朱文娟,周 菲,費(fèi)素娟

(1徐州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院消化內(nèi)鏡重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,徐州 221004;2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科;*通訊作者,E-mail：xyfyfeisj99@163.com)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展,腸-腦互動(dòng)紊亂性疾病IBS等的發(fā)病比例增加,成為消化專(zhuān)科的巨大臨床挑戰(zhàn)[1,2]。腸-腦互動(dòng)機(jī)制研究揭示：特定腦區(qū)的炎癥反應(yīng)和功能改變與腸道微環(huán)境變化和腸黏膜屏障功能損傷是互為因果的核心機(jī)制[3]。應(yīng)激是引發(fā)腸腦互動(dòng)特定腦區(qū)炎癥反應(yīng)和功能改變的重要因素,其中涉及下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)[4]、免疫系統(tǒng)[5]和腦-腸-微生物軸[6]等多條途徑。腸黏膜屏障損傷即“微腸漏”,是腸腔微環(huán)境中的條件致病因素與宿主防御機(jī)制之間攻防紊亂致不同程度腸黏膜炎癥,可影響特定腦區(qū)功能性或病理性改變,使內(nèi)臟高敏感效應(yīng)增強(qiáng)[7]。精神應(yīng)激與“微腸漏”互為因果關(guān)系[8],在精神應(yīng)激致特定腦區(qū)高耗能狀態(tài)下,更易遭受“微腸漏”打擊,引發(fā)炎癥等病理改變,加劇功能異常。結(jié)合中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究鎖定,小膠質(zhì)細(xì)胞是促發(fā)特定腦區(qū)炎癥的關(guān)鍵[9]。但應(yīng)激和腸黏膜屏障損傷引發(fā)特定腦區(qū)炎癥反應(yīng)的機(jī)制并不明確,可干預(yù)的分子靶點(diǎn)也未鎖定。本研究通過(guò)公共基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus,GEO)中IBS患者及健康對(duì)照者的直腸結(jié)腸活檢樣本、十二指腸空腸活檢樣本的芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析,并利用皮質(zhì)酮(corticosterone,Cort)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、Cort疊加LPS構(gòu)建應(yīng)激、炎癥、應(yīng)激疊加炎癥的小膠質(zhì)細(xì)胞模型來(lái)模擬IBS的發(fā)生發(fā)展,驗(yàn)證DEGs在IBS中的表達(dá),旨在研究參與IBS發(fā)生的關(guān)鍵通路/基因,進(jìn)一步了解IBS的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 表達(dá)譜數(shù)據(jù)來(lái)源,數(shù)據(jù)處理及標(biāo)準(zhǔn)化

設(shè)定“irritable bowel syndrome”或“IBS”為檢索關(guān)鍵詞,“Homo sapiens”為研究對(duì)象,“Expression profiling by array”為研究類(lèi)型,從中選取近年且數(shù)據(jù)集包含樣本量較大的數(shù)據(jù)集GSE36701和GSE166869。GSE36701數(shù)據(jù)集包含221例樣本,選取其中IBS患者直腸結(jié)腸活檢樣本87例,健康對(duì)照直腸結(jié)腸活檢樣本40例。GSE166869數(shù)據(jù)集包含69例樣本,選取其中IBS患者十二指腸空腸活檢樣本43例,健康對(duì)照十二指腸空腸活檢樣本26例。從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載經(jīng)過(guò)預(yù)處理、標(biāo)準(zhǔn)化及l(fā)og2轉(zhuǎn)化的基因探針表達(dá)矩陣,通過(guò)探針號(hào)和Gene symbol的依次對(duì)應(yīng),去除沒(méi)有對(duì)應(yīng)到Gene symbol的探針,當(dāng)1個(gè)基因由多個(gè)探針匹配時(shí),采用中位數(shù)進(jìn)行替換,進(jìn)一步得到表達(dá)譜數(shù)據(jù)集的基因樣本信息?；虮磉_(dá)矩陣需要進(jìn)一步完成標(biāo)準(zhǔn)化步驟以消除樣本之間差異,通過(guò)Sangerbox軟件(http：//sangerbox.com/Tool)中的數(shù)據(jù)處理工具對(duì)基因表達(dá)矩陣完成分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化,從而得到標(biāo)準(zhǔn)化后基因表達(dá)矩陣。

