鄧 晨 戴家澤 邱麗紅 沈威廷 蔡木發(fā) 羅文英

（1.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 湛江 524000；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，廣東 湛江 524000）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是醫(yī)院常見(jiàn)的革蘭陰性桿菌，屬于條件致病菌，可通過(guò)質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移獲得與抗菌藥物耐藥性或毒力相關(guān)遺傳物質(zhì)，從而進(jìn)化為一種新的致病型[1]。目前，臨床主要流行2種類型的KP，分別是經(jīng)典型肺炎克雷伯菌（classicKlebsiella pneumoniae，CKP）和高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulentKlebsiella pneumoniae，hvKP）。與CKP比較，hvKP的致病力和傳播性更強(qiáng)，可致較高的患病率和患者死亡率[2]。hvKP自20世紀(jì)80年代開(kāi)始廣泛流行，目前已成為一個(gè)嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題，且由于抗菌藥物的不當(dāng)使用，兼具高毒力和耐藥性的碳青霉烯耐藥高毒力肺炎克雷伯菌（carbapenemresistant hypervirulentKlebsiella pneumoniae，CR-hvKP）已經(jīng)出現(xiàn)[3-4]，給臨床治療帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。本研究旨在了解湛江地區(qū)hvKP的分子流行特征，分析其耐藥特征，以及感染患者的臨床特征，為湛江地區(qū)合理防治hvKP感染提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2021年6月—2022年6月湛江市2家三級(jí)甲等醫(yī)院住院患者不同臨床樣本中分離出的非重復(fù)KP菌株和感染患者的臨床資料，將拉絲試驗(yàn)和毒力基因（rmpA、rmpA2、iucA、iroB、aerobactin和peg344）陽(yáng)性的KP納入hvKP組，其他KP菌株納入CKP組。

1.2 制備DNA模板

采用水煮法制備DNA模板，檢測(cè)DNA濃度和純度，以A260nm/A280nm≈1.8為合格。

1.3 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）

參考文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)hvKP6 個(gè)毒力基因（rmpA、rmpA2、iucA、iroB、aerobactin和peg344）和6個(gè)莢膜血清型基因（K1、K2、K5、K20、K54、K57）引物（表1），委托生工生物工程（上海）有限公司合成引物。PCR總反應(yīng)體系為50 μL，包括25 μL 2x PCR mix、4 μL DNA模板，上、下游引物各2 μL，17 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸1 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像分析儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）觀察電泳結(jié)果，并拍照保存。

表1 hvKP毒力基因、莢膜血清型基因和管家基因引物序列

1.4 多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）

參考MLST網(wǎng)站（https：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/）上描述的方法，采用PCR擴(kuò)增hvKP的7個(gè)管家基因（gapA、mdh、phoE、tonB、infB、pgi和rpoB）（管家基因引物序列見(jiàn)表1），擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果上傳至MLST數(shù)據(jù)庫(kù)，得到7個(gè)等位基因型和ST型別。

1.5 體外藥物敏感性試驗(yàn)

采用VITEK 2 Compact自動(dòng)化鑒定藥敏儀（法國(guó)生物梅里埃公司）進(jìn)行菌株鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)，參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[5]判讀結(jié)果。質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）和肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）購(gòu)自廣東省臨床檢驗(yàn)中心。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。呈非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-whitneyU檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株收集和分組結(jié)果

共收集175株非重復(fù)KP臨床分離株，其中48株（27.43%）納入hvKP組，127株（72.57%）納入CKP組。hvKP組菌株主要來(lái)源于重癥監(jiān)護(hù)病房（14.58%，7/48），CKP組菌株主要來(lái)源于老年科（12.60%，16/127）。hvKP組和CKP組主要樣本類型均為痰液，分別占62.5%（30/48）和33.07%（42/127）。

2.2 hvKP組莢膜血清分型結(jié)果

hvKP組以K1莢膜血清型為主，占62.50%（30/48），其次是K2、K57、K20和K54，分別占16.67%（8/48）、12.50%（6/48）、6.25%（3/48）和2.08%（1/48），未檢出K5型hvKP，部分菌株莢膜血清型基因擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 莢膜血清型基因電泳圖（部分）

