張燕英,王天雨,孫 浩,沈萍萍

(煙臺大學海洋學院,山東 煙臺 264005)

海草床是海洋生物重要的棲息地,然而,由于氣候變化和人類活動的影響,全球海草床生態(tài)系統(tǒng)嚴重退化[1],海草床生態(tài)系統(tǒng)的保護和生態(tài)修復已成為海洋生態(tài)領域的研究熱點[2]。海草床生態(tài)系統(tǒng)擁有多樣性豐富、代謝活躍的微生物群落,微生物參與元素生物地化循環(huán)與海草宿主建立了復雜且動態(tài)變化的互作機制,進而影響海草的營養(yǎng)轉化和健康生長[3-4]。研究顯示,微生物能夠消耗海草生長發(fā)育產生的有害代謝產物,如甲醇、乙醇和乙醛等化合物[5],從而有效降低這些有害代謝產物對其生長的影響,如:海草葉片上的溶藻細菌能夠產生瓊脂水解酶和角叉菜膠酶,殺死附生在海草葉片上影響海草光合作用的真核藻類[6]。世界范圍內海草的幾次大面積死亡現(xiàn)象均與海草床沉積物中硫化物含量過高有關[7-8],而海草根際的硫氧化微生物能夠將硫化氫(H2S)等低價硫化物氧化為硫,再將硫氧化為硫酸鹽,從而有效緩解海草生長的環(huán)境壓力[9]。海草根際的固氮微生物能夠將空氣中的氮氣轉化為銨鹽,供海草吸收利用[10];此外,海草根際微生物還能夠通過產生植物激素調節(jié)海草的生長發(fā)育[5]?？梢?微生物與海草組成共生功能體,在海草床生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[11]。

目前,海草微生物研究主要集中在鰻草、大洋波喜蕩草和泰來草等海草種類[12-14],不同種類海草的微生物類群存在一定差異[15]。分布在黃渤海的紅纖維蝦形草(P.iwatensis)被世界自然保護聯(lián)盟(IUCN)評估為易危海草種類,其微生物群落結構還未見報道。本研究采用擴增子測序和宏基因組測序技術,探究黃渤海地區(qū)紅纖維蝦形草根際微生物群落多樣性、結構特征及功能多樣性,掌握海草根際細菌優(yōu)勢類群、關鍵類群并分析其功能,推測其對海草生長、繁殖的影響,為篩選海草根際有益菌提供參考,為易危海草物種的生態(tài)修復提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 采樣位點與樣品采集

根據紅纖維蝦形草在黃渤海的分布情況,于 2021 年 5 月份生長季節(jié)(低潮時),在榮成俚島(37°14′39"N,122°35′8"E)和蓬萊長島(37°55′17"N,120°45′33"E)設兩個采樣位點進行樣品采集。俚島采樣位點位于榮成市俚島鎮(zhèn),多年平均氣溫11.3 ℃,年平均日照時數2 578.5h,底質以礫砂為主,平均粒徑1 mm,中值粒徑0.56 mm,紅纖維蝦形草分布在海參養(yǎng)殖池塘附近[16]。長島采樣位點位于煙臺市蓬萊區(qū)長島海洋生態(tài)文明綜合試驗區(qū),歷年平均氣溫12.1 ℃,年平均降水量為537.1 mm,底質以黏土質粉砂為主,中值粒徑介于0.005～0.089 mm之間[17]。

在每個位點設置四個平行采樣點,點間距離>50 m,為不同群體樣本(圖1),使用無菌鏟于每個采樣點采集沉積物(距根表2 mm內),混合均勻后裝于密封袋內,冷凍避光保存帶回實驗室,保存于-80 ℃冰箱。

圖1 樣品采集位點

1.2 DNA提取和PCR擴增

取1 g沉積物樣品,根據E.Z.N.A.土壤DNA試劑盒 (Omega Bio-tek,Norcross,GA,USA)說明書進行微生物群落總DNA抽提,使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質量,使用NanoDrop2000測定DNA濃度和純度。

分別使用16S rDNA正向引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和反向引物806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'),原生動物18S rDNA正向引物TAReukFWD1F(5'-CCAGCASCYGCGGTAATTCC-3')和反向引物TAReukREV3R(5'-ACTTTCG TTCTTGATYRA-3'),真菌ITS rDNA正向引物ITS1F(5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3')和反向引物ITS2R(5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3')進行PCR擴增,PCR反應體系為:5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,上下游引物(5 μmol/L)各0.8 μL,TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL,模板DNA 10 ng,dH2O補足至20 μL。每個樣本3個重復。PCR反應程序為:95 ℃ 預變性 3 min,27個循環(huán)(95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s),然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min,最后在4 ℃進行保存。