1.2 DEGs篩選

用R語(yǔ)言limma軟件包對(duì)GSE166869和GSE36701數(shù)據(jù)集進(jìn)行IBSvsHC基因表達(dá)差異分析,所有基因經(jīng)過(guò)分析后得到相應(yīng)的P值,選取差異表達(dá)閾值P<0.05且|log2FC|>0.263的基因作為DEGs。對(duì)2個(gè)數(shù)據(jù)集差異基因取交集用于后續(xù)分析。用R語(yǔ)言的軟件包ggplot2、ggpubr、ggthemes、pheatmap對(duì)DEGs分別以火山圖和熱圖形式進(jìn)行可視化呈現(xiàn)。

1.3 基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)

GSEA是判斷基因集在不同生物狀態(tài)中是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義、一致性差異的。把GSE36701和GSE166869的標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)矩陣文件和樣本分組文件引入Sangerbox軟件GSEA簡(jiǎn)易分析工具,樣本分類(lèi)包括IBS組和HC組,背景數(shù)據(jù)庫(kù)選用的是KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)。軟件按照算法計(jì)算富集分?jǐn)?shù)(ES),標(biāo)準(zhǔn)富集分?jǐn)?shù)(NES),標(biāo)準(zhǔn)化的顯著性水平,糾正多重假設(shè)檢驗(yàn)。

1.4 基因本體論(gene ontology,GO)和KEGG分析

GO分析提供不同生物基因功能的信息,可研究DEGs功能及特性。GO包括：細(xì)胞組件(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)、生物學(xué)過(guò)程(biological process,BP)。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)用于細(xì)胞通路的預(yù)測(cè)。將DEGs輸入到富集分析工具g：profiler(https：//biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost)中進(jìn)行GO和KEGG富集分析,數(shù)據(jù)來(lái)源設(shè)定為GO cellular component, GO molecular function, GO biological process和KEGG,分析標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為調(diào)整后P<0.05。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵基因的篩選

交互式基因恢復(fù)工具(STRING)可評(píng)估功能基因組學(xué)數(shù)據(jù)。將DEGs導(dǎo)入STRING(http：string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析。選擇的物種是homo sapiens,篩選combined score>0.4的蛋白,導(dǎo)入Cytascape軟件并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用CitoHubba插件,根據(jù)Degree算法,篩選關(guān)鍵基因(hub genes)。

1.6 上調(diào)的DEGs與疾病、藥物的相關(guān)分析

將上調(diào)的共有差異表達(dá)基因分別導(dǎo)入基因富集分析工具WebGestalt中的Disgenet(https：//www.disgenet.org/)、DrugBank(https：//go.drugbank.com/)數(shù)據(jù)庫(kù),通過(guò)ORA富集方法分析,設(shè)定P<0.05為富集結(jié)果。

1.7 細(xì)胞與分組處理

細(xì)胞及主要試劑：BV2神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基購(gòu)于武漢普諾賽生物科技有限公司,脂多糖、皮質(zhì)酮均購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司,一抗(Pellino-1、SHARPIN、TLR4、NF-κB p65、IκBα、TNF-α、IL-1β)均購(gòu)于英國(guó)Abcam公司,BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Trizol均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司,TNF-α、IL-6、CRP ELISA試劑盒均購(gòu)于武漢云克隆科技股份有限公司,PCR引物由徐州偉沃生物科技有限公司合成。

本研究分為正常對(duì)照組、LPS組、Crot組、LPS+Cort組。正常對(duì)照組在80%～90%融合度的BV2神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞中加入適當(dāng)體積培養(yǎng)基,LPS組和Cort組加入分別含1 μg/ml LPS、50 nmol/L Cort的同體積培養(yǎng)基刺激4～6 h。LPS+Cort組加入同時(shí)含1 μg/ml LPS和50 nmol/L Cort的同體積培養(yǎng)基刺激4～6 h。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.8 實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)檢測(cè)GABRE、MICALL2、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β的表達(dá)

