樊 歡,鮑倡俊,朱立國,胡建利,嵇 紅

手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是一種常見兒童傳染病,由多種類型人腸道病毒(EV)引起,多發(fā)于低齡嬰幼兒童,臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、手、足、口和臀等部位扁平狀紅色皰疹[1-3];該病屬于自限性疾病,絕大多數(shù)病例病情輕微可在1～2周內(nèi)自愈,僅少數(shù)患兒病情危重,病情發(fā)展迅速,累及神經(jīng)系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng),出現(xiàn)心肌炎、腦炎、肺水腫和弛緩性麻痹等并發(fā)癥,甚至導(dǎo)致死亡[4-5]。

人腸病毒屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬,是一種無包膜、單股正鏈RNA病毒[6];目前已知的人腸道病毒的血清型超過100多種,根據(jù)人腸道病毒VP1 核酸序列的差異進行分類,將人腸道病毒分為A、B、C和D 4組。其中,腸道病毒A組在手足口病的發(fā)病中起著極其重要的作用,主要由20多種血清型組成,包括柯薩奇病毒1-10型、12型、14型、16型、21型和EV71型等[6-8]。往年手足口病多由腸道病毒71型(EV-A71)和柯薩奇病毒A16型(CV-A16)引起[9]。然而,由于疫苗的應(yīng)用和病毒本身流行的特征,近年來HFMD的主要病原體發(fā)生了變化,非EV-A71和非CV-A16感染占比增加,其中柯薩奇病毒A6(CV-A6)逐漸占據(jù)國內(nèi)手足口病原譜的主導(dǎo)地位[10-11]。CV-A6感染所致的臨床癥狀與典型的手足口病癥狀稍有不同,易發(fā)高熱,抽搐,其皮疹可分布全身,如四肢、軀干、臀部和面部等部位,形態(tài)多樣,且皮疹面積較大,持續(xù)時間較長,皮疹消退后可出現(xiàn)脫皮[12-13],部分病例痊愈后還會出現(xiàn)脫甲癥,嚴重者可累及循環(huán)系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)[14]。此外,CV-A6還是皰疹性咽峽炎的主要病原體[15],然而該病并沒有被納入中國疾病監(jiān)測網(wǎng)系統(tǒng),因此,CV-A6引起的疾病負擔(dān)可能被嚴重低估。

本研究收集了2013-2022年江蘇省手足口及皰疹性咽峽炎患者CV-A6陽性標(biāo)本,對2013-2022年期間分離到的35份CV-A6毒株進行全基因組測序,旨在了解和掌握江蘇省CV-A6病原優(yōu)勢株的基因型、進化親緣關(guān)系、基因重組及重要氨基酸位點突變情況,為今后的CV-A6感染的防治工作提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 資料和標(biāo)本來源 本研究通過江蘇省手足口病監(jiān)測哨點收集了2013-2022年CV-A6 陽性標(biāo)本的咽拭子或肛拭子;通過“中國疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)”收集標(biāo)本的病例類型及病原學(xué)檢測結(jié)果等。

1.1.2 儀器與試劑 全自動核酸提取儀及其配套試劑購自天隆科技有限公司,ULSEN超靈敏度腸道病毒全基因組捕獲試劑盒A組購自北京微未來科技有限公司,Iseq100 二代測序儀及Nextera XT DNA Library Preparation Kit購自Illumina公司,Opti-MEM培養(yǎng)液、胎牛血清和青霉素購自GIBCO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 病毒分離 人橫紋肌肉瘤(RD)細胞接種于細胞培養(yǎng)板,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),待細胞生長至80%左右融合度時,將CV-A6陽性的標(biāo)本過濾后接種于RD細胞進行病毒分離,觀察細胞病變(cytopathic effect,CPE)情況,7 d內(nèi)無細胞病變,則再次盲傳,盲傳2代,若出現(xiàn)細胞病變,反復(fù)凍融3次后收集培養(yǎng)液,并儲存于-80 ℃。

