袁晞釩付瓊怡苗明三

(1. 河南中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學院,鄭州 450046;2. 河南中醫(yī)藥大學,鄭州 450046)

青光眼是一種視神經(jīng)頭改變、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion fine the cell,RGC)逐漸死亡、視野喪失的進行性神經(jīng)病變。 眼壓升高是主要的危險因素[1]。 青光眼是一種發(fā)病原因復雜的高致盲性眼病。 全球40 ~ 80 歲人群中青光眼患病率為3.5%,隨著老年人在人口中的數(shù)量和比例不斷增加,預計到2040 年將有1.118 億人患有青光眼[2]。目前,青光眼尚無根治方法,所有的治療方法都以降低眼壓(intraocular pressure, IOP)為目標[3]。 降低眼壓是該病目前唯一可行的治療方法[4]。 西醫(yī)對青光眼的發(fā)病機制尚未明確,中醫(yī)將其歸屬為“五風內(nèi)障”的范疇,認為該病發(fā)病與情志等多因素相關(guān)[5]。 青光眼致盲給患者帶來了巨大的疾病負擔和經(jīng)濟負擔。 因此研究有效的治療方法和藥物至關(guān)重要,而理想的動物模型是進一步研究青光眼的重要工具。 本文通過對青光眼動物模型進行歸納總結(jié)分析,為青光眼動物模型的完善提供思路,以便能更好地應用于后續(xù)的研究中。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

在中國知網(wǎng)、PubMed 中以“青光眼” “動物模型”為主題詞進行檢索,鎖定檢索年限2012 年11 月1日~2022 年11 月2 日的期刊文獻建立數(shù)據(jù)庫,共檢索出1088 篇文獻。

1.2 納入標準

選擇“青光眼”動物模型應用研究相關(guān)的實驗性文獻,篩選造模方法完整及實驗過程清晰的文章,最終篩選得到符合標準的400 篇文獻。

1.3 排除標準

排除造模方法不全;會議、報紙、碩博士學位論文、綜述等文獻及青光眼相關(guān)體外實驗。

1.4 數(shù)據(jù)規(guī)范

實驗動物名稱、種類等均參照《實驗動物和動物實驗技術(shù)》[6]進行規(guī)范總結(jié)。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

將納入標準的400 篇文獻的實驗動物種類、性別、造模方法、檢測指標等數(shù)據(jù)錄入Excel 表,建立青光眼動物模型數(shù)據(jù)庫。 使用Excel 2019 進行統(tǒng)計學處理與分析。

2 結(jié)果

2.1 青光眼模型動物種系應用情況

將涉及青光眼動物模型的400 篇文獻中的實驗動物進行分類,總頻次為400。 總共24 類動物,最多的為C57BL/6J 小鼠(86 次;21.50%)、SD 大鼠(58 次;14.50%)、DBA/2J 小鼠(49 次;12.25%),具體見圖1。

圖1 青光眼動物模型實驗動物種類及頻次Figure 1 Species and frequency of experimental animals in animal model of glauco

本研究中,通過統(tǒng)計得到青光眼造模動物主要為鼠類。 主要原因是:嚙齒類動物的眼睛和人類的眼睛有許多重要的生物學相似性[7]。 其中小鼠占比較高。 研究表明C57BL/6J 小鼠的視網(wǎng)膜更易損傷,視網(wǎng)膜厚度減少,血管損傷更嚴重[8]。 DBA/2J小鼠青光眼模型是一種近交系,隨著年齡的增長逐漸發(fā)展為青光眼樣異常。 在前房,小鼠出現(xiàn)一種色素分散綜合征,其主要作用是炎癥反應,導致眼壓升高。 DBA/2J 小鼠有兩種不同的表型:虹膜色素分散(可能與DBA/2J 眼睛的免疫功能障礙有關(guān))和虹膜色素轉(zhuǎn)移(可能與虹膜色素轉(zhuǎn)移有關(guān))[9]。

2.2 青光眼模型動物性別分布情況

將400 篇文獻中所涉及的實驗動物性別進行分類規(guī)范,統(tǒng)計得出模型動物性別分布,有38 例未對動物性別做出標記,明確標明性別的雄性動物150 例、占37.50%;雌雄各半動物90 例、占22.50%;雌性動物67 例、占16.75%;雌雄不限動物55 例、占13.75%。 上述結(jié)果顯示,動物性別以雄性居多,Ha 等[10]研究發(fā)現(xiàn)雄激素睪酮可能與青光眼的發(fā)病機制有關(guān)。