收集處理后的各組細(xì)胞,用Trizol提取總RNA,分離mRNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,PCR擴(kuò)增目的基因,計(jì)算ΔCt值,以2-ΔΔCt法分析處理。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,共40個(gè)循環(huán)。引物序列如下：GABRE上游引物為5′-CTTCAATGTAAGCAGGAGG-3′,下游引物為5′-GATAGGAGACACGAGGGA-3′;MICALL2上游引物為5′-TCACGCCGCAAGAAACTA-3′,下游引物為5′-CAAGGTCATTGTCCAGGATT-3′;TLR4上游引物為5′-AGCTCCTGACCTTGGTCTTG-3′,下游引物為5′-CGCAGGGGAACTCAATGAGG-3′;NF-κB p65上游引物為5′-ACTGCCGGGATGGCTACTAT-3′,下游引物為5′-TCTGGATTCGCTGGCTAATGG-3′;IκBα上游引物為5′-GGTCTCGCTCCTGTTGAAGTGTG-3′,下游引物為5′-TCCGTGTCATAGCTCTCCTCATCC-3′;TNF-α上游引物為5′-CTGAACTTCGGGGTGATCGG-3′,下游引物為5′-GGCTTGTCACTCGAATTTTGAGA-3′;IL-1β上游引物為5′-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3′,下游引物為5′-TGGATGCTCTCATCAGGACAG-3′。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.9 免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)GABRE、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α和IL-1β的表達(dá)

向處理后的細(xì)胞中加入RIPA裂解液,提取總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度。配制7.5% SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳,蛋白上樣量為10 μg,70 V恒壓電泳2 h,濕轉(zhuǎn)法400 mA恒流快速電轉(zhuǎn)160 min,將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,3% BSA封閉液封閉2 h。將蛋白質(zhì)條帶分別加入抗GABRE(1∶1 000)、TLR4(1∶1 000)、IκBα(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶1 000)、TNF-α(1∶800)、IL-1β(1∶800)、GAPDH(1∶1 000)一抗中,4 ℃搖床過(guò)夜,使用TBST洗滌。條帶放入與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG二抗(1∶5 000)中孵育1 h,TBST洗滌。暗室中化學(xué)發(fā)光顯影。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.10 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TNF-α、IL-6和CRP的表達(dá)

取處理后的細(xì)胞上清離心,設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體37 ℃水浴鍋溫育60 min。棄去液體,吸水紙上拍干,重復(fù)洗板5次,加入底物A、B后37 ℃避光孵育15 min。加入終止液在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DEGs篩選結(jié)果

根據(jù)|log2FC|>0.263,P<0.05的篩選標(biāo)準(zhǔn),GSE36701中IBS組與HC組有861個(gè)DEGs,包含447個(gè)上調(diào)基因和414個(gè)下調(diào)基因;GSE166869中IBS組與HC組有4 426個(gè)DEGs,包含117個(gè)上調(diào)基因和4 309個(gè)下調(diào)基因(見(jiàn)圖1,2)。GSE36701和GSE166869的交集基因有95個(gè),其中均上調(diào)的基因有4個(gè),均下調(diào)的基因有62個(gè)(見(jiàn)圖3)。

A. GSE36701中差異表達(dá)基因熱圖B. GSE166869中差異表達(dá)基因熱圖圖2 IBS組與HC組差異表達(dá)基因熱圖Figure 2 Heat map of differentially expressed genes between IBS group and HC group

A.兩數(shù)據(jù)集差異基因的交集 B.兩數(shù)據(jù)集上調(diào)差異基因的交集C.兩數(shù)據(jù)集下調(diào)差異基因的交集圖3 GSE36701和GSE166869的IBS組與HC組差異表達(dá)基因情況Figure 3 Differential expression of genes between IBS group and HC group in GSE36701 and GSE166869

2.2 GSEA分析結(jié)果

設(shè)定P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選,GSE36701中差異表達(dá)基因富集到帕金森病、甲狀腺癌、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和亨廷頓病(見(jiàn)圖4)。GSE166869中差異表達(dá)基因富集到P53信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞因子受體相互作用、細(xì)胞周期、n聚糖生物合成、阿爾茨海默病、錯(cuò)配修復(fù)、TOLL樣受體信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡等,設(shè)定P<0.01為富集結(jié)果篩選,取前10個(gè)富集結(jié)果進(jìn)行可視化呈現(xiàn)(見(jiàn)圖5)。

圖4 GSE36701中IBS組與HC組差異表達(dá)基因的GSEA分析圖Figure 4 GSEA analysis of differentially expressed genes between IBS group and HC group in GSE36701

