李 蓉,姚國敏,張 敏,王小娣

(1西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科,西安 710077;2西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科;*通訊作者,E-mail：rechelrong198222@163.com)

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)的常見并發(fā)癥,也是勞動(dòng)年齡人群不可逆轉(zhuǎn)失明的主要原因[1]。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會(huì)的報(bào)告,預(yù)計(jì)到2045年,全球糖尿病患者將達(dá)到7億人,這表明目前和未來全球DR負(fù)擔(dān)仍然非常繁重[2]。DR的病變會(huì)隨著DM病程的延長和血糖水平的增加而越來越嚴(yán)重。視網(wǎng)膜新生血管、玻璃體積血和牽拉性視網(wǎng)膜脫離可能最終導(dǎo)致視力喪失。玻璃體內(nèi)注射抗血管內(nèi)皮生長因子藥物的研究進(jìn)展為治療糖尿病性黃斑水腫和視網(wǎng)膜新生血管提供了額外的方法,并且能有效改善患者的視力結(jié)果[3,4]。然而,沉重的治療負(fù)擔(dān)和難治性疾病[5]等一系列挑戰(zhàn)仍然存在。因此,闡明DR新的病理生理機(jī)制,探索靶向其他途徑的新型藥物,可能會(huì)在一定程度上改變目前DR的治療模式[6,7]。已有研究證實(shí),高糖環(huán)境下視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡是DR的關(guān)鍵病理特征,因此減輕或阻止該事件的發(fā)生成為了治療DR的重要靶點(diǎn)[8,9]。

胃饑餓素(ghrelin)是一種肽激素,直到1999年ghrelin才被發(fā)現(xiàn)[10],因其在刺激食欲、攝食行為、能量穩(wěn)態(tài)和碳水化合物代謝方面的作用而聞名[11]。其許多潛在功能引起了人們對(duì)該激素多種臨床應(yīng)用的極大興趣,如心血管系統(tǒng)[12]、神經(jīng)系統(tǒng)[13]和眼部疾病[14]。近年來,有研究揭示了ghrelin在糖尿病中的血糖調(diào)節(jié)作用[15],細(xì)胞和動(dòng)物模型研究也提示了ghrelin對(duì)DR可能的保護(hù)作用[16],但目前關(guān)于ghrelin對(duì)DR的作用和機(jī)制的報(bào)道仍然較少。一系列研究表明,ghrelin能維持血管擴(kuò)張-血管收縮因子的平衡、抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和免疫細(xì)胞向血管損傷部位募集以及促進(jìn)血管新生,從而維持正常的內(nèi)皮功能[17]。本研究擬以視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞為對(duì)象,觀察ghrelin是否對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有抑制作用,以及是否對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激產(chǎn)生影響,以期為研究ghrelin對(duì)DR的治療作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑與儀器

人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal vascular endothelial cells,HRMECs),購自上海中喬新舟生物科技有限公司;M199細(xì)胞培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶及胎牛血清購自武漢普諾賽生命科技有限公司;胃饑餓素購自美國Glpbio公司;Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔多抗Bax抗體及Bcl-2抗體購自美國Abcam公司;兔多抗p-IRE1α、兔多抗IRE1α購自美國Invitrogen公司;兔多抗GRP78購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;兔多抗GAPDH抗體購自杭州賢至生物科技有限公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司;CO2恒溫培養(yǎng)箱(MCO-15AC型)購自日本SANYO公司;酶標(biāo)儀(Multiskan MK3型)購自美國Thermo公司;倒置顯微鏡(ECLIPSE Ts2型)購自日本Nikon公司。

1.2 細(xì)胞處理及分組

常規(guī)復(fù)蘇HRMECs細(xì)胞,轉(zhuǎn)移到含有5 ml培養(yǎng)基的離心管中,室溫1 000 r/min離心5 min,離心收集細(xì)胞;用含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素、鏈霉素)的M199培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞,接種到培養(yǎng)皿中,輕輕吹打混勻,37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞的密度達(dá)到80%時(shí),按1∶3的比例傳代細(xì)胞。將生長良好的細(xì)胞分為對(duì)照組、高糖組、高糖+ghrelin組和高糖+ghrelin+衣霉素組。對(duì)照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng),高糖組在M199培養(yǎng)基中加入24.5 mmol/L葡萄糖水溶液(即葡萄糖濃度為30 mmol/L),高糖+ghrelin組在M199培養(yǎng)基中加入24.5 mmol/L葡萄糖水溶液和10 nmol/L ghrelin,高糖+ghrelin組+衣霉素組在M199培養(yǎng)基中加入24.5 mmol/L葡萄糖水溶液和10 nmol/L ghrelin,處理36 h后再加入10 μmol/L衣霉素,繼續(xù)培養(yǎng)12 h后收集細(xì)胞。以上四組所有細(xì)胞均處理48 h。

