成翕悅,李丹丹,崔 如,靖博雅,曹 巖,趙 晶,劉俊川

(1河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科,石家莊 050051;2河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院友誼院區(qū)骨一科;*通訊作者,E-mail：liujunchuansy@163.com)

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨微結(jié)構(gòu)破壞和骨質(zhì)流失為特征的常見(jiàn)骨科疾病[1]。隨著骨質(zhì)量的下降,骨的微觀(guān)結(jié)構(gòu)被破壞;隨著時(shí)間的推移,骨骼變得非常脆弱,最終,在最小的外力下就會(huì)發(fā)生骨折[2]。骨質(zhì)疏松性骨折康復(fù)期長(zhǎng),復(fù)發(fā)率高,已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[3]。治療骨質(zhì)疏松性骨折的傳統(tǒng)臨床方法包括雌激素和雙磷酸鹽的應(yīng)用,然而,這兩種藥物會(huì)引起的一些副作用,如骨痂重塑延遲和癌癥等[4]。因此,開(kāi)發(fā)高效且副作用小的藥物對(duì)于骨質(zhì)疏松性骨折愈合具有重要的意義。冬凌草甲素是一種從冬凌草中提取的四環(huán)二萜類(lèi)化合物,具有抗炎、抗癌等作用[5]。已有研究報(bào)道,冬凌草甲素可改善骨質(zhì)疏松小鼠骨礦物質(zhì)密度和骨組織形態(tài)[6]。但關(guān)于冬凌草甲素對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折的影響鮮有報(bào)道。相關(guān)研究顯示,激活聲波刺猬(sonic hedgehog,Shh)/Gli家族鋅指蛋白1(Gli family zinc finger protein 1,Gli1)通路以促進(jìn)骨形成,抑制骨吸收,可起到防止骨質(zhì)疏松癥的作用[7]。但冬凌草甲素能否通過(guò)調(diào)控Shh/Gli1信號(hào)通路影響骨質(zhì)疏松大鼠骨折愈合尚不明確。因此,本研究主要探究冬凌草甲素對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨折愈合的影響以及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

72只7周齡、體質(zhì)量為200～210 g的SPF級(jí)雌性SD大鼠購(gòu)自上海泰楚生物技術(shù)有限公司,許可證號(hào)：SCXK(滬)2023-0001。本研究獲得本院動(dòng)物倫理委員會(huì)(KSD2023-043-1)的批準(zhǔn),所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合3R原則。

1.2 主要試劑

冬凌草甲素購(gòu)自武漢遠(yuǎn)啟醫(yī)藥化工有限公司;戊酸雌二醇購(gòu)自武漢東康源科技有限公司;Shh/Gli1信號(hào)通路抑制劑環(huán)巴胺購(gòu)自艾美捷科技有限公司;大鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)ELISA試劑盒購(gòu)自上海雙贏(yíng)生物科技有限公司;兔源一抗堿性磷酸酶(alkaline phosphatase?,ALP)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt related transcription factor 2,Runx2)、Shh、Gli1、GAPDH及辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3 骨質(zhì)疏松性骨折大鼠模型的構(gòu)建

腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,俯臥位固定、皮膚消毒后,在背部正中行縱切口,分離并切除后腹膜外雙側(cè)卵巢,縫合切口。通過(guò)檢測(cè)骨密度篩選骨質(zhì)疏松大鼠。骨質(zhì)疏松大鼠造模成功率為100%。術(shù)后1周后進(jìn)行右側(cè)股骨干骨折髓內(nèi)固定術(shù),簡(jiǎn)言之,麻醉大鼠,在大鼠右大腿外側(cè)行縱行切口,分離并鋸斷股骨中段,將克氏針固定在髓腔內(nèi),縫合傷口,以構(gòu)建骨質(zhì)疏松性骨折大鼠模型[8]。