2.3 GO分析和KEGG分析結(jié)果

GSE36701和GSE166869中的共有差異表達(dá)基因GO分析結(jié)果為：①在生物學(xué)過(guò)程中,主要富集于自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性調(diào)節(jié)、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)、胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、白細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性調(diào)節(jié)、蛋白激酶a信號(hào)、細(xì)胞殺傷、細(xì)胞殺傷的調(diào)節(jié)、咽弓動(dòng)脈形態(tài)發(fā)生等。②在細(xì)胞組件中,主要富集于3級(jí)顆粒腔、微絨毛、樹(shù)突膜、紡錘體、3級(jí)顆粒、神經(jīng)元投影膜、特異顆粒腔、循環(huán)內(nèi)吞體、中體、線(xiàn)粒體外膜等。③在分子功能中,主要富集于核纖層蛋白結(jié)合、氨基?；D(zhuǎn)移酶活性、MHC蛋白復(fù)合物結(jié)合、組蛋白脫乙酰酶結(jié)合、碳水化合物結(jié)合、E-box結(jié)合、蛋白激酶a結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性、分子功能激活劑活性、線(xiàn)性酰胺中作用于碳-氮(而非肽)鍵的水解酶活性等(見(jiàn)圖6)。KEGG分析結(jié)果示共有差異表達(dá)基因顯著富集于瘧疾、人T細(xì)胞白血病病毒1型感染、細(xì)胞周期、乙型肝炎、藥物代謝-細(xì)胞色素p450、細(xì)胞色素p450外源生物代謝、EB病毒感染、結(jié)直腸癌、γ-氨基丁酸能突觸等通路(見(jiàn)圖7)。設(shè)定P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選,取前10個(gè)GO富集分析結(jié)果及KEGG分析結(jié)果進(jìn)行可視化呈現(xiàn)。

圖5 GSE166869中IBS組與HC組差異表達(dá)基因的GSEA分析圖Figure 5 GSEA analysis of differentially expressed genes between IBS group and HC group in GSE166869

圖6 IBS組與HC組的共有差異表達(dá)基因GO分析結(jié)果Figure 6 GO analysis results of common differentially expressed genes in between IBS group and HC group

圖7 IBS組與HC組的共有差異表達(dá)基因KEGG分析結(jié)果Figure 7 KEGG analysis results of common differentially expressed genes between IBS group and HC group

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵基因的篩選

通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建GSE36701和GSE166869中的共有差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖8)。結(jié)果顯示中樞節(jié)點(diǎn)最高(即關(guān)鍵基因)的為CDC20、PTTG1、BIRC5、CDKN3、MYC、HIST1H2AJ、NUSAP1、HIST1H2AB、HIST1H2AE、HIST1H3C、HIST1H3B(見(jiàn)表1及圖9)。

2.5 GSE36701和GSE166869中共有上調(diào)差異表達(dá)基因與疾病、藥物分析結(jié)果

設(shè)定P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選,GSE36701和GSE166869中共有上調(diào)差異表達(dá)基因與疾病關(guān)系預(yù)測(cè)有13種疾病,前10名為：聾盲癥、原發(fā)性震顫、手術(shù)中休克、脈絡(luò)膜疾病、中暑、叢集性頭痛、虹膜疾病、食欲亢進(jìn)、貪食癥、分裂情感障礙(見(jiàn)表2)。GSE36701和GSE166869中共有上調(diào)差異表達(dá)基因與藥物關(guān)系預(yù)測(cè)有10種藥物,分別為：氟馬西尼、氟硝西泮、戊巴比妥、異氟醚、苦味毒、丙泊酚、抗焦慮藥、四氫孕酮、乙醇、核黃素(見(jiàn)表3)。

圖8 IBS組與HC組的共有差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 8 PPI network of common differentially expressed genes between IBS group and HC group

表1 IBS組與HC組的共有差異表達(dá)基因的前11個(gè)關(guān)鍵基因信息

圖9 IBS組與HC組的共有差異表達(dá)基因的前11個(gè)關(guān)鍵基因Figure 9 Top 11 hub genes of common differentially expressed genes between IBS group and HC group

表2 IBS組與HC組共有上調(diào)差異表達(dá)基因與疾病關(guān)系預(yù)測(cè)

2.6 Cort和LPS對(duì)GABRE、MICALL2、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表達(dá)的影響

qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Cort組、LPS組和LPS+Cort組小膠質(zhì)細(xì)胞中GABRE、MICALL2、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α和IL-1β的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組,且LPS+Cort組表達(dá)顯著高于Cort組和LPS組(見(jiàn)圖10)。

