侯 健, 李美萍, 郭彩霞, 尉立剛

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,太原 030006)

生物活性肽是由2個(gè)及以上的氨基酸殘基組成的一類對(duì)生命有機(jī)體具有重要生理功能的功能分子,不同的來(lái)源、氨基酸組成和排列方式?jīng)Q定了不同的活性肽可能具有抗炎、抗菌、抗氧化、促進(jìn)酒精代謝、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等一種或多種生理功能[1,2],對(duì)于人體生理機(jī)能具有潛在的調(diào)節(jié)作用[3]。鐵是人體必須微量營(yíng)養(yǎng)元素[4],是細(xì)胞色素、血紅蛋白、鐵蛋白、肌紅蛋白以及各種酶的重要組成部分,而且也參與體內(nèi)的氧轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存、電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)、基因調(diào)節(jié)以及細(xì)胞生長(zhǎng)和分化調(diào)節(jié)等重要過(guò)程[5]。人體內(nèi)鐵的缺失會(huì)影響細(xì)胞代謝和機(jī)體生理生化等過(guò)程,從而導(dǎo)致機(jī)體的免疫功能受損[6]、腸道菌群紊亂[7]等一系列問(wèn)題,對(duì)人體的營(yíng)養(yǎng)與健康產(chǎn)生負(fù)面影響。

目前廣泛使用的鐵離子營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑主要為無(wú)機(jī)鐵鹽類和小分子有機(jī)鐵鹽類[8],但各種金屬鹽類有可能會(huì)影響食品的物理和感官特性,同時(shí)還存在吸收率低,對(duì)腸道有刺激、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)[9]。以蛋白多肽為載體,螯合亞鐵離子制得的生物性鐵補(bǔ)充劑,對(duì)比金屬鹽類補(bǔ)充劑不僅提高了亞鐵離子的穩(wěn)定性、吸收率、安全性和生物利用度[10],同時(shí)金屬離子與多肽螯合之后也可能會(huì)增強(qiáng)多肽原本的生物活性,或者使多肽獲得一些本身不具備的生物活性[11],是一種潛在的金屬鹽類替代品。已有研究利用鴨蛋清[12]、魚鱗[13]、豌豆[14]、小米麩皮[15]等不同動(dòng)物與植物性來(lái)源蛋白獲得亞鐵離子螯合肽。辣木籽是一種新興的藥食同源物,其提取油脂之后的加工副產(chǎn)物—辣木籽粕中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)占到50%以上,是良好的蛋白資源[16]。

目前對(duì)辣木籽粕多肽與亞鐵離子螯合的研究鮮有報(bào)道。本研究以辣木籽粕多肽為配體,以Fe2+為金屬螯合離子,制備辣木籽粕多肽-亞鐵螯合物,利用單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化螯合物的制備工藝;通過(guò)光譜法分析螯合物的結(jié)構(gòu),并對(duì)其氨基酸組成進(jìn)行分析,同時(shí)利用掃描電鏡觀察辣木籽粕多肽及其螯合物的微觀樣貌,以期開發(fā)辣木籽粕多肽-亞鐵營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑,為提高辣木籽資源附加價(jià)值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木籽粕酶解多肽液(實(shí)驗(yàn)室自制)、氯化亞鐵、鄰菲羅啉、鹽酸羥胺、抗壞血酸、1-苯胺基-8-萘基磺酸鹽(ANS)、乙酸鈉、乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

pH-220W型pH計(jì),SC-3614低速離心機(jī),UV-2550紫外-可見光譜儀,Nicolet380傅里葉變換紅外光譜儀,LS-55熒光分光光度計(jì),Artemis6000C全自動(dòng)氨基酸分析儀, JSM-IT500HR掃描電子顯微鏡。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 辣木籽粕多肽-亞鐵螯合物制備

參考文獻(xiàn)[17]并做一定修改。取一定濃度的辣木籽粕酶解多肽液,調(diào)節(jié)多肽液pH值,按照一定比例加入氯化亞鐵與抗壞血酸振蕩混勻,反應(yīng)一定時(shí)間后離心(3 622 g×15 min)收集上清液,加入5倍體積的乙醇靜置沉淀3 h,離心(3 622 g×15 min)收集沉淀,凍干得到辣木籽粕多肽-亞鐵螯合物。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

辣木籽粕多肽與亞鐵離子進(jìn)行螯合,以pH=5、多肽質(zhì)量濃度8.8 mg/mL、肽鐵質(zhì)量比為4∶1、螯合溫度40 ℃、螯合時(shí)間20 min為基礎(chǔ)條件,亞鐵螯合率為考察指標(biāo),探究螯合pH值(3、4、5、6、7)、肽鐵質(zhì)量比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1)、多肽濃度(1.1、2.2、4.4、6.6、8.8、10.0 mg/mL)、螯合溫度(25、40、50、60、70 ℃)、螯合時(shí)間(5、10、20、30、40、50、60 min)各因素對(duì)螯合率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,固定螯合時(shí)間20 min、螯合溫度40 ℃,選取肽鐵質(zhì)量比、多肽濃度、pH值為考察因素(分別以A、B、C 表示),以亞鐵螯合率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),其因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素和水平