1.2.2 核酸提取 采用天隆科技公司的全自動核酸提取儀及其配套試劑按照其說明書操作步驟提取CV-A6毒株核酸,收集的核酸置于-80 ℃保存。

1.2.3 文庫制備及上機測序 參照ULSEN超靈敏度腸道病毒全基因組捕獲試劑盒A組說明書配置反應(yīng)體系,對CV-A6毒株核酸進行全基因組逆轉(zhuǎn)錄后,PCR擴增富集,擴增產(chǎn)物采用Nextera XT DNA Library Preparation Kit進行文庫制備,變性和稀釋好的文庫使用Illumina Iseq100平臺二代測序。利用CLC Genomics Workbench 21軟件對原始數(shù)據(jù)進行過濾,與CV-A6參考序列進行比對和拼接。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 自GenBank中下載CV-A6不同基因型代表株序列作為參考序列,采用DNASTAR軟件對獲得的CV-A6毒株全基因組序列與CV-A6參考序列進行核苷酸和氨基酸序列分析及相似性比較,采用Mega7.0軟件的鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建CV-A6 VP1和3D區(qū)段序列的系統(tǒng)進化樹[16-17],自展值設(shè)置為1 000。對CV-A6毒株P(guān)1區(qū)和3D區(qū)氨基酸序列變異位點進行統(tǒng)計分析,統(tǒng)計學(xué)分析采用Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)整理。

1.2.5 重組分析 采用RDP4.0軟件的X-Over模塊,選擇默認參數(shù)進行重組分析。采用SimPlot 3.5.1軟件進行相似性分析。

2 結(jié) 果

2.1 測序結(jié)果分析 通過病毒分離獲得2013-2022年江蘇省共35株CV-A6毒株,其中手足口輕癥病例來源22株,手足口重癥病例來源7株,皰疹性咽峽炎輕癥病例6株。這35株CV-A6分離株來源信息如表1所示。對35份毒株進行全基因組測序并獲得全基因組序列。這35株CV-A6毒株中,14株基因組長度為7 434 bp,5′-UTR為747 bp; 10株基因組長度為7 433 bp,5′-UTR為746 bp; 13株基因組長度為7 428 bp,5′-UTR為741 bp; 2株基因組長度為7 412 bp,5′-UTR為725 bp; 1株基因組長度為7 420 bp,5′-UTR為733 bp;這35株CV-A6在編碼區(qū)沒有堿基的缺失與插入,但在3′-UTR最末端的7 432-7 434位點有5株存在3個堿基缺失。

表1 2013-2022年江蘇省CV-A6分離株樣本信息

2.2 相似性分析 35株CV-A6毒株的全基因組核苷酸和氨基酸序列相似性分別為87.5%～99.6%和97.0%～99.8%,這35株毒株的核苷酸序列差異較大,但對應(yīng)的氨基酸序列差異性無明顯變化。與CV-A6原型株Gdula/USA/1949的全基因組核苷酸序列相似性僅為80.3%～81%,氨基酸序列相似性為94.7%～95.3%。各區(qū)段比對發(fā)現(xiàn),5′-UTR、P1、P2、P3各個區(qū)域核苷酸相似性分別為94.7%～100%、88.1%～100%、87.1%～100%和84%～100%;編碼P1、P2、P3各區(qū)域氨基酸相似性分別為97.1%～100%、96.7%～100%和95.5%～100%;VP1區(qū)核苷酸和氨基酸相似性分別為87.7%～100%和97.4%～100%。