1.3 細(xì)胞凋亡檢測

取生長狀態(tài)良好的HRMECs細(xì)胞,以每孔5×105個(gè)的密度接種于6孔板,37 ℃孵育48 h。消化后收集細(xì)胞并離心(1 500 r/min,5 min),500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl 7-AAD混勻,室溫避光孵育15 min,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.4 Western blot法檢測Bax、Bcl-2、GPR78及IRE1α的蛋白表達(dá)

按不同分組處理后收集各組細(xì)胞,用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白,BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量,每個(gè)樣本取40 μg蛋白,用SDS-PAGE分離,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫孵育2 h,磷酸化蛋白用1%胎牛血清封閉。用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗,使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中,4 ℃孵育過夜,抗體稀釋濃度如下：Bax(1∶2 000)、Bcl-2(1∶1 000)、GPR78(1∶2 000)、p-IRE1α(1∶1 000)、IRE1α(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)。TBST洗膜,用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶10 000)在室溫下孵育2 h。充分洗膜后,使用化學(xué)發(fā)光盒對(duì)蛋白條帶進(jìn)行顯色處理,掃描膠片,采用Bandscan 5.0軟件分析膠片灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ghrelin對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞流式檢測結(jié)果顯示,對(duì)照組、高糖組、高糖+ghrelin組三組之間細(xì)胞凋亡率總體比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 131.95,P<0.001)。與對(duì)照組相比,高糖組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.001);與高糖組相比,高糖+ghrelin組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05,見圖1)。

Western blot檢測結(jié)果顯示,3組間Bax(F=162.26,P<0.001)和Bcl-2(F=70.70,P<0.001)的蛋白表達(dá)存在差異。與對(duì)照組相比,高糖組Bax表達(dá)明顯升高,Bcl-2表達(dá)明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);與高糖組相比,高糖+ghrelin組Bax表達(dá)明顯降低,Bcl-2表達(dá)明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,見圖2)。

與對(duì)照組比較,***P<0.001;與高糖組比較,###P<0.001圖2 ghrelin對(duì)HRMECs細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effect of ghrelin on protein expressions of Bax and Bcl-2 in HRMECs

2.2 ghrelin對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示,3組間內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記蛋白GPR78(F=74.18,P<0.001)和p-IRE1α(F=54.89,P<0.001)的蛋白表達(dá)存在差異,IRE1α的蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.01,P>0.05,見圖3)。與對(duì)照組相比,高糖組GPR78及p-IRE1α表達(dá)明顯升高(P<0.001);與高糖組相比,高糖+ghrelin組GPR78及p-IRE1α表達(dá)明顯降低(P<0.01,見圖3)。

與對(duì)照組比較,**P<0.01;與高糖組比較,##P<0.01圖3 ghrelin對(duì)HRMECs細(xì)胞GPR78、IRE1α及p-IRE1α蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effect of ghrelin on protein expressions of GPR78, IRE1α and p-IRE1α in HRMECs

2.3 ghrelin減輕高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制

為了明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在ghrelin抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用,最后加入了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑衣霉素。細(xì)胞流式檢測結(jié)果顯示,高糖+ghrelin+衣霉素組細(xì)胞凋亡率明顯高于高糖+ghrelin組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-17.88,P<0.001,見圖4)。

圖4 ghrelin對(duì)HRMECs細(xì)胞凋亡率的影響Figure 4 Effect of ghrelin on apoptosis rate of HRMECs