1.4 動(dòng)物分組及給藥

按照隨機(jī)數(shù)字表法將72只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、冬凌草甲素低劑量組、冬凌草甲素高劑量組、戊酸雌二醇組、冬凌草甲素高劑量+環(huán)巴胺組,每組12只。對(duì)照組大鼠僅切除卵巢周?chē)糠种窘M織,不切除雙側(cè)卵巢,術(shù)后1周后行右側(cè)股骨干骨折髓內(nèi)固定術(shù)。其余各組大鼠均采用雙側(cè)卵巢切除術(shù)聯(lián)合右側(cè)股骨干骨折髓內(nèi)固定術(shù)的方法構(gòu)建骨質(zhì)疏松性骨折大鼠模型。建模成功24 h后,進(jìn)行給藥處理,冬凌草甲素低劑量組、冬凌草甲素高劑量組、戊酸雌二醇組大鼠分別需灌胃2.2 mg/kg冬凌草甲素、6.66 mg/kg冬凌草甲素[9]、9 mg/kg戊酸雌二醇[10],且均需腹腔注射等體積的生理鹽水;冬凌草甲素高劑量+環(huán)巴胺組大鼠需灌胃6.66 mg/kg冬凌草甲素且還需腹腔注射3.33 mg/kg環(huán)巴胺[11];對(duì)照組、模型組大鼠均需灌胃且腹腔注射等量的生理鹽水,給藥1次/d,持續(xù)4周。

1.5 標(biāo)本收集

末次處理24 h后,每組選取全部大鼠,2%戊巴比妥鈉麻醉所有大鼠以進(jìn)行X射線(xiàn)檢測(cè)評(píng)估大鼠骨折愈合情況;然后收集大鼠的腹主動(dòng)脈血經(jīng)離心得血清用于ELISA實(shí)驗(yàn);血液收集完成后,處死大鼠,分離并收集大鼠完整的右股骨,分為兩部分,每部分包含6只大鼠的股骨,一部分用于三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn),三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取股骨骨痂組織凍存于-80 ℃用于Western blot實(shí)驗(yàn);另一部分用于雙能X線(xiàn)骨密度掃描儀檢測(cè),骨密度檢測(cè)結(jié)束后,截取股骨骨痂組織用于HE-阿爾新藍(lán)染色。

1.6 X射線(xiàn)檢測(cè)評(píng)估大鼠骨折愈合

利用X射線(xiàn)照射大鼠右側(cè)股骨骨折處以評(píng)估大鼠骨折愈合情況。

1.7 ELISA法檢測(cè)大鼠血清中TNF-α、IL-6水平

嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)大鼠血清中TNF-α、IL-6水平。

1.8 三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠股骨最大載荷、最大位移

固定大鼠完整的右股骨,使用力學(xué)測(cè)試裝置進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)[12],參數(shù)設(shè)置為：支點(diǎn)跨距20 mm,加載速度2 mm/min,施加壓力直至骨頭斷裂,最后通過(guò)計(jì)算機(jī)計(jì)算最大載荷、最大位移。

1.9 雙能X線(xiàn)骨密度掃描儀檢測(cè)大鼠股骨骨密度

利用雙能X線(xiàn)骨密度掃描儀檢測(cè)大鼠股骨骨密度。

1.10 HE染色檢測(cè)大鼠骨痂組織病理變化

截取股骨骨痂組織,浸入20%乙二胺四乙酸溶液中進(jìn)行脫鈣處理。將脫鈣樣品包埋在石蠟中,切成厚度為5 μm的切片,并用HE-阿爾新藍(lán)染色。使用光學(xué)顯微鏡對(duì)股骨骨痂組織的染色切片進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估。

1.11 Western blot檢測(cè)大鼠骨痂組織中ALP、Runx2、Shh、Gli1蛋白表達(dá)

利用RIPA裂解緩沖液提取大鼠骨痂組織總蛋白。將蛋白進(jìn)行定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,將膜與一抗ALP(1∶4 000)、Runx2(1∶4 000)、Shh(1∶3 000)、Gli1(1∶3 000)、GAPDH(1∶3 000)在4 ℃下孵育過(guò)夜。再將膜與二抗(1∶2 000)共同孵育1 h。加入ECL試劑可視化蛋白,利用Image J軟件評(píng)估目的蛋白灰度值。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素對(duì)大鼠骨折愈合的影響

