楊富萍,楊向東,于彬彬,高子厚

細(xì)菌分型是指對分屬同一種或亞種的細(xì)菌菌株采用特定的試驗方法進(jìn)行基因特征分析,并根據(jù)菌株的流行病學(xué)數(shù)據(jù),揭示被研究菌株之間的基因聯(lián)系[1]。細(xì)菌分型及檢測技術(shù)包括表型分型技術(shù)、基因分型技術(shù)、色譜與質(zhì)譜技術(shù)、細(xì)菌自動化鑒定技術(shù),但常規(guī)的分型技術(shù)主要是指表型分型技術(shù),有生物化學(xué)分型、細(xì)菌素分型、耐藥普分型等,但此類技術(shù)往往具有重復(fù)性低、操作復(fù)雜,以及分辨力較低等弊端,存在較大的局限性。近年來,分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,為細(xì)菌分型提供了更有力的手段,將細(xì)菌分型提高到分子層次。目前對細(xì)菌分子分型技術(shù)包括脈沖場凝膠電泳技術(shù)(PFGE)、多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)、多位點序列分型(MLST)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)(RFLP)、實時定量PCR(real-time PCR)[2]等。一種好的分型技術(shù)須具有操作簡單、穩(wěn)定性好、成本低、分辨率高、實驗結(jié)果易于理解、便于宣傳等優(yōu)點。在眾多微生物分子分型方法中,SNP技術(shù)作為一個新型的分型技術(shù),在微生物分子流行病學(xué)方面得到逐步肯定與發(fā)展。本文介紹了該技術(shù)在細(xì)菌分子分型中的應(yīng)用。

1 SNP技術(shù)研究概況

SNP是指基因組DNA序列中由單個核苷酸(A,T,C和G)的突變而引起的多態(tài)性,從理論上來看每一個SNP 位點都可以有4 種不同的變異形式:轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失,且發(fā)生變異頻率大于1%[3],但通常發(fā)生的變異只有兩種,即轉(zhuǎn)換和顛換,比例為2∶1[4]。出現(xiàn)在編碼區(qū)時,可分為同義SNP(sSNP)和非同義SNP(nSNP),sSNP不能修改其編碼的氨基酸,其多態(tài)性客觀的反映了細(xì)菌的進(jìn)化狀況,成為研究致病性細(xì)菌群體遺傳學(xué)、微進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)[5]。而nSNP會導(dǎo)致氨基酸的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的相關(guān)功能,特別是出現(xiàn)在結(jié)構(gòu)功能區(qū)域中的SNP;出現(xiàn)在非編碼區(qū)時,盡管此區(qū)SNP的數(shù)量眾多,但不會使個體的表型性狀發(fā)生改變,卻可以成為群體遺傳與個體進(jìn)化研究中的重要遺傳標(biāo)志。SNP最初在人類基因組中被發(fā)現(xiàn),占據(jù)人類基因組多態(tài)性的90%[6]。90年代初,SNP首次于1994年在人類分子遺傳雜志上出現(xiàn),之后于1996年由Lander ES第一次提出SNP技術(shù)作為第3代遺傳標(biāo)記[7],在人類、作物、動物等多個物種中研究逐步加深[8]。目前通過許多檢測方法,如單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、限制性酶切片段長度多態(tài)性、DNA測序、基因芯片法等已經(jīng)能獲得個體的SNP[9],SNP分析能提供完整的數(shù)據(jù)信息和具有極高的分辨率,目前不僅在個體診斷治療、臨床醫(yī)學(xué)、群體遺傳學(xué)、法醫(yī)學(xué)鑒定等研究領(lǐng)域中發(fā)揮巨大作用外,而且在鼠疫耶爾森氏菌、布魯氏菌、炭疽芽孢桿菌、結(jié)核分枝桿菌等致病菌的研究領(lǐng)域也得到廣泛應(yīng)用。

2 SNP技術(shù)的優(yōu)缺點

目前對疾病暴發(fā)的分子溯源和流行病學(xué)調(diào)查,傳統(tǒng)的表型分型方法所提供的遺傳學(xué)信息有限,且耗時費力,已遠(yuǎn)不能滿足實際需求,而基于核酸序列的各種分子分型方法迅速發(fā)展彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法的不足。SNP技術(shù)與其它分子分型技術(shù)在細(xì)菌分型中的應(yīng)用情況見表1。