2.3 CV-A6分離株VP1基因進化分析 選取國內(nèi)外其他有代表性的CV-A6 VP1全長序列,與2013-2022年35株江蘇省CV-A6毒株進行遺傳進化分析,并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果表明,其中34株CV-A6毒株與D3a基因亞型代表株處于同一分支上,1株毒株Xinzixuan(Nanjing/2014)與基因D2亞型代表株處于同一分支(圖1)。這34株D3a亞型的CV-A6毒株相互之間的遺傳距離較為集中,親緣關(guān)系較近,相對國外地區(qū)的毒株序列,與國內(nèi)地區(qū)(如山東、云南、廣東、浙江等省份)毒株的遺傳距離和親緣關(guān)系更為接近。同時,進化樹顯示,這34株毒株在進化樹上呈現(xiàn)地區(qū)分布的聚集性,但輕癥和重癥來源的毒株、不同臨床癥狀來源的毒株(皰疹性咽峽炎病例與手足口病例)在進化樹上呈現(xiàn)隨機分布。

●:輕癥HFMD CV-A6 毒株;●:重癥HFMD CV-A6 分離株;●:皰疹性咽峽炎CV-A6 分離株

2.4 CV-A6毒株3D區(qū)進化重組分析 基于3D區(qū)進化樹的的不同分支劃分了不同重組模式,本研究發(fā)現(xiàn),2013-2022年江蘇省流行的CV-A6出現(xiàn)過4個重組進化分支,其中D3a基因亞型包含3個重組進化分支。其中26株CV-A6毒株與RF-A型代表株處于同一分支上,5株CV-A6毒株與RF-L型代表株處于同一分支,3株CV-A6毒株與RF-K型代表株處于同一分支,此外,D2基因亞型的毒株Xinzixuan(Nanjing/2014)與C型代表株處于同一分支(圖2)。

●:輕癥HFMD CV-A6 毒株;●:重癥HFMD CV-A6 分離株;●:皰疹性咽峽炎CV-A6 分離株

2.5 重組分析 通過RDP4.0軟件對35株CV-A6毒株與EV-A組各原型株或代表株全基因組序列進行重組分析,結(jié)果顯示:毒株K12188(Yangzhou/2013)、DZZ095(Suzhou/2020)、wj001(Wuxi/2015)、J9108(Yancheng/2014)和16MA47(Taizhou/2016)等均具有重組信號,親本序列有CVA14/PZ15G/JS/2012-KP036483、CVA8/SZ124/CHN/2012-KM609476、CVA7-AY421765和CVA16-U05876等。

為進一步驗證重組分析結(jié)果的可靠性,運用SimPlot 3.5.1軟件對上述具有重組信號的江蘇省毒株序列、相應(yīng)親本序列及其他EV-A原型株序列進行相似性分析,結(jié)果如圖4所示:江蘇省CV-A6毒株與CV-A6原型株Gdula/USA/1949在結(jié)構(gòu)蛋白序列(P1區(qū))上具有較高的相似性。而在非結(jié)構(gòu)蛋白(P2、P3區(qū))、5′-UTR和3′-UTR區(qū),江蘇省CV-A6毒株與其他EV-A序列相似性更高。例如BootScan分析結(jié)果也表明:RF-K型代表株K12188(Yangzhou/2013)在5′-UTR、部分P2C區(qū)段、P3區(qū)和3′-UTR區(qū)與CVA14/PZ15G/JS/2012-KP036483相似性較高;RF-L型代表株DZZ095(Suzhou/2020)、wj001(Wuxi/2015)和16MA47(Taizhou/2016)在3D區(qū)和3′-UTR區(qū)與CVA8/SZ124/CHN/2012-KM609476相似性較高;上述結(jié)果提示江蘇省CV-A6毒株與其他EV-A病毒具有多重重組現(xiàn)象。

2.6 江蘇省CV-A6毒株主要氨基酸變異位點分析 對CV-A6毒株P(guān)1區(qū)氨基酸序列變異位點分析發(fā)現(xiàn),如表2所示,與原型株Gdula/USA/1949相比,江蘇省CV-A6分離株在保守序列P1區(qū)中仍然存在較為頻繁的點突變,這些突變在輕癥和重癥病例中呈現(xiàn)無規(guī)律散在分布,并未呈現(xiàn)年度和地區(qū)規(guī)律性的氨基酸突變。此外,值得注意的是,在VP2區(qū)第179 aa位點中,RF-C型毒株發(fā)生了V→I的突變;而在VP2區(qū)第180 aa位點,除RF-C型毒株外其他均發(fā)生了F→Y的突變。