對(duì)照組大鼠骨折端有連續(xù)性骨痂生長(zhǎng),骨折線(xiàn)消失;模型組大鼠骨折端未見(jiàn)骨痂生長(zhǎng),骨折線(xiàn)清晰可見(jiàn);與模型組比較,冬凌草甲素低劑量組、冬凌草甲素高劑量組、戊酸雌二醇組大鼠骨折端可見(jiàn)骨痂生長(zhǎng),骨折線(xiàn)模糊不清;與冬凌草甲素高劑量組比較,冬凌草甲素高劑量+環(huán)巴胺組大鼠骨折端骨痂生長(zhǎng)較少,骨折線(xiàn)較清晰(見(jiàn)圖1)。

圖1 大鼠股骨骨折X線(xiàn)表現(xiàn)Figure 1 X-ray of femoral fracture in rats

2.2 冬凌草甲素對(duì)大鼠血清中TNF-α和IL-6水平變化的影響

與對(duì)照組比較,模型組大鼠血清中TNF-α和IL-6水平升高(P<0.05);與模型組比較,冬凌草甲素低劑量組、冬凌草甲素高劑量組和戊酸雌二醇組大鼠血清中TNF-α和IL-6水平降低(P<0.05);冬凌草甲素高劑量組和戊酸雌二醇組大鼠血清中TNF-α和IL-6水平變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與冬凌草甲素高劑量組比較,冬凌草甲素高劑量+環(huán)巴胺組大鼠血清中TNF-α和IL-6水平升高(P<0.05,見(jiàn)表1)。

表1 各組大鼠血清中TNF-α和IL-6水平變化比較n=12,ng/L)

2.3 冬凌草甲素對(duì)大鼠股骨最大載荷和最大位移的影響

與對(duì)照組比較,模型組大鼠股骨最大載荷和最大位移降低(P<0.05);與模型組比較,冬凌草甲素低劑量組、冬凌草甲素高劑量組和戊酸雌二醇組大鼠股骨最大載荷和最大位移升高(P<0.05);冬凌草甲素高劑量組與戊酸雌二醇組大鼠股骨最大載荷和最大位移變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與冬凌草甲素高劑量組比較,冬凌草甲素高劑量+環(huán)巴胺組大鼠股骨最大載荷和最大位移降低(P<0.05,見(jiàn)表2)。

表2 各組大鼠股骨最大載荷和最大位移變化比較n=6)

2.4 冬凌草甲素對(duì)大鼠股骨骨密度的影響

與對(duì)照組比較,模型組大鼠股骨的骨密度降低(P<0.05);與模型組比較,冬凌草甲素低劑量組、冬凌草甲素高劑量組和戊酸雌二醇組大鼠股骨的骨密度升高(P<0.05);冬凌草甲素高劑量組與戊酸雌二醇組大鼠股骨骨密度的變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與冬凌草甲素高劑量組比較,冬凌草甲素高劑量+環(huán)巴胺組大鼠股骨的骨密度降低(P<0.05,見(jiàn)表3)。

表3 各組大鼠股骨的骨密度變化比較

2.5 冬凌草甲素對(duì)大鼠骨痂組織病理變化的影響

對(duì)照組大鼠骨小梁排列整齊,結(jié)構(gòu)完整;模型組大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂,間隙大,數(shù)量少且形態(tài)較細(xì),血腫尚未完全機(jī)化;與模型組比較,冬凌草甲素低劑量組、冬凌草甲素高劑量組和戊酸雌二醇組大鼠骨小梁排列較密集,間隙小,數(shù)量多且較粗;與冬凌草甲素高劑量組比較,冬凌草甲素高劑量+環(huán)巴胺組大鼠骨小梁變細(xì),結(jié)構(gòu)疏松(見(jiàn)圖2)。