1.3.4 亞鐵離子螯合率的測(cè)定

鐵含量測(cè)定采用鄰菲羅啉[18]比色法:以氯化亞鐵質(zhì)量濃度x(mg/mL)為橫坐標(biāo),以吸光度y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=8.080 5x+0.013 7,R2=0.999。

然后對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定,帶入標(biāo)曲計(jì)算樣品中氯化亞鐵的量。

式中:c為稀釋樣品中氯化亞鐵的質(zhì)量/mg;n為樣品測(cè)定時(shí)的稀釋倍數(shù);m為添加的氯化亞鐵的總質(zhì)量/mg。

1.3.5 紫外光譜分析

分別取一定量的辣木籽粕多肽、多肽-亞鐵螯合物、氯化亞鐵和抗壞血酸用水溶解,在紫外-可見光譜儀200～450 nm全波段掃描。

1.3.6 紅外光譜分析

稱取適量樣品和溴化鉀于瑪瑙研缽中研磨混勻[樣品和溴化鉀質(zhì)量比在1∶(100～150)],之后置于壓片機(jī)內(nèi)50 MPa保持1 min壓制成片,在4 000～400 cm-1,分辨率為4 cm-1條件下,掃描32次,獲得紅外光譜圖。

1.3.7 表面疏水性指數(shù)S的測(cè)定

依據(jù)Liu等[19]的方法略作修改。用磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L,pH 7.0)將辣木籽粕多肽液進(jìn)行稀釋,使其梯度質(zhì)量濃度為 0.022、0.055、0.110、0.220、0.330、0.440 mg/mL;同時(shí)用磷酸鹽緩沖液配制不同質(zhì)量濃度的多肽-亞鐵螯合物溶液(0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/mL)。將不同濃度的樣品(4 mL)與20 μL的ANS熒光探針(8 mmol/L,用pH=7.0,0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液配制)渦旋混勻,避光靜置15 min。在激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)分別為390 nm和500 nm,狹縫寬度為5 nm條件下測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度。以樣品濃度為橫坐標(biāo),熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)擬合曲線,直線斜率即為樣品的表面疏水性指數(shù)S。

1.3.8 熒光光譜分析

根據(jù)Xi等[20]研究方法測(cè)定樣品熒光光譜。將辣木籽粕多肽液、多肽-亞鐵螯合物等樣品用水溶解稀釋,獲得不同濃度的樣品溶液。固定激發(fā)波長(zhǎng)為285 nm,狹縫寬度為5 nm,掃描樣品在300～550 nm 范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜。

1.3.9 多肽-亞鐵螯合物的氨基酸組成分析

參照國(guó)標(biāo)GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測(cè)定》的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.10 掃描電鏡及能譜分析

采用掃描電子顯微鏡(SEM)聯(lián)用X射線能譜儀(EDS)觀察辣木籽粕多肽與多肽-亞鐵螯合物的表面微觀形貌,分析螯合前后樣品表面的元素組成。

1.3.11 數(shù)據(jù)處理

使用Design-Expert V8.0.6和Origin 2019b對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析與作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 辣木籽粕多肽-亞鐵螯合物制備單因素實(shí)驗(yàn)

由圖1可知,辣木籽粕酶解多肽與亞鐵離子的螯合率隨pH的增加先上升后下降。在pH值較低時(shí)反應(yīng)體系中含有大量的H+,而H+會(huì)與供電子基團(tuán)反應(yīng)形成氧化物沉淀,與亞鐵離子之間產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,導(dǎo)致螯合率較低;隨著pH值的上升,反應(yīng)體系中H+濃度逐漸減小、OH-濃度逐漸增大,OH-也會(huì)與供電子基團(tuán)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,爭(zhēng)搶亞鐵離子反應(yīng)生成氫氧化物沉淀,從而使螯合率降低[21],故選擇最適pH=5。在肽鐵質(zhì)量比從1∶1～4∶1逐漸增加時(shí),辣木籽粕酶解多肽與亞鐵離子螯合率也逐漸上升,而當(dāng)肽鐵質(zhì)量比大于4∶1時(shí),亞鐵螯合率又開始緩慢下降。辣木籽粕多肽結(jié)合亞鐵離子的量是一定的,在質(zhì)量比較小時(shí)亞鐵離子較多,多肽沒有足夠的活性位點(diǎn)與之結(jié)合,造成亞鐵離子的浪費(fèi);而在質(zhì)量比較大時(shí),亞鐵離子的含量較低,螯合物的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,對(duì)螯合率也有一定的影響[22],所以選擇最適肽鐵質(zhì)量比為4∶1。