2.3 青光眼模型造模方法

統(tǒng)計400 篇文獻中使用的青光眼模型造模方法,共有12 種造模方法。 前房注射物質(zhì)誘導型(127次;31.75%),轉(zhuǎn)基因型(104 次;26.00%)、激光光凝誘導型(56 次;14.00%)最多。 前房注射物質(zhì)誘導型以微球注射前房(90 次;22.50%)、水凝膠注射(25 次;6.25%)較多;激光光凝誘導型以氬激光光凝小梁網(wǎng)(30 次;7.50%)、二極管激光光凝角鞏膜緣和上鞏膜靜脈(18 次;4.50%)較多。 詳細造模情況見表1。

表1 青光眼動物模型造模方法及頻次Table 1 Method and frequency of animal model of glaucoma

從造模方法選擇方面,前房注射物質(zhì)誘導型為使用最多的方法,其中以微球注射前房最多,其次為轉(zhuǎn)基因型、激光光凝誘導型。 眼壓升高是青光眼的主要危險因素,因此開發(fā)和使用眼壓升高的動物模型進行青光眼研究是有意義的。 在前房注入聚苯乙烯微珠(微球),是導致眼壓升高、房水流出的主要物理阻塞[28]。 DBA/2J 小鼠和其他轉(zhuǎn)基因模型與人類青光眼有許多相似之處,不同個體眼壓升高、視網(wǎng)膜和視神經(jīng)損傷的反應較為一致,個體差異較小。 而且轉(zhuǎn)基因動物有助于識別各基因之間的相互作用[29]。 激光光凝誘導型以與氬激光光凝小梁網(wǎng)、二極管激光光凝角鞏膜緣和上鞏膜靜脈較多。 相比氬激光,二極管激光產(chǎn)生更深更大的斑尺寸病變,導致小梁網(wǎng)損傷更大,眼壓升高明顯[30]。鞏膜上靜脈高滲鹽水是以硬化小梁網(wǎng),增加房水流出阻力,從而達到升高眼壓的作用,但是此方法操作難度大,眼壓升高不穩(wěn)定,需要重復注射[31]。 鞏膜上靜脈烙閉誘導型比激光光凝法侵入性更小,且不會引起前房并發(fā)癥。 由于具有的其有效性和可及性,實驗性青光眼的大多數(shù)結(jié)構(gòu)和功能研究都使用了這種方法。 該模型中的眼壓升高被認為涉及到流出阻力增加[32]。 環(huán)角鞏膜緣縫合是一種簡單、微創(chuàng)、經(jīng)濟有效的造模方法,可誘導大鼠和小鼠的眼壓升高,損傷神經(jīng)節(jié)細胞[33]。 前房穿刺法與植管法均能成功建立大鼠青光眼濾過手術(shù)動物模型,且植管法更有利于觀察濾過泡形態(tài)及瘢痕形成情況,也可用于青光眼術(shù)后抗瘢痕相關(guān)研究[34]。 視神經(jīng)損傷模型是引起RGCs 凋亡的青光眼研究常用的動物模型。 它可以在模擬視神經(jīng)損傷的病理變化的同時,不影響視網(wǎng)膜動脈、靜脈功能和血液供應[35]。類固醇誘導的高眼壓青光眼動物模型價格低廉且無創(chuàng),但是與人類解剖學有差異[36]。 各種自發(fā)性青光眼模型前后已經(jīng)在不同的動物物種中被描述過。這些動物物種包括兔子、狗、猴子、小鼠、大鼠和貓。被研究的這些模型為青光眼的病理生理學提供了有價值的信息[37]。

2.4 青光眼動物模型檢測指標

統(tǒng)計納入標準的400 篇文獻中青光眼動物模型的檢測指標,若檢測指標為同一個組織的多個同類型指標,則歸為一類,不再分開統(tǒng)計,如血清中同時檢測CRP、PCT、IL-1 和IL-6 水平等,則把這些指標統(tǒng)稱為血清指標,同一實驗只計入一次。 統(tǒng)計結(jié)果表明,400 篇實驗文獻涵蓋種不同的指標類型,累計頻數(shù)818 次。 其中檢測較多的指標為眼壓測量、組織病理(視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、眼球、房角)、蛋白質(zhì)印跡分析(視網(wǎng)膜、眼睛、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)、β-肌動蛋白、免疫球蛋白G、RhoA、ROCK、Caspase-3)、免疫組化(視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜視神經(jīng)節(jié)、視神經(jīng)、眼睛、腦、纖連蛋白、α 平滑肌肌動蛋白)、RGCs 計數(shù)、實時熒光定量、視網(wǎng)膜電圖、光學相干斷層掃描CT(眼睛、視網(wǎng)膜)等。 檢測指標分類使用頻率(每種頻率通過四舍五入,保留小數(shù)點后兩位),見表2。