1.3 Illumina Miseq 測序及數據分析

純化后的PCR產物,利用NEXTflex Rapid DNA-Seq Kit(Bioo Scientific,USA)進行建庫,并通過Illumina Miseq PE300平臺(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)完成微生物16S rDNA、18S rDNA和ITS rDNA測序。對原始數據使用Fastq軟件進行質控,并使用FLASH軟件進行拼接。使用QIIME2中DADA2處理序列,獲得ASV特征表。其中對于18S rDNA結果,去除Rhodophyta紅藻門、Streptophyta鏈型植物、fungus、后生動物等獲得最終的原生生物ASV分類表。

所有的數據分析均在美吉生物云平臺(https:∥cloud.majorbio.com)上進行,使用Mothur軟件(http:∥www.mothur.org/wiki/Calculators)計算Alpha多樣性,采用Wilxocon秩和檢驗進行Alpha多樣性的組間差異分析;使用基于Bray-Curtis距離算法的PCoA分析(主坐標分析)檢驗樣本間微生物群落結構的相似性,并結合Adonis非參數檢驗分析樣本組間微生物群落結構差異是否顯著;通過R語言對微生物之間相關性進行計算,并使用Gephi軟件繪制相關性網絡圖。

1.4 宏基因組測序與數據分析

用于宏基因組測序分析的DNA質檢后,通過Covaris M220(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)將DNA片段化,篩選約400 bp的片段,使用NEXTflexTM Rapid DNA-Seq(Bioo Scientific,USA)構建PE文庫,使用Illumina NovaSeq(Illumina,USA)測序平臺進行宏基因組測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

原始測序數據經Fastp v 0.20.0進行質量控制后用于后續(xù)分析。使用Diamond v0.8.35將得到的非冗余基因集的氨基酸序列與NR數據庫、eggNOG數據庫(v4.5.1)、KEGG數據庫(v94.2)進行比對(BLASTP比對參數設置期望值e-value為1e-5),獲得基因對應的KEGG功能。使用KO、Pathway、EC、Module對應的基因豐度總和計算對應功能類別的豐度。所有的數據分析均在美吉生物云平臺(https://cloud.majorbio.com)上進行,利用CD-HIT軟件(http://www.bioinformatics.org/cd-hit/)進行聚類,構建非冗余基因集。使用SOAPaligner軟件進行基因豐度的計算,通過R語言進行物種與功能組成分析和物種與功能貢獻度分析。

2 結 果

2.1 紅纖維蝦形草根際微生物群落多樣性分析

經過擴增子高通量測序,細菌16S rDNA共獲得553 307條有效序列,平均長度420 bp;原生生物18S rDNA共獲得368 154條有效序列,平均長度248 bp;真菌ITS rDNA共獲得520 982條有效序列,平均長度為373 bp。基于ASV豐度表計算微生物α多樣性指數,包括ASV Richness、Ace、Chao和Shannon指數,對樣品中微生物群落的豐富度和多樣性進行分析。長島真菌群落的ASV Richness和Chao指數顯著高于俚島,表明長島區(qū)域真菌群落的豐富度較高。兩個海域樣品的細菌和原生生物的多樣性指數差異無統(tǒng)計學意義(表1)。

表1 紅纖維蝦形草根際微生物α多樣性指數

主坐標分析(PCoA)結果表明不同海域紅纖維蝦形草根際細菌、原生生物、真菌類群都在PC1軸上顯著分開(圖2),表現(xiàn)出明顯的區(qū)域特異性。多元方差分析(Adonis)結果也表明不同海域間的細菌(R2=0.46,P=0.037)、原生生物(R2=0.45,P=0.033)、真菌群落(R2=0.56,P=0.032)差異均具有統(tǒng)計學意義。長島海域細菌樣品間的相似性比俚島要高,而真菌類群比俚島要低。

圖2 基于Bray-Curtis距離的細菌、原生生物及真菌的主坐標分析(PCoA)