圖1 各因素對(duì)辣木籽粕多肽-亞鐵物螯合率的影響

在多肽質(zhì)量濃度從2.2～8.8 mg/mL逐漸增加時(shí),辣木籽粕酶解多肽與亞鐵離子螯合率也逐漸上升,而當(dāng)多肽質(zhì)量濃度大于8.8 mg/mL后,亞鐵螯合率又開始緩慢下降。這可能是由于多肽在低濃度條件下體系的流動(dòng)性比較好,多肽與亞鐵離子不易形成穩(wěn)定的絡(luò)合物,而高濃度多肽液體系流動(dòng)性又會(huì)減弱,使多肽與亞鐵離子不能夠充分接觸,從而導(dǎo)致螯合能力下降[23],故選擇最適多肽濃度為8.8 mg/mL。隨著溫度和時(shí)間的變化,螯合率雖然也呈現(xiàn)先上升后下降的變化,但是變化趨勢(shì)平緩,對(duì)于螯合率的影響較小,故確定螯合溫度為40 ℃,螯合時(shí)間為20 min。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化多肽-亞鐵螯合物制備工藝

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,固定螯合溫度為40 ℃,螯合時(shí)間為20 min,選取肽鐵質(zhì)量比、多肽濃度、pH值為考察因素(分別以A、B、C 表示),以螯合率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design-Expert對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,得到各因素與螯合率的二次多項(xiàng)回歸模型方程:Y=88.21+3.19A-1.94B-3.25C+2.82AB+1.16AC+0.93BC-8.9A2-4.640B2-5.55C2。

2.2.2 響應(yīng)面模型建立與顯著性分析

對(duì)亞鐵螯合率的二次多項(xiàng)回歸模型進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn),結(jié)果如表3所示。

表3 回歸方程方差分析

對(duì)亞鐵離子螯合率的回歸模型系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),可知模型的一次項(xiàng)A、B、C和二次項(xiàng)A2、B2、C2以及AB影響極顯著;通過(guò)對(duì)回歸系數(shù)的比較可知,各因素對(duì)辣木籽粕多肽與亞鐵離子螯合率的影響次序?yàn)?C(pH)>A(肽鐵質(zhì)量比)>B(多肽質(zhì)量濃度)。

2.2.3 最佳參數(shù)的確定及模型驗(yàn)證

通過(guò)Design-Expert軟件的預(yù)測(cè)分析功能,優(yōu)化得到辣木籽粕多肽與亞鐵離子螯合的最佳條件為:肽鐵質(zhì)量比4.13∶1,多肽質(zhì)量濃度7.92 mg/mL,pH=4.70,在此條件下多肽提取率預(yù)測(cè)值為89.09%。結(jié)合實(shí)際操作情況,調(diào)整螯合工藝為:肽鐵質(zhì)量比4.1∶1,多肽質(zhì)量濃度7.90 mg/mL,pH=4.70。在調(diào)整后的條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),辣木籽粕多肽與亞鐵離子的螯合率為(88.27±1.49)%,這與模型的預(yù)測(cè)值很接近,證明了二次多項(xiàng)回歸模型方程的可靠性。

2.3 多肽-亞鐵螯合物的紫外光譜分析

如圖2所示,氯化亞鐵在200～450 nm區(qū)間內(nèi)沒有明顯的吸收峰;辣木籽粕多肽在267 nm附近有1個(gè)特征吸收峰,VC的特征吸收峰最大吸收波長(zhǎng)在264 nm處;辣木籽粕多肽與VC混合之后在267 nm處與辣木籽粕多肽相同的吸收峰,且其吸光度值與辣木籽粕多肽+VC的吸光度值接近,表明在反應(yīng)體系中加入VC對(duì)于辣木籽粕多肽的結(jié)構(gòu)沒有太大的影響;而辣木籽粕多肽-亞鐵螯合物在267 nm附近的吸收峰消失,且相對(duì)于辣木籽粕多肽吸收峰值有所增強(qiáng),由此可以推斷有新的物質(zhì)生成[24]。Athira等[25]將乳清蛋白衍生肽與亞鐵離子螯合之后的紫外光譜圖也表現(xiàn)出類似的變化。

