷SD大鼠模型的有效性。但是,本實(shí)驗(yàn)同時(shí)也觀察到BN大鼠在尾部懸吊模擬失重8周后,雖然骨骼肌已經(jīng)出現(xiàn)了失重引起的萎縮效應(yīng)(圖1),但是視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)(圖4,5)和功能(圖2)并未發(fā)生退行性改變。

SD大鼠與BN大鼠均屬于常用的封閉群實(shí)驗(yàn)大鼠,這兩種品系大鼠眼部表型中最大的區(qū)別在于RPE細(xì)胞中是否含有黑色素。RPE細(xì)胞是位于視網(wǎng)膜光感受器底層的單層色素上皮細(xì)胞,RPE的主要功能是將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子從脈絡(luò)膜毛細(xì)血管轉(zhuǎn)運(yùn)至光感受器上,起到血眼屏障的作用,吞噬視網(wǎng)膜代謝終產(chǎn)物、消化光感受器外節(jié)膜盤(pán)并生成新的膜盤(pán),從而保證光感受器的正常功能,促進(jìn)損傷后的再生和修復(fù)[7-8]。RPE功能的異?？蓪?dǎo)致視網(wǎng)膜色素變性、光感受細(xì)胞死亡,最終導(dǎo)致眼部疾病。RPE細(xì)胞中的黑色素對(duì)其周邊結(jié)構(gòu)有重要的保護(hù)作用,它可吸納光感受細(xì)胞無(wú)法吸收的多余光,保護(hù)視網(wǎng)膜免受光產(chǎn)生的氧活性物質(zhì)的影響。RPE中的黑色素顆粒在光照條件下對(duì)RPE和視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞都具有重要保護(hù)作用。同時(shí),RPE黑色素參與眼內(nèi)多種生理作用,參與視網(wǎng)膜和神經(jīng)發(fā)育、抗光損傷等。有研究[8]表明,在同樣的光照條件下,電子顯微鏡顯示白化小鼠較非白化小鼠因缺少黑色素,視網(wǎng)膜外節(jié)和外核層明顯變薄,RPE結(jié)構(gòu)異常,脈絡(luò)膜血管明顯萎縮。這些均說(shuō)明RPE細(xì)胞中的黑色素顆粒在對(duì)抗眼內(nèi)視網(wǎng)膜損傷過(guò)程中,發(fā)揮了重要的作用[9-10]。據(jù)此,推測(cè)兩個(gè)品系大鼠在尾部懸吊模擬失重后眼部不同的表現(xiàn)可能與RPE中的黑色素含量有關(guān)。

綜上所述,在利用尾部懸吊模擬失重所致眼部損傷研究時(shí),宜選用白化大鼠進(jìn)行造模,而不應(yīng)選擇非白化的色素大鼠。本研究在以往建立的模擬長(zhǎng)期失重所致眼損傷大鼠疾病動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上對(duì)構(gòu)建方法進(jìn)行必要的補(bǔ)充。此外,本研究也提示我們RPE中的黑色素可能是研究長(zhǎng)期失重所致眼部損傷干預(yù)措施的重要靶點(diǎn),為航天相關(guān)眼病的研究提供了新思路。