2.2 紅纖維蝦形草根際微生物群落組成分析

細菌種類在兩個海域較為相似(圖3(a))。在綱水平,主要類群為擬桿菌綱(Bacteroidia),分別占俚島和長島細菌豐度的(18.56±1.16)%和(28.42±1.41)%,其次是γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、Desulfobulbia和α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)。俚島海域彎曲桿菌綱(Campylobacteria)和厭氧繩菌綱(Anaerolineae)相對豐度較高,分別是長島的2.1倍和1.6倍;而長島海域擬桿菌綱和γ-變形菌綱相對豐度較高(圖3(a))。兩個海域原生生物群落組成差異較大(圖3(b))。俚島原生生物優(yōu)勢類群為類錐體綱(Conoidasida,(2.09±1.31)%)。長島的優(yōu)勢類群是石莼綱(Ulvophyceae,(26.26±14.04)%)和褐藻綱(Phaeophyceae,(6.19±5.35)%),分別是俚島樣品的32.7倍和24.3倍。此外,長島海域甲藻綱(Dinophyceae)的豐度是俚島的1.7倍。真菌群落結構如圖3(c)所示,優(yōu)勢類群為糞殼菌綱(Sordariomycetes),分別占俚島和長島真菌的(26.69±9.17)%和(10.73±3.11)%,其次為羅茲菌門(Rozellomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)和酵母綱(Saccharomycetes)。俚島和長島海域真菌群落差異較大,俚島樣品中糞殼菌綱、銀耳綱(Tremellomycetes)、節(jié)擔菌綱(Wallemiomycetes)和傘菌綱(Agaricomycetes)的豐度分別是長島的2.5倍、2.4倍、3.3倍和1.7倍;而長島海域酵母綱的豐度顯著高于俚島(P=0.033)。

圖3 綱水平上不同樣品細菌、原生生物及真菌群落組成

在屬水平對長島和俚島微生物群落進行組間差異比較,結果如圖4所示,俚島紅纖維蝦形草根際細菌Cocleimonas屬和脫硫球莖菌屬(Desulfobulbus)的豐度顯著高于長島海域(P<0.05),而伍斯菌屬(Woeseia)、水桿菌屬(Aquibacter)和海藻桿菌(Algibacter)屬豐度顯著低于長島海域。這兩海域差異顯著的原生生物包括礁膜屬(Monostroma)、鵝腸菜屬(Endarachne)、異帽藻屬(Heterocapsa)、石莼屬(Ulva)和原礁膜屬(Protomonostroma),這些原生生物在長島海域的豐度均顯著高于俚島海域(P<0.05)。而真菌中帚枝霉屬(Sarocladium)、梅奇酵母屬(Metschnikowia)、枝孢屬(Cladosporium)和克魯維酵母屬(Kluyveromyces)在兩海域存在顯著差異,其中長島梅奇酵母屬和枝孢屬相對豐度顯著高于俚島海域,而俚島海域帚枝霉屬和克魯維酵母屬豐度顯著高于長島海域(P<0.05)(圖4)。

圖4 不同海域樣品中細菌、原生生物及真菌的差異物種分析

2.3 紅纖維蝦形草根際微生物生態(tài)網絡分析

分別選取俚島和長島細菌、原生生物和真菌中總豐度前100的ASV,進行斯皮爾曼(Spearman)秩相關分析并篩選相關系數|p|>0.6,且顯著水平P<0.05的數據構建相關性網絡(圖5),網絡的拓撲參數見表2,結果顯示三個微生物類群的節(jié)點數量、模塊化指數、網絡直徑、平均路長度和平均聚類系數較為相似,而細菌的邊數量較真菌和原生生物高,說明細菌之間的互作關系更加復雜(圖5),原生生物間的正相關關系(俚島和長島分別為88.3%和77.43%)高于負相關關系(俚島和長島分別為11.7%和22.57%),而細菌和真菌群落不同ASV之間的正相關關系和負相關關系相差不大。

表2 微生物相關性網絡圖拓撲參數

圖5 細菌、原生生物及真菌相關性網絡

2.4 紅纖維蝦形草根際微生物氮代謝和硫代謝功能分析

宏基因組測序共獲得原始數據862 743 138條序列,平均序列長度150 bp,經過質控,得到優(yōu)化序列770 588 866條,平均序列長度150 bp,拼接組裝后得到7 173 516條contig用于后續(xù)功能分析。

KEGG富集分析表明,微生物參與的相對豐度前五的功能分別是代謝途徑(Metabolicpathways)、次生代謝產物的生物合成(Biosynthesis of secondary metabolites)、不同環(huán)境下的微生物代謝(Microbial metabolism in diverse environments)、碳代謝(Carbon metabolism)和氨基酸的生物合成(Biosynthesis of amino acids)(圖6),這些功能涉及生物生存所必須的主要代謝功能或過程。