圖2 酶解多肽與螯合物紫外吸收光譜

2.4 多肽-亞鐵螯合物的熒光光譜分析

2.4.1 表面疏水性

圖3通過(guò)對(duì)熒光強(qiáng)度和樣品濃度做曲線得出:多肽的表面疏水指數(shù)S0=1 445,螯合物的表面疏水指數(shù)S1=708,螯合物相對(duì)于多肽的表面疏水性顯著下降?？赡苁桥c非極性氨基酸相比,極性氨基酸更易于與亞鐵離子結(jié)合[26],從而螯合物中極性氨基酸可能較多,非極性氨基酸較少;而非極性氨基酸所占比例越低,樣品表現(xiàn)出來(lái)的表面疏水性越低[27],從而螯合物的表面疏水性相對(duì)于多肽會(huì)顯著下降。

圖3 酶解多肽與螯合物的表面疏水性

2.4.2 熒光光譜圖

如圖4所示,酶解多肽在367 nm附近出現(xiàn)最大發(fā)射峰;FeCl2和VC在367 nm處沒有顯示熒光強(qiáng)度,不會(huì)對(duì)螯合物的熒光強(qiáng)度產(chǎn)生影響。與酶解多肽相比,螯合物的最大發(fā)射波長(zhǎng)產(chǎn)生輕微的紅移(從367 nm移動(dòng)到371 nm),且熒光強(qiáng)度明顯減弱。最大發(fā)射波長(zhǎng)移動(dòng)與熒光強(qiáng)度降低是多肽結(jié)構(gòu)發(fā)生折疊變化的典型標(biāo)志[28],可能是多肽與亞鐵離子螯合, 導(dǎo)致多肽中色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸的構(gòu)象發(fā)生了變化,使其固有熒光發(fā)生猝滅作用,熒光強(qiáng)度下降[29]。結(jié)果表明多肽與亞鐵離子螯合之后產(chǎn)生了一種新的物質(zhì)。

圖4 酶解多肽與螯合物熒光光譜

2.5 多肽-亞鐵螯合物的紅外光譜分析

圖5 酶解多肽及其螯合物的紅外光譜

2.6 多肽-亞鐵螯合物掃描電鏡及能譜分析

辣木籽粕酶解多肽與螯合物的電子掃描顯微鏡圖如圖6所示,多肽的微觀結(jié)構(gòu)相對(duì)松散,表面光滑且呈不規(guī)則片狀;而螯合物微觀結(jié)構(gòu)更加緊密,表面主體顆粒狀呈交織結(jié)構(gòu);Wang等[32]制備的南極磷蝦肽-鐵復(fù)合物也有類似的形態(tài)。多肽與螯合物在表觀形態(tài)發(fā)生了明顯變化,說(shuō)明亞鐵離子與辣木籽粕多肽中的基團(tuán)結(jié)合產(chǎn)生了新物質(zhì)。同時(shí)對(duì)多肽和螯合物進(jìn)行能譜分析(EDS),結(jié)果如表4所示。

圖6 多肽及螯合物的掃描電鏡圖

表4 多肽與螯合物中各元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%

由表4可知,多肽中的主要元素為C、O、S等,這些元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)占到了90%以上;而螯合物中主要元素除了C、O、S外,還含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)11.15%左右的鐵元素,表明亞鐵離子與多肽之間的確通過(guò)螯合作用成功結(jié)合在一起。

2.7 多肽-亞鐵螯合物的氨基酸組成分析

辣木籽粕多肽在螯合前后的氨基酸組成及含量如表5所示。辣木籽粕多肽及其螯合物的氨基酸有16種,辣木籽粕多肽中Glu、Arg、Leu、Gly含量相對(duì)較高,此外還有Asp、His、Lys、Ala、Val、等氨基酸,Cys質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低(<0.01%);已有研究證實(shí)His、Glu、Asp、Lys、Cys等氨基酸的殘基側(cè)鏈均可提供與亞鐵離子結(jié)合的配體,會(huì)在與金屬螯合反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用[33,34]。與辣木籽粕多肽相比,螯合物中氨基酸組成有所改變,其中Cys與Arg的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別增加了2.66%與4.17%,His、Lys、Glu等極性氨基酸也有不同程度的增加,表明這幾種氨基酸都參與了亞鐵的螯合。而螯合物中Ala、Val、Leu、Phe等疏水性氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)從29.09%下降至20.38%,可能相比于疏水性氨基酸,親水性氨基酸的存在更有助于多肽與亞鐵的螯合[35],這與表面疏水性分析結(jié)果相吻合。

表5 辣木籽粕多肽螯合前后氨基酸含量變化與分析

3 結(jié)論

研究以辣木籽粕多肽和氯化亞鐵為原料,以螯合率為指標(biāo),采用單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面法優(yōu)化得出了多肽亞鐵螯合物的最佳制備工藝為:肽鐵質(zhì)量比為4.1∶1,多肽質(zhì)量濃度為7.9 mg/mL,pH=4.70,反應(yīng)溫度為40 ℃,反應(yīng)時(shí)間為20 min,在此條件下亞鐵的螯合率為(88.27±1.49)%。