3 討論

凋亡最早是由Kerr等于1972年用來描述一種形態(tài)上不同的細(xì)胞死亡類型[18]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞定期發(fā)生的程序性死亡,其特征是細(xì)胞結(jié)構(gòu)的一些特征形態(tài)變化,以及一些酶依賴的生化過程,從而清除體內(nèi)的細(xì)胞,以確保細(xì)胞形成率和細(xì)胞死亡率之間的穩(wěn)態(tài)平衡。然而,這種平衡功能的錯(cuò)位會(huì)導(dǎo)致異常的細(xì)胞生長/增殖或自身免疫性疾病等[19]。隨著細(xì)胞凋亡研究的不斷深入,一系列研究發(fā)現(xiàn)DR的發(fā)生、發(fā)展與視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡有著密切聯(lián)系。視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,與DR基本病理變化及臨床表現(xiàn)有著密切的聯(lián)系[20]。本研究采用經(jīng)典的DR體外模型,觀察到高糖環(huán)境下HRMECs細(xì)胞凋亡率比正常培養(yǎng)環(huán)境中明顯增加,凋亡標(biāo)記蛋白Bax表達(dá)上調(diào),Bcl-2表達(dá)下調(diào),與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21,22]。在DR的進(jìn)展過程中,早期視網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)生凋亡,擾亂了正常的視網(wǎng)膜生理狀態(tài),是最終導(dǎo)致DR各種病理改變和臨床表現(xiàn)的根本原因。因此,防止或逆轉(zhuǎn)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡可以有效控制DR的發(fā)展。既往研究表明ghrelin可發(fā)揮血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)功能[17],對(duì)DR可能也具有保護(hù)作用[16]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)用濃度10 nmol/L ghrelin處理HRMECs,發(fā)現(xiàn)ghrelin可明顯抑制高糖下的細(xì)胞凋亡率,同時(shí)下調(diào)凋亡促進(jìn)蛋白Bax、上調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)[23],也提示了ghrelin對(duì)DR的可能保護(hù)作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)加工轉(zhuǎn)運(yùn)的主要場所,主要調(diào)節(jié)分泌蛋白和跨膜蛋白的合成、折疊和翻譯后修飾。作為一種保護(hù)性反應(yīng),受到刺激時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)發(fā)生,激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)以恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。但當(dāng)應(yīng)激過強(qiáng)或持續(xù)時(shí)間較長,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生功能障礙,導(dǎo)致蛋白折疊和堆積異常[24],細(xì)胞內(nèi)環(huán)境無法恢復(fù),就會(huì)激活相應(yīng)的細(xì)胞凋亡途徑,導(dǎo)致DR患者的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生[25]。因此,研究ERS并加以調(diào)控,有望為防治DR提供一種新途徑。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulatory protein 78,GRP78)是一種多功能蛋白,也是ERS介導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵信號(hào)分子。UPR主要涉及IRE1α、ATF6、PERK生存途徑,而這3條途徑都需要有GPR78的參與[26]。IRE1α是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的跨膜蛋白,其信號(hào)通路是UPR信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)化上最保守的分支。ERS時(shí),IRE1α與GRP78解離后發(fā)生二聚化和自磷酸化,促進(jìn)下游多種應(yīng)激基因的表達(dá),使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境恢復(fù)穩(wěn)態(tài);但長時(shí)間的ERS或ERS過強(qiáng),IRE1α則介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27]。細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已證實(shí),ERS介紹的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡參與DR的病理機(jī)制[28],本研究發(fā)現(xiàn)高糖下HRMECs中ERS被激活,表現(xiàn)為GPR78和p-IRE1α的蛋白表達(dá)水平升高,ghrelin干預(yù)后細(xì)胞ERS明顯降低,GPR78和p-IRE1α的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。為了明確ghrelin抑制細(xì)胞凋亡與其緩解ERS有關(guān),本研究最后采用ERS誘導(dǎo)劑衣霉素處理高糖損傷的內(nèi)皮細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)激活ERS后,ghrelin聯(lián)合衣霉素處理組的細(xì)胞凋亡率明顯高于ghrelin單獨(dú)處理組,提示ghrelin對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用與ghrelin減輕高糖下的ERS存在關(guān)聯(lián)。

綜上所述,本研究結(jié)果提示ghrelin可以減輕高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與ghrelin對(duì)激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮抑制作用有關(guān)。本研究為將ghrelin作為治療DR的新手段提供了新的方向,不過我們只在體外進(jìn)行了研究,ghrelin是否能真正阻止或延緩DR的進(jìn)展還不清楚。此外,DR的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,ghrelin是否通過其他信號(hào)通路發(fā)揮作用也值得探討。目前雖然尚無關(guān)于ghrelin毒性的報(bào)道,但考慮到藥物在眼局部作用部位達(dá)到有效濃度和發(fā)揮治療作用可能受到多種因素的影響,如藥物吸收率、組織中的結(jié)合與分布、給藥的劑量等,因此如何利用ghrelin作為治療藥物用于DR還需進(jìn)一步研究,以期實(shí)現(xiàn)基礎(chǔ)研究的臨床轉(zhuǎn)化。