圖6 紅纖維蝦形草根際微生物匹配到KEGG數據庫的主要代謝通路的功能基因相對豐度

微生物物種與功能貢獻度關聯(lián)分析結果見圖7,在屬水平上共有17個屬在氮代謝和硫代謝中貢獻較高,其中Eudoraea只與氮代謝功能相關,主要參與反硝化作用(圖7(a))。將長島和俚島進行組間差異分析,結果顯示參與氮代謝和硫代謝的微生物中有三個屬的豐度存在顯著差異(圖7(c)),其中長島海域熒光桿菌屬(Ilumatobacter)相對豐度顯著高于俚島海域(P<0.05),而硫卵菌屬(Sulfurovum)和甲基海洋桿菌屬(Methyloceanbacter)相對豐度顯著低于俚島海域(P<0.05)。熒光桿菌屬在氮代謝過程中對反硝化作用貢獻度較高,在硫循環(huán)過程中對硫酸鹽還原貢獻度較高;硫卵菌屬在氮代謝過程中對硝酸鹽還原貢獻度較高,在硫代謝過程中對硫酸鹽還原貢獻度較高;甲基海洋桿菌屬在氮代謝過程中對反硝化作用、硝酸鹽還原和固氮作用的貢獻度較高,在硫代謝過程中對硫酸鹽還原貢獻度較高。

圖7 硫、氮循環(huán)核心功能微生物貢獻度

3 討 論

海草根際微生物在海草床生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用,微生物群落結構會受到海草物種、海草生長狀態(tài)和環(huán)境因素的共同影響[18]。法國和葡萄牙諾氏鰻草(Zosteranoltii)和紅海北部海草床的長萼喜鹽草(Halophilastipulacea)根際微生物都以γ-變形菌和δ-變形菌為優(yōu)勢種[15],榮成天鵝湖鰻草(Zosteramarina)和日本鰻草(Zosterajaponica)根際沉積物中微生物以變形菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢種[18],本研究中俚島和長島紅纖維蝦形草根際微生物均以擬桿菌門和變性菌門為優(yōu)勢種,說明海草根際微生物核心物種具有一致性。但是不同海域或者相同海域不同海草物種根際微生物群落結構存在差異,通常將這種差異歸結為海草根系分泌物的差異和環(huán)境因子的差異造成的[15,18]。本研究中長島和俚島海域微生物在屬水平細菌、真菌和原生生物都存在顯著差異類群,進一步說明相同海草種類在不同海域根際微生物群落結構可能會受到環(huán)境影響而存在顯著差異。在屬水平,具有硫酸鹽還原作用的脫硫葉菌屬(Desulfobulbus)在俚島海域的豐度顯著高于長島海域,脫硫葉菌屬通過推動海草根際硫循環(huán)過程,對海草的健康起重要作用[7,9,19]?；茏责B(yǎng)菌伍斯菌屬(Woeseia)在沉積物氮、硫等元素循環(huán)中起重要作用,其生長依賴環(huán)境中氧氣的充分供應,在長島海域伍斯菌屬的豐度顯著高于俚島,這可能與長島海域海草根際氧氣含量有關。俚島紅纖維蝦形草分布在海參養(yǎng)殖池塘附近,海參養(yǎng)殖過程中的呼吸作用和生物擾動提高了沉積物耗氧量,導致俚島海域海草根際氧氣含量降低[20]。此外,微生物之間的相互作用也是造成微生物群落結構差異的原因之一,可以通過微生物相關性網絡揭示微生物群落成員之間共享的生態(tài)位,或者群落成員之間更直接的共生關系[21]。使用網絡分析來探索微生物分類群之間的關系,結果顯示長島區(qū)域微生物群落的復雜性高于俚島,表明長島區(qū)域微生物群落更穩(wěn)定、細菌群落復雜性最高,可能是群落穩(wěn)定性的主要貢獻者。