表2 模型檢測指標及使用頻率Table 2 Model detection indicators and usage frequency

高頻的青光眼動物模型檢測指標為眼壓測量占22.49%,組織病理檢查占12.59%,蛋白免疫印跡法檢查占12.22%,免疫組化檢查占11.98%,RGCs 計數(shù)占9.41%、實時熒光定量占7.70%、視網(wǎng)膜電圖占4.77%,是評價青光眼動物模型成功的重要指標。 在臨床治療中,眼壓測量和視網(wǎng)膜形態(tài)是患者疾病發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的重要參考依據(jù),因此在未來的動物模型應用中,建議將眼壓測量和視網(wǎng)膜形態(tài)改變作為重要指標考察,并參照臨床檢測標準制定符合青光眼動物模型的檢測指標。

3 模型成功標準

目前,西醫(yī)對于青光眼動物模型評價指標以病理指標、表觀指標為主,經(jīng)過對近10 年青光眼動物實驗統(tǒng)計分析擬定青光眼動物模型制備成功判斷標準。 具體見表3。

表3 青光眼動物模型成功判斷標準Table 3 Criteria for successful judgment of animal models of glaucoma

4 討論

青光眼是一種視神經(jīng)病變,包括一系列神經(jīng)退行性疾病,最終由于RGC 功能障礙和退行性病變導致不可逆失明。 青光眼屬于中醫(yī)“五風內(nèi)障”的范疇,其代表不同的青光類型,綠風內(nèi)障相當于原發(fā)性閉角型青光眼(primary angle-closure glaucoma,PACG),而青風內(nèi)障類似于原發(fā)性開角型青光眼(primary open-angle glaucoma, POAG)[38]。 本病的發(fā)生與臟腑、氣、血、津液紊亂密切相關(guān)[39]。 目前青光眼的臨床護理標準是通過藥物或手術(shù)方法降低IOP 治療;然而,即使IOP 得到充分控制,眼壓降低也不足以阻止患者的進行性視野喪失[40]。 因此,迫切需要開發(fā)更安全有效的青光眼治療方法[41]。 青光眼的新治療策略需要開發(fā)功能性的、可重復的、易于使用的、低成本的動物模型用于臨床前研究。此外,這些模型應該模擬人類青光眼過程中出現(xiàn)的情況[42]。 因此需要進一步的實驗動物研究,為治療藥物篩選奠定基礎。

綜上所述,根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示,目前研究者們較多選擇的實驗動物為C57BL/6J 小鼠,性別多為雄性,造模方法以前房注射物質(zhì)誘導型、轉(zhuǎn)基因型、激光光凝誘導型最多。 相關(guān)模型指標:檢測眼壓測量、組織病理、蛋白免疫印跡、免疫組化最多。 青光眼動物模型發(fā)病機制復雜,目前研究結(jié)果表明青光眼發(fā)病過程中涉及3 個功能類:線粒體、應激和核蛋白,表明在視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性過程中能量代謝、應激反應和基因表達改變的損傷[43]。 因此可以考慮從以上方面進行青光眼動物模型研究。 理想的青光眼動物模型應能模擬人類青光眼的形態(tài)學、病理生理學及生化指標,具有類似的生物學機制,對其治療藥物有類似的藥效反應,而以上模型尚不能達到此要求。 但從解剖結(jié)構(gòu)、生理功能及病理特點考慮,與西醫(yī)青光眼定義與診斷存在較好的吻合度。目前中醫(yī)病證結(jié)合的青光眼動物模型尚無統(tǒng)一標準,建議未來增加相關(guān)方面研究,更加有利于建立符合青光眼臨床研究特點的實驗動物模型與評估標準,將會有力推進中西醫(yī)結(jié)合治療青光眼的發(fā)展趨勢[44]。