對江蘇省CV-A6分離株3D區(qū)氨基酸序列變異位點分析發(fā)現(xiàn),結(jié)果如表3所示:與原型株Gdula/USA/1949相比,不同重組模式的CV-A6分離株氨基酸突變位點存在差異,除此之外,江蘇省近2年的CV-A6毒株在3D區(qū)166 aa位點更易發(fā)生I→V的突變,在370 aa位點更易發(fā)生E→G的突變。

表3 江蘇省CV-A6分離株3D區(qū)氨基酸變異位點分析

3 討 論

HFMD為全國廣泛流行的兒童傳染性疾病,江蘇省氣候溫暖潮濕較北方地區(qū)發(fā)病率高[3],引起較多的重癥和死亡病例。以往病原學(xué)監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示,2009-2017年江蘇省引起HFMD的主要病原為EV71和CVA16[18-19],之后EV71感染率呈現(xiàn)下降趨勢,CV-A6感染率逐步上升,呈現(xiàn)流行趨勢。CV-A6被劃分為A、B、C、D四個基因型,世界流行的CV-A6絕大部分屬于D基因型,尤其是D3亞型,提示D3基因亞型毒株可能是引起CV-A6在世界范圍內(nèi)流行的主要病原[20-23]。中國流行株只見于D2和D3亞型,D3亞型是中國大陸2008年以后的絕對優(yōu)勢基因亞型,尤其是D3a分支,所以這幾年屬于CV-A6 D3a亞型的暴發(fā)階段[11]。本研究基于2013-2022年CV-A6江蘇省毒株全基因組序列,對各個編碼區(qū)進行遺傳進化及相似性分析,為江蘇省HFMD防控策略的制定及CV-A6的流行趨勢提供了詳細的分子病原學(xué)數(shù)據(jù)。

2013-2022年江蘇省CV-A6毒株相似性分析結(jié)果顯示:基于CV-A6全長序列,其核苷酸序列相似性明顯低于氨基酸序列相似性,推斷CV-A6在進化過程中的點突變大多為同義突變。此外,各區(qū)段比對發(fā)現(xiàn),非結(jié)構(gòu)蛋白P2和P3區(qū)核苷酸序列相似性低于P1區(qū)序列核苷酸相似性,這可能是由于CV-A6在流行傳播過程中,與其他EV-A在P2區(qū)和P3區(qū)發(fā)生不同程度的重組造成的。

基于VP1序列的系統(tǒng)進化樹顯示,2013-2022年35株CV-A6江蘇省分離毒株與原型株Gdula/USA/1949及國外地區(qū)毒株遺傳距離較遠,親緣關(guān)系遠,與國內(nèi)地區(qū)如云南、北京、廣州等地分離株的遺傳距離較近,親緣關(guān)系近。本研究中的34株CV-A6分屬于D3a亞型,只有1株Xinzixuan(Nanjing/2014)分屬于D2亞型;VP1進化樹中也可以看出在2014年之前存在D2和D3亞型共存的情況,而2014年之后全部轉(zhuǎn)為D3a亞型,這可能與D3a亞型相對其他亞型具有更強的傳播性和感染性有關(guān)。上述結(jié)果和其他省市如北京、深圳等地區(qū)的CV-A6流行情況一致[22,24-26],提示各地區(qū) CV-A6通過多種傳播鏈從而共循環(huán)同進化。此外,輕癥和重癥病例、皰疹性咽峽炎和手足口病例在進化樹上呈現(xiàn)隨機分布,提示CV-A6引起的臨床差異可能與VP1區(qū)的基因序列無關(guān)。