除了細菌外,原生生物和真菌也是海草根際微生物的重要組成部分,原生生物和真菌是微食物網的重要組成部分,在能量流動和物質循環(huán)中發(fā)揮重要作用[22]。但與細菌相比,海草根際原生生物和真菌相關研究較少,本研究中原生生物和真菌豐度和多樣性遠低于細菌。原生生物分布廣泛,其在水生食物網中占有重要地位,具有凈化水質和作為水體富營養(yǎng)化的指標等重要作用[23]。本研究中原生生物相對豐度較高的綠藻門礁膜屬(Monostroma)和褐藻門鵝腸菜屬(Endarachne)均屬于光養(yǎng)型原生生物,具有光合色素,能夠利用光合作用合成有機物供應其生命活動,是海草床有機碳源的重要組成部分[24]。紅纖維蝦形草根際真菌優(yōu)勢物種是子囊菌門(Ascomycota)的糞殼菌綱(Sordariomycetes)真菌,與南海新村灣泰來草、海菖蒲和南沙群島泰來草、喜鹽草根際真菌群落存在顯著差異[25]。這說明真菌在海草根際難以形成核心微生物類群,也進一步印證了真菌與海草之間的互作性不如細菌強烈[25-26]。

近年來,人類活動導致大量活性氮通過大氣和河流最終排入海洋,引起水體富營養(yǎng)化等一系列環(huán)境問題[27]。富營養(yǎng)化會引發(fā)海草沉積物中有機物含量增加并抑制海草對氧氣的需求,導致海草沉積物處于缺氧狀態(tài),造成硫化物的大量積累[28]。沉積物中高濃度的硫化物會嚴重影響海草的光合作用、養(yǎng)分吸收和生長代謝[29]。海草根際微生物參與海草根際硫循環(huán)和氮循環(huán),在海草生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[10,30],且海草根際微生物在驅動硫循環(huán)反應過程中往往和海草根際氮循環(huán)相互耦合,如微生物的生物固氮反應通常與硫酸鹽還原過程關系密切,很多海草根際的硫酸鹽還原菌同時具有固氮活性[10]。本研究通過微生物物種與功能的關聯(lián)分析,揭示有17個屬的微生物在氮代謝過程貢獻較高,其中16個屬同時對硫循環(huán)代謝過程的貢獻度較高,表明這些微生物同時在海草根際硫和氮循環(huán)中發(fā)揮重要作用。對兩個海域的樣品進行差異分析發(fā)現(xiàn),長島和俚島海草根際硫循環(huán)和氮循環(huán)微生物有三個屬存在顯著差異,包括熒光桿菌屬(Ilumatobacter)、硫卵菌屬(Sulfurovum)和甲基海洋桿菌屬(Methyloceanbacter),它們共同參與硫酸鹽還原過程,在缺氧的海草根際環(huán)境中通過硫酸鹽的還原進行有機質礦化過程,將硫酸鹽作為呼吸鏈末端的電子受體,生成無機硫化物。硫酸鹽還原分為同化硫酸鹽還原和異化硫酸鹽還原兩種類型,本研究中熒光桿菌屬(Ilumatobacter)和甲基海洋桿菌屬(Methyloceanbacter)對同化硫酸鹽還原貢獻度較高,而硫卵菌屬(Sulfurovum)對異化硫酸鹽還原貢獻度較高,同化硫酸鹽還原需要消耗能量,異化硫酸鹽還原是一個產能的過程[31],因此,海草根際硫酸鹽還原菌的豐度差異可能與可利用能量有關。對海草根際微生物氮代謝分析顯示熒光桿菌屬(Ilumatobacter)和甲基海洋桿菌屬(Methyloceanbacter)對反硝化貢獻度較高,硫卵菌屬(Sulfurovum)對同化硝酸鹽還原貢獻度較高。在富營養(yǎng)化的海草床生態(tài)系統(tǒng)中,微生物參與的同化硝酸鹽還原和反硝化作用可以去除多余的氮,同化硝酸鹽還原是利用硝態(tài)氮合成細胞物質,本研究中硫卵菌屬(Sulfurovum)對同化硝酸鹽還原貢獻度較高,說明這類細菌在海草根際厭氧環(huán)境下能夠將硝態(tài)氮轉化為細胞物質,反硝化的中間產物NO是調節(jié)植物生長的信號分子[5,32],因此,在富營養(yǎng)化的海草床生態(tài)系統(tǒng)中,參與脫氮過程的微生物在海草健康生長中發(fā)揮重要作用。綜上,在海草根際參與硫循環(huán)和氮循環(huán)的微生物占據相對較高豐度,說明這些微生物類群對海草生長以及維持海草根際微環(huán)境具有重要意義,也預示海草根系環(huán)境可以根據氧含量和能量控制功能微生物群落達到平衡狀態(tài),為進一步挖掘微生物資源、進行海草床生態(tài)系統(tǒng)的修復提供思路。