2.3 hvKP組MLST結(jié)果

hvKP組菌株共檢出11種ST型別，以ST23型為主，占58.33%（28/48），全部屬于K1莢膜血清型。見(jiàn)表2。

表2 48株hvKP組MLST和莢膜血清型

2.4 hvKP組和CKP組體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

hvKP組菌株對(duì)臨床常見(jiàn)的9種抗菌藥物敏感率明顯高于CKP組，對(duì)阿米卡星、亞胺培南和頭孢哌酮-舒巴坦的敏感率為97.92%（47/48），對(duì)頭孢他啶、替加環(huán)素和哌拉西林-他唑巴坦的敏感率為95.83%（46/48），對(duì)頭孢吡肟、左氧氟沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑的敏感率為93.75%（45/48）；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extendedspectrum beta-lactamase，ESBL）耐藥表型攜帶率為4.17%（2/48），與CKP組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。hvKP組檢出1株CRhvKP。見(jiàn)表3。

表3 hvKP組與CKP組對(duì)抗菌藥物的敏感性和耐藥表型攜帶情況比較 株（%）

2.5 hvKP組和CKP組患者臨床特征比較

hvKP組和CKP組患者性別、年齡和預(yù)后差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在感染類型方面，hvKP組以社區(qū)感染為主，CKP組以醫(yī)院感染為主（P=0.035）。在并發(fā)癥和基礎(chǔ)疾病史方面，hvKP組比CKP組更容易并發(fā)肝膿腫和血流感染（P＜0.05），但hvKP組通常無(wú)泌尿系統(tǒng)基礎(chǔ)疾病史。在感染發(fā)生部位方面，hvKP組發(fā)生呼吸道感染、血流感染、肝膽道感染和全身多部位感染的比例明顯高于CKP組（P＜0.05），但CKP組發(fā)生泌尿道感染的比例高于hvKP組（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較，hvKP組白細(xì)胞總數(shù)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶明顯高于CKP組（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 hvKP組與CKP組患者臨床特征比較

3 討論

hvKP的定義目前尚未達(dá)成共識(shí)，臨床微生物實(shí)驗(yàn)室一般基于高黏液表型的拉絲試驗(yàn)來(lái)定義hvKP，但存在錯(cuò)檢和漏檢的風(fēng)險(xiǎn)。RUSSO等[6]發(fā)現(xiàn)，位于毒力質(zhì)粒上的毒力基因具有高度特異性和遺傳穩(wěn)定性，可作為鑒定hvKP的生物標(biāo)志物，其中毒力基因rmpA、rmpA2、iucA、iroB和peg344的診斷準(zhǔn)確率均超過(guò)95%。因此，本研究以毒力基因rmpA、rmpA2、iucA、iroB、aerobactin和peg344作為鑒定hvKP的生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)此方法篩選出的hvKP感染患者更容易發(fā)生全身多部位感染、肝膿腫、膿毒血癥等并發(fā)癥，且白細(xì)胞計(jì)數(shù)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶也明顯高于CKP組，證明了采用拉絲試驗(yàn)和鑒定上述6種毒力基因的方法能夠有效篩選出hvKP菌株。

本研究分離鑒定的hvKP菌株具有基因多樣性，以K1-ST23型hvKP[58.33%（28/48）]為主要流行毒株。有薈萃分析結(jié)果顯示，K1型和ST23型是中國(guó)hvKP分離株中最常見(jiàn)的莢膜血清型和ST型別[7]。然而，K1莢膜血清型在hvKP中流行率高的原因尚不清楚，可能與腸道定植有關(guān)。另外，K1莢膜血清型hvKP可能與肝膿腫密切相關(guān)，本研究中，引發(fā)肝膿腫的9株hvKP中有7株屬于K1莢膜血清型。CHUNG等[8]認(rèn)為，K1莢膜血清型侵襲性KP是引發(fā)韓國(guó)人群肝膿腫的主要病原體。因此，建議在臨床工作中應(yīng)注意K1/K2莢膜血清型hvKP感染患者合并肝膿腫的風(fēng)險(xiǎn)。此外，hvKP相關(guān)肝膿腫治療的關(guān)鍵在于及時(shí)引流膿液，但是由于hvKP具有高黏液樣特性，建議臨床選擇更大口徑的引流管，并勤沖洗，避免堵管。