研究表明,非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒復(fù)制中起著重要作用,CV-A6可能通過與其他腸道病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白重組,更有利于病毒在人體內(nèi)的復(fù)制和傳播,因此,基于CV-A6 3D區(qū)進化樹的不同分支劃分了12種不同重組模式(RF):RF-A到RF-L[22,24]。本研究分離到的CV-A6毒株出現(xiàn)了4個重組模式,其中34株D3a基因亞型分離株存在3個重組模式:RF-A、L和K,且以RF-A為主。D2基因亞型的Xinzixuan(Nanjing/2014)則為RF-C重組模式,上述結(jié)果提示過去10年里,江蘇省CV-A6與其他A組腸道病毒有基因重組的可能。

進一步重組分析結(jié)果顯示,本研究有多株CV-A6分離株與CV-A6原型株在P1區(qū)域高度匹配,但在非結(jié)構(gòu)蛋白(P2、P3)、5′-UTR和3′-UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)與其他EV-A存在重組,且重組方式存在多樣性。已有文獻報道,CV-A6可通過與其他EV-A的重組向更有利于病毒在人體內(nèi)復(fù)制和傳播的方向進化。例如,近年來,不同重組模式的CVA6先后在上海、南京、香港引起手足口病的持續(xù)暴發(fā)[10,27-28],此外,2016-2017年在澳大利亞流行的CV-A6與同期流行的CV-A4也有發(fā)生重組[29]。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)江蘇省傳播的CV-A6通過重組的方式不斷進化,具有成為高致病力病毒的危險,而近年來CV-A6持續(xù)流行是否與現(xiàn)有CV-A6流行株發(fā)生重組有關(guān)還需更多實驗數(shù)據(jù)來證實。

CV-A6在傳播過程中,衣殼蛋白P1區(qū)中的大部分密碼子都發(fā)生了強負選擇,其中正向選擇位點VP3180和VP130可能在適應(yīng)新宿主的過程中發(fā)揮重要作用;而位點VP2130、VP2172、VP2179和VP2180位于表位EF環(huán),突變位點VP1242位于表位HI環(huán),這5個位點的變化可能會優(yōu)化對宿主的適應(yīng)性,對近年來CV-A6的高致病性和傳播性上發(fā)揮了重要作用;此外,有文獻報道VP2244、VP15、VP17、VP130、VP1137、VP1174和VP1242位點的突變可能會使得衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)、潛在的受體結(jié)合位點發(fā)生一些難以察覺的變化[23-24]。本研究對江蘇省35株CV-A6分離株氨基酸位點進行分析,與原型株Gdula/USA/1949相比,大部分突變位點在不同分離株中不存在規(guī)律性分布。但是在VP2區(qū)第179 aa位點,只有RF-C型分離株存在V→I的突變;而VP2區(qū)第180 aa位點,除RF-C型分離株外其他均發(fā)生了F→Y的突變。

由于3Dpol具有譜系特異性,3D區(qū)RdRp蛋白氨基酸的突變可能會最終影響CV-A6的致病性[24]。已有文獻報道腸道病毒3D區(qū)存在毒力位點,3D區(qū)的突變或重組可能會對臨床表型產(chǎn)生影響[30-31]。本研究中,與原型株Gdula/USA/1949相比,江蘇省不同重組模式的CV-A6分離株3D區(qū)氨基酸序列變異情況具有明顯的差異,其中,江蘇省近兩年的CV-A6分離株3D區(qū)在166 aa位點更易發(fā)生I→V的突變,在370 aa位點更易發(fā)生E→G的突變。上述3D區(qū)位點的突變是否對近年CV-A6 的傳播性和致病性產(chǎn)生影響還需進一步研究。

綜上所述,本研究通過對2013-2022年江蘇省CV-A6血清型全基因組測序分析,有助于了解江蘇省CV-A6基因重組及遺傳進化關(guān)系,解釋了近年來CV-A6成為手足口病的主要病原體的可能原因,提示江蘇省流行的CV-A6在全基因組層面有明顯的遺傳多樣性,為江蘇省CV-A6感染防控策略和疫苗研制提供一定基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

利益沖突：無