藍(lán)色為血腫部分;黑色箭頭指示為骨小梁圖2 HE-阿爾新藍(lán)染色檢測(cè)大鼠骨痂組織病理變化 (×200)Figure 2 Pathological changes of rat callus by HE-Alcianblue staining (×200)

2.6 冬凌草甲素對(duì)大鼠骨痂組織中成骨關(guān)鍵蛋白及Shh/Gli1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較,模型組大鼠骨痂組織中ALP、Runx2、Shh和Gli1蛋白表達(dá)降低(P<0.05);與模型組比較,冬凌草甲素低劑量組、冬凌草甲素高劑量組和戊酸雌二醇組大鼠骨痂組織中ALP、Runx2、Shh和Gli1蛋白表達(dá)升高(P<0.05);冬凌草甲素高劑量組與戊酸雌二醇組hesi大鼠骨痂組織中ALP、Runx2、Shh和Gli1蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與冬凌草甲素高劑量組比較,冬凌草甲素高劑量+環(huán)巴胺組大鼠骨痂組織中ALP、Runx2、Shh和Gli1蛋白表達(dá)降低(P<0.05,見(jiàn)圖3和表4)。

圖3 Western blot檢測(cè)各組大鼠骨痂組織中ALP、Runx2、Shh、Gli1蛋白表達(dá)Figure 3 Expressions of ALP, Runx2, Shh and Gli1 proteins in callus tissue of rats in each group by Western blot

表4 各組大鼠骨痂組織中ALP、Runx2、Shh、Gli1蛋白表達(dá)比較

3 討論

骨質(zhì)疏松性骨折是骨質(zhì)疏松癥最嚴(yán)重的并發(fā)癥,其發(fā)病率和死亡率高,嚴(yán)重影響中老年人的健康和生活質(zhì)量[13]。骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程,主要受力學(xué)穩(wěn)定性和骨折區(qū)周?chē)h(huán)境的影響[14]。骨折部位的局部骨折微環(huán)境富含多種細(xì)胞、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子,這是骨和軟組織修復(fù)所必需的[15]。當(dāng)骨折微環(huán)境的內(nèi)穩(wěn)態(tài)被破壞時(shí),如TNF-α和IL-6過(guò)度積累引起的炎癥反應(yīng),可導(dǎo)致骨折愈合延遲甚至骨不愈合[16,17]。因此,通過(guò)抑制TNF-α和IL-6來(lái)緩解炎癥反應(yīng)對(duì)于骨折愈合至關(guān)重要。在本項(xiàng)研究中,首先采用雙側(cè)卵巢切除術(shù)聯(lián)合右側(cè)股骨干骨折髓內(nèi)固定術(shù)的方法構(gòu)建骨質(zhì)疏松性骨折大鼠模型,結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠股骨最大載荷、最大位移、骨密度降低,骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂,間隙大,數(shù)量少且形態(tài)較細(xì),骨折端未見(jiàn)骨痂生長(zhǎng),骨折線(xiàn)清晰可見(jiàn),符合骨質(zhì)疏松性骨折的病理特征。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,模型組大鼠血清中TNF-α和IL-6水平升高,表明炎癥反應(yīng)參與了大鼠骨質(zhì)疏松性骨折過(guò)程。另有研究表明,ALP是成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志物,其在骨折中呈下調(diào)表達(dá)[18];Runx2作為早期成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子,其突變會(huì)誘導(dǎo)骨骼發(fā)育異常[19]。因此,本研究檢測(cè)了骨痂組織中成骨相關(guān)蛋白ALP、Runx2的表達(dá),結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠骨痂組織中ALP、Runx2蛋白表達(dá)降低,表明骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨生長(zhǎng)受到抑制。因此,減輕炎癥反應(yīng)、促進(jìn)骨生長(zhǎng)可能成為改善骨質(zhì)疏松性骨折的有效策略之一。