由毒力基因rmpA和rmpA2參與編碼的莢膜多糖是hvKP的重要毒力因子之一，過(guò)量產(chǎn)生的莢膜多糖作為包裹在菌體表面的一種物理屏障，不僅能夠幫助hvKP逃避宿主免疫反應(yīng)，還能限制水平基因的轉(zhuǎn)移[9]。耐藥基因的轉(zhuǎn)移障礙可能是導(dǎo)致本研究中hvKP比CKP更不容易產(chǎn)生抗菌藥物耐藥性的原因。值得注意的是，本研究檢出了1株CR-hvKP，這種同時(shí)具有高毒力、多藥耐藥性和高度傳播性的菌株在醫(yī)院環(huán)境中的傳播是具有致命性的。浙江省某三級(jí)甲等醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房曾發(fā)生ST11型CR-hvKP引發(fā)的嚴(yán)重的呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎，導(dǎo)致5例患者死于嚴(yán)重肺部感染、多器官衰竭或感染性休克[10]。提示在臨床工作中應(yīng)重視此類情況，及時(shí)采取控制措施，阻止其在社區(qū)和醫(yī)院環(huán)境中進(jìn)一步傳播，并合理使用抗菌藥物。另外，盡管本研究中hvKP菌株大多對(duì)抗菌藥物敏感，但仍有20.83%的患者死亡，這可能是因?yàn)榫甓玖^(guò)強(qiáng)，患者疾病進(jìn)展迅速，而且在感染初期臨床并不知道該種菌株是“高毒力的”，因而未及時(shí)采取針對(duì)性治療措施。許多隱匿部位的膿腫，如hvKP相關(guān)化膿性眼內(nèi)炎、腦膜炎和前列腺炎，需要達(dá)到足夠的藥物濃度才能獲得最佳的療效。因此，臨床微生物實(shí)驗(yàn)室及時(shí)鑒定出hvKP菌株對(duì)于hvKP相關(guān)化膿性感染患者的治療和預(yù)后具有非常重要的臨床意義。

盡管本研究中hvKP組患者以社區(qū)感染為主，但hvKP感染向醫(yī)院感染轉(zhuǎn)變的這種情況已經(jīng)發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，日本7家不同醫(yī)院的hvKP感染中，超過(guò)50%與醫(yī)院感染有關(guān)[11]。發(fā)生這種情況的可能原因是廣泛耐藥CKP菌株通過(guò)獲得hvKP毒力質(zhì)粒，進(jìn)化為廣泛耐藥hvKP菌株。如果這種高毒力菌株取代CKP成為衛(wèi)生保健環(huán)境中的主要定植菌，勢(shì)必會(huì)增加住院患者的感染風(fēng)險(xiǎn)，從而導(dǎo)致hvKP感染發(fā)病率和患者死亡率的增加。此外，男性似乎比女性更容易感染KP，本研究中，無(wú)論是hvKP組，還是CKP組，感染患者均以男性居多，這一點(diǎn)在其他研究中也得到了驗(yàn)證[12-13]，造成這種性別分布差異的原因有待進(jìn)一步研究。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，CKP組有泌尿系統(tǒng)疾病史，以及發(fā)生泌尿道感染的比例明顯高于hvKP組，這可能與CKP的耐藥性及其感染特性有關(guān)。廣泛耐藥的CKP菌株普遍存在于醫(yī)療衛(wèi)生保健環(huán)境中，可以定植于患者的結(jié)腸和會(huì)陰部，通過(guò)上行途徑導(dǎo)致泌尿道感染，并且CKP造成的這種尿路感染往往是局部的，很少隨著血流傳播導(dǎo)致其他部位發(fā)生繼發(fā)感染。

本研究還存在不足之處，首先是樣本量不足，且持續(xù)時(shí)間僅為1年，不是多中心研究；其次是本研究中關(guān)于hvKP的定義可能過(guò)于“嚴(yán)苛”，在進(jìn)行毒力基因檢測(cè)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)有部分黏液型KP并未同時(shí)攜帶6種毒力基因，從而未被納入hvKP組，而且這部分菌株實(shí)際的毒力情況我們并未考證，可能造成了漏檢。另外，由于本研究中的KP菌株均收集于醫(yī)院環(huán)境，在抗菌藥物的作用下大部分CKP菌株已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)樘记嗝瓜┠退幏窝卓死撞?，這種多藥耐藥型菌株也會(huì)造成很高的病死率，這也解釋了為什么本研究中2個(gè)組感染患者預(yù)后并未出現(xiàn)太大差別。

綜上所述，K1-ST23型是湛江地區(qū)hvKP優(yōu)勢(shì)流行株。hvKP較CKP對(duì)抗菌藥物更敏感，hvKP感染患者更易出現(xiàn)全身多部位感染和肝膿腫，以及血流感染等并發(fā)癥，其感染相關(guān)指標(biāo)水平偏高，且伴有肝功能損傷，臨床應(yīng)加以重視。