表3 IBS組與HC組的共有上調(diào)差異表達(dá)基因與藥物預(yù)測(cè)

與正常對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與LPS+Cort組相比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001圖10 qRT-PCR檢測(cè)Cort和LPS對(duì)細(xì)胞中GABRE、MICALL2、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α和IL-1β的影響Figure 10 Effect of Cort and LPS on GABRE,MICALL2,TLR4,IκBα,NF-κB p65,TNF-α,IL-1βin cells detected by qRT-PCR

2.7 Cort和LPS對(duì)GABRE、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表達(dá)的影響

免疫印跡法結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cort組、LPS組和LPS+Cort組細(xì)胞中GABRE、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α和IL-1β的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組,且LPS+Cort組表達(dá)顯著高于Cort組和LPS組(見(jiàn)圖11)。

2.8 Cort和LPS對(duì)細(xì)胞中TNF-α、IL-6、CRP的影響

ELISA檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cort組、LPS組和LPS+Cort組細(xì)胞中TNF-α、IL-6和CRP的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組,且LPS+Cort組表達(dá)顯著高于Cort組和LPS組(見(jiàn)圖12)。

與正常對(duì)照組相比,***P<0.001;與LPS組和Cort組相比,###P<0.001圖11 Western blot檢測(cè)Cort和LPS對(duì)細(xì)胞中GABRE、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α和IL-1β蛋白的影響Figure 11 Effect of Cort and LPS on GABRE,TLR4,IκBα,NF-κB p65,TNF-α,IL-1βin cells detected by Western blot

與正常對(duì)照組相比,***P<0.001;與LPS組和Cort組相比,###P<0.001圖12 ELISA檢測(cè)Cort和LPS對(duì)細(xì)胞中TNF-α、IL-6、CRP的影響Figure 12 Effect of Cort and LPS on TNF-α,IL-6,CRP in cells detected by ELISA

3 討論

IBS是常見(jiàn)的胃腸道疾病,影響全球數(shù)百萬(wàn)人。盡管IBS普遍存在,但機(jī)制尚不完全清楚,而腦-腸軸在IBS中發(fā)揮重要作用。有關(guān)研究表明帕金森病、阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病患者的腸道微生物群落改變,致腸黏膜、血腦屏障功能受損,使大腦積累腸道內(nèi)源性毒物和代謝物,引起腦區(qū)炎癥,造成腸腦互動(dòng)異常[10]。本研究以在GEO公共數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出的IBS相關(guān)芯片結(jié)果作為研究對(duì)象,篩選出差異表達(dá)基因,通過(guò)取交集得到共有的差異表達(dá)基因,對(duì)共有差異表達(dá)基因的GSEA分析結(jié)果顯示,IBS與帕金森病、阿爾茨海默病等相關(guān),并可激活TOLL樣受體信號(hào)通路。

腸上皮細(xì)胞的緊密連接是維持腸黏膜屏障的結(jié)構(gòu)和功能完整性所必需的。小腸微絨毛的變化會(huì)引起腸道通透性的改變。研究發(fā)現(xiàn),腸道黏膜受損致通透性增加致“微腸漏”,可促進(jìn)消化道來(lái)源的炎癥活性物質(zhì)激發(fā)特定腦區(qū)的炎癥反應(yīng)[11],是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如阿爾茲海默癥等)的發(fā)病機(jī)制之一[12,13],可進(jìn)一步造成腸腦互動(dòng)紊亂。本研究GO分析結(jié)果顯示IBS患者與健康人群共有差異表達(dá)基因可能通過(guò)影響微絨毛的結(jié)構(gòu)發(fā)揮作用。KEGG通路分析結(jié)果示共有差異表達(dá)基因顯著富集于藥物代謝-細(xì)胞色素p450、γ-氨基丁酸能突觸等通路。IBS會(huì)造成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)及其受體通過(guò)γ-氨基丁酸能突觸等途徑形成相應(yīng)變化。細(xì)胞色素p450可影響抗精神病等藥物代謝,或可作為腸腦互動(dòng)紊亂的相關(guān)治療靶點(diǎn)。