表1 幾種常用細(xì)菌分子分型方法對比

與其他分子分型方法相比,SNP技術(shù)具有以下優(yōu)點:1)方便可行的實驗設(shè)計:開發(fā)合適的分析軟件,持續(xù)改進(jìn)數(shù)據(jù)庫,能在短時間內(nèi)完成實驗設(shè)計;2)數(shù)量眾多,分布廣泛。在人類基因組中,平均每一千個堿基就會出現(xiàn)一個SNP;3)遺傳穩(wěn)定,突變率僅為10-9;4)適于大規(guī)模、快速檢測?；蚪M片段的長度對分析沒有影響,操作簡便,利于自動化,縮短了研究時間;5)等位基因的大小易于預(yù)測,便于基因分型;容易受到選擇條件、環(huán)境等因子的干擾,特別適用于研究近親的微觀進(jìn)化特性[10]。總之,SNP技術(shù)簡便、自動化程度高,通量大,快速,分辨率極高,是其他分子分型技術(shù)所無法比擬的。

式中：當(dāng)時，F(xiàn)ij表示Rij相對于產(chǎn)生的損失，Rij越大，產(chǎn)生的損失越大；當(dāng)時，F(xiàn)ij表示Rij相對于產(chǎn)生的損失，

3.2 鼠疫耶爾森菌 鼠疫耶爾森菌所致的鼠疫是自然疫源性烈性傳染病,我國傳染病防治法將其列為甲類傳染病,在二戰(zhàn)時期霸權(quán)主義曾把鼠疫菌作為重要的生物戰(zhàn)劑之一。2010年Morelli等[17]對來自全球的286 株鼠疫菌進(jìn)行了比較基因組學(xué)分析,篩選出分離株集合中的17個完整基因組序列和933個SNP序列,利用這些序列推測了鼠疫菌的歷史傳播途徑——鼠疫菌在中國或中國附近進(jìn)化,并通過多次輻射傳播到歐洲、南美、非洲和東南亞,目前來自美國的分離株都顯示了一種輻射,來自馬達(dá)加斯加的分離株代表了第2種輻射。2013年Cui等[18]對分離自亞洲、歐洲、美洲和非洲等地的133株鼠疫菌菌株進(jìn)行了全基因組研究,在這些鼠疫菌的核心基因組中共找到2 326個SNP位點,該 SNP集定義了鼠疫菌自其最近的共同祖先以來的譜系,利用這些數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,推測了鼠疫菌的傳播路線——Angola菌株祖先節(jié)點的分化時間與第一次鼠疫世界大流行的時間吻合,目前世界鼠疫菌四大種系分支的形成與鼠疫第二次世界大流行(黑死病)密切相關(guān);鼠疫菌種群結(jié)構(gòu)及菌株的地理分布規(guī)律表明,古代商路(絲綢之路、唐蕃古道和茶馬古道)在鼠疫的傳播中發(fā)揮了重要作用,而青藏高原東部可能是鼠疫菌最早的起源地之一。2019年Li等[19]采用全基因組SNP分析對2018-2019年從內(nèi)蒙古分離的40株鼠疫菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究,發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古不同地區(qū)的鼠疫菌株不是由同一種動物傳播引起的,而是通過不同的動物傳播引起的。通過以上研究表明,SNP技術(shù)將有助于進(jìn)一步探索鼠疫菌的進(jìn)化關(guān)系史及其歷史傳播模式。

3.4 炭疽芽孢桿菌 炭疽芽孢桿菌是一種危害極其嚴(yán)重的“生物武器”,SNP是檢測和區(qū)分炭疽桿菌的重要診斷標(biāo)志物。2007年Van等[25]對88個分離自全球的炭疽桿菌菌株及1株Ames菌株(基因型62)進(jìn)行SNP測定分析,共鑒定出3 500個SNP,發(fā)現(xiàn)其中6個 SNP對 Ames 菌株具有高度特異性,能將Ames菌株與 88 個獨特的炭疽桿菌菌株區(qū)分開來。2021年P(guān)isarenko等[26]將1956-2018年在東西伯利亞和遠(yuǎn)東地區(qū)分離的15株炭疽桿菌的基因組序列與GenBank上公布的219個炭疽桿菌基因組序列進(jìn)行比較分析,共檢測到6 400個SNP,利用檢測到的SNP構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,將所研究的菌株分為5個不同的遺傳類群。2022年Anisimova等[27]對從土壤樣品和動物尸體中獲得的 7 株炭疽桿菌進(jìn)行SNP分析,將所研究的菌株分成四個簇。最大的集群由韃靼斯坦共和國(6、7號菌株)和烏里揚(yáng)諾夫斯克(5號)分離的三個菌株形成。第二大集群為從塔吉克斯坦收集的2號和4號菌株。剩下的由在車臣-印古什ASSR和在庫爾干地區(qū)發(fā)現(xiàn)的1號和3號菌株形成。隨著SNP技術(shù)的改進(jìn),由于SNP技術(shù)的進(jìn)步,對炭疽桿菌的分辨力和再現(xiàn)性也在逐步增強(qiáng),目前已經(jīng)是標(biāo)準(zhǔn)的炭疽桿菌分型技術(shù),為其鑒定溯源提供了有力工具。