冬凌草甲素是東亞草藥中常用的二萜類(lèi)天然產(chǎn)物,因其具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、預(yù)防肝纖維化等廣泛的生物活性,正日益受到生物醫(yī)學(xué)界的關(guān)注[20]。據(jù)報(bào)道,冬凌草甲素可改善小鼠炎癥誘導(dǎo)的骨質(zhì)流失[9];冬凌草甲素可在體外水平上促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[21];冬凌草甲素能夠有效降低糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的大鼠股骨頸骨折風(fēng)險(xiǎn)[22]。本研究結(jié)果與其是一致的,本研究顯示,冬凌草甲素可增加骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨密度,減輕炎癥反應(yīng),促進(jìn)骨生長(zhǎng),進(jìn)而促進(jìn)骨折愈合,且冬凌草甲素劑量越高,骨折愈合能力越強(qiáng)。另有研究報(bào)道,戊酸雌二醇是臨床上常用于治療骨質(zhì)疏松性骨折的常用藥物[23],本研究以該藥物為陽(yáng)性藥物,結(jié)果顯示,高劑量冬凌草甲素與戊酸雌二醇對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨折愈合的促進(jìn)作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示冬凌草甲素可能成為治療骨質(zhì)疏松性骨折的潛在有效藥物之一。

Shh/Gli1信號(hào)通路可調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的所有階段以及許多組織和器官的產(chǎn)生,該通路的激活可促進(jìn)骨形成[24]。已有研究報(bào)道,激活Shh/Gli1信號(hào)通路可改善糖皮質(zhì)性骨質(zhì)疏松模型大鼠成骨[25]。本研究顯示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠骨痂組織中Shh、Gli1蛋白表達(dá)降低,大鼠骨質(zhì)疏松性骨折嚴(yán)重,表明Shh/Gli1信號(hào)通路的抑制參與了大鼠骨質(zhì)疏松性骨折過(guò)程。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),冬凌草甲素可上調(diào)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨痂組織中Shh、Gli1蛋白表達(dá),且冬凌草甲素劑量越高,上調(diào)作用越明顯,推測(cè)冬凌草甲素可能通過(guò)激活Shh/Gli1信號(hào)通路促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠骨折愈合。為了驗(yàn)證該推測(cè),本研究在高劑量冬凌草甲素作用的基礎(chǔ)上再加上Shh/Gli1信號(hào)通路抑制劑環(huán)巴胺來(lái)干預(yù)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠,結(jié)果顯示,環(huán)巴胺減弱了高劑量冬凌草甲素對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨折愈合的促進(jìn)作用。證實(shí)了猜想的正確性,即冬凌草甲素可能通過(guò)激活Shh/Gli1信號(hào)通路促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠骨折愈合。此外,有研究顯示,Shh/Gli1信號(hào)通路的上調(diào)可促進(jìn)二甲雙胍誘導(dǎo)的人牙周韌帶干細(xì)胞成骨,表現(xiàn)為ALP、Runx2表達(dá)升高[26];Shh/Gli1信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)控TNF-α、IL-6等炎性因子的表達(dá)抑制煙霧誘導(dǎo)小鼠的氣道炎癥反應(yīng)[27]。表明Shh/Gli1信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)控ALP、Runx2、TNF-α、IL-6表達(dá)影響成骨及炎癥反應(yīng)。結(jié)合本研究結(jié)果,提示冬凌草甲素可能通過(guò)激活Shh/Gli1信號(hào)通路下調(diào)TNF-α和IL-6表達(dá)抑制炎癥,上調(diào)ALP和Runx2表達(dá)促進(jìn)成骨,進(jìn)而促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠骨折愈合。

綜上所述,冬凌草甲素可能通過(guò)激活Shh/Gli1信號(hào)通路促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠骨折愈合。冬凌草甲素促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠骨折愈合的機(jī)制較為復(fù)雜,具體通過(guò)Shh/Gli1信號(hào)通路下游的哪些蛋白來(lái)發(fā)揮作用有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究。