我們又進(jìn)一步對(duì)共有差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白互作分析,篩選IBS相關(guān)的關(guān)鍵基因,其中CDC20、PTTG1、BIRC5、CDKN3、MYC、NUSAP1等均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。有研究證實(shí)IBS患者與健康人群相比不會(huì)增加患腫瘤的總體風(fēng)險(xiǎn),且IBS與較低的結(jié)直腸癌死亡率相關(guān)[10]。原因可能是IBS患者更傾向于結(jié)腸鏡檢查,可早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌前病變等,更早地干預(yù)治療,降低IBS患者發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。

與此同時(shí),我們又對(duì)共有上調(diào)差異表達(dá)基因與疾病、藥物進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)共有上調(diào)差異表達(dá)基因與食欲亢進(jìn)、分裂情感障礙等相關(guān),證實(shí)了DEGs在腸-腦互動(dòng)異常疾病中發(fā)揮重要作用。共有上調(diào)差異表達(dá)基因與藥物預(yù)測(cè)中相關(guān)的藥物是氟硝西泮、抗焦慮藥等。在早期研究已表明IBS患者有精神心理異常,焦慮和抑郁癥狀突出。抗焦慮藥治療后可改善IBS患者精神障礙,減輕腹痛等癥狀[14]。

進(jìn)一步表明了精神心理因素參與IBS的發(fā)生發(fā)展,因此抗焦慮藥等是治療IBS的重要手段。

IBS患者與健康人群共有差異表達(dá)基因中有4個(gè)上調(diào)基因,其中GABRE是GABA受體,可參與IBS的病理生理過(guò)程[15],便秘型IBS患者血清中GABA減少,且下降程度與臨床癥狀相關(guān)。用含谷氨酸脫羧酶(GABA合成途徑中的限速酶)的益生菌治療,可緩解IBS患者腹痛癥狀,改善抑郁程度[16,17]。GABA是神經(jīng)抑制性遞質(zhì),可改善精神緊張,起到抗焦慮、鎮(zhèn)靜作用,IBS患者中GABA減少,與其受體GABRE結(jié)合減少,游離GABRE增加,進(jìn)一步加劇IBS患者的臨床癥狀。MICALL2主要在神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉中表達(dá),可影響多動(dòng)癥等精神疾病的臨床癥狀的發(fā)展[18],在一定程度上影響腸-腦互動(dòng),推進(jìn)IBS發(fā)生發(fā)展。

臨床實(shí)踐證明,精神心理應(yīng)激和腸黏膜低度炎癥是誘發(fā)或加重IBS癥狀的重要因素,因此,本研究利用LPS、Cort、LPS+Cort構(gòu)建炎癥、應(yīng)激、炎癥疊加應(yīng)激的小膠質(zhì)細(xì)胞模型,以此來(lái)模擬IBS的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),應(yīng)激或炎癥作用下GABRE、MICALL2、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表達(dá)上調(diào),且應(yīng)激疊加炎癥處理時(shí)有放大的炎癥反應(yīng)。相關(guān)生物信息學(xué)分析表明GABRE基因可激活NF-κB通路[19],引起炎癥反應(yīng)。本研究亦驗(yàn)證了GABRE基因可通過(guò)NF-κB通路促發(fā)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。應(yīng)激狀態(tài)下下丘腦通過(guò)HPA軸促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)釋放Cort,Cort的過(guò)度累積可誘導(dǎo)腦區(qū)炎癥反應(yīng),釋放TNF-α、IL-1β等炎癥因子,啟動(dòng)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)炎癥信號(hào)[20]。同時(shí),應(yīng)激可改變腸道微生物組成,使菌群多樣性下降。并且,應(yīng)激增加血腦屏障通透性,提高了細(xì)胞因子和腸道微生物代謝產(chǎn)物進(jìn)入大腦的機(jī)會(huì),擴(kuò)大腦區(qū)的炎癥反應(yīng)[21],使腸腦互動(dòng)異常,加劇IBS進(jìn)展。

GABRE、MICALL2基因與IBS發(fā)生發(fā)展相關(guān),是IBS治療的潛在靶標(biāo)。IBS發(fā)病機(jī)制受多種因素影響,部分基因在IBS中有關(guān)鍵作用。但是,大多數(shù)基因的功能及對(duì)IBS的確切作用仍不清楚,因此需要更多研究來(lái)確定這些基因的作用機(jī)制及基因之間的相互作用。