3 SNP技術(shù)在細(xì)菌分型中的應(yīng)用

3.3 結(jié)核分枝桿菌 結(jié)核分枝桿菌是引起結(jié)核病的病原菌,以肺結(jié)核最為多見,至今仍為重要的傳染病,居各種疾病死亡原因之首,據(jù)WHO報道,每年至少有300萬人死于該病。2002年Gutacker等[20]對4株已完成全基因組測序的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行比較分析,得到了230個nSNP,并利用這些SNP對來自全球的432株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行了基因分型,最終將這些菌株分成8個基因型群。2006年Filliol等[21]使用 212 個SNP標(biāo)記分析了全球323株結(jié)核分枝桿菌集合,發(fā)現(xiàn)SNP多樣性很高,96% 的 SNP 基因座處于完全連鎖不平衡狀態(tài),通過聚類分析將這些菌株分成5個亞組。北京菌株是全球結(jié)核分枝桿菌最成功的基因型之一,根據(jù)現(xiàn)有的基因分型方法,發(fā)現(xiàn)其具有高度同質(zhì)性。Schürch等[22]、Luo Tao等[23]分別于2011、2012年先后對北京菌株進(jìn)行SNP分析,發(fā)現(xiàn)北京毒株多次在全球傳播,由北京基因型引起的結(jié)核病流行至少部分是由現(xiàn)代移民模式驅(qū)動的。非洲結(jié)核分枝桿菌(Maf)共有L5和L6兩個譜系,它們是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體(MTBC)的成員。2022年Balamurugan等[24]利用全基因組SNP的方法估計了380個Maf樣本的遺傳多樣性,觀察到基于譜系的聚類(L5和L6)具有不同的亞聚類(L5.1.1和L5.1.2,L5.2.1-L5.2.4,L6.1-L6.3),同時發(fā)現(xiàn)攜帶多個(亞)譜系特異性“核心簇”SNP的基因,如Lys117Asn、Val447Met和Ala455Val,分別存在于L6、L6.1和L5中,暗示這些SNP與選擇性優(yōu)勢或宿主適應(yīng)有關(guān)。以上研究表明SNP分析已廣泛應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌的基因分型,將有助于未來對該菌的分子流行病學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育研究。

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，組間比較采用有序分類變量兩組獨立樣本的秩和檢驗。其中P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

年終的回饋客戶活動，部門領(lǐng)到廠家的30塊Swatch贈表。我在晨會上建議，因為贈品有限，最好是配合銷售，手表贈送給購買服務(wù)器或批量PC機(jī)客戶，末了，我自鳴得意地說：“Swatch是貨真價實的瑞士名表，送給大客戶也算是好鋼用在了刀刃上?！?/p>

表2 區(qū)分6種布魯氏菌和海洋哺乳動物布魯氏菌菌株的特定SNP位點

通?？梢杂眯疗丈锒鄻有灾笖?shù)(Simpson’s diversity index,SDI)來衡量SNP的分辨率。2018年Janowicz Anna等[11]對布魯氏菌的研究顯示,108株布魯氏菌被分為51個MLVA-16型、55個cgMLST型和60個SNP型,分型的鑒別能力比較表明,基于SNP的方法優(yōu)于其他兩種方法,SDI為0.922,95%置信區(qū)間(CI)為0.866～0.978。cgMLST的SDI計算為0.815(95%CI,0.685～0.945),MVLA-16的SDI為0.674(95%CI,0.505～0.843)。2020年Ksibi等[12]對175株腸炎沙門氏菌進(jìn)行幾種分型方法比較,同樣得出基于SNP的方法優(yōu)于其他方法,SDI為0.997,MLVA為 0.889,cgMLST為0.785,PFGE為0.518。

3.1 布魯氏菌 布魯氏菌是導(dǎo)致布病的人獸共患病原菌,主要是通過接觸或者飲食等方式感染傳播給人類。2007年Scott等[13]利用SNP分析對330株布魯氏菌菌株的glk、omp25和trpE基因片段進(jìn)行測序分析,通過序列比對共篩選出6個特異性的SNP位點(表2),能夠在種水平上鑒定布魯氏菌,并最終在超過500 株菌株中得到驗證。2014年譚鵬飛等[14]為區(qū)分中國B.bovis疫苗株A19與野生株,采用基因組測序的方法,共篩選出A19基因組29個SNP位點,選取ClpX G825-C825、LysR A605-C605、Omp2b G503-A503 3個SNP位點,與布魯氏菌常見種、標(biāo)準(zhǔn)參考菌株基因組SNP進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)這3個SNP位點僅存在于A19(S19)基因組上,可用這3個SNP位點鑒別我國布魯氏菌疫苗株A19與野生菌株。2015年Tan等[15]對來自馬來西亞和菲律賓的布魯氏菌分離株進(jìn)行SNP分析,將分離株分為5個基因型:地中海菌株,被確定為基因型 I,所有亞洲菌株與SEA菌株聚集成基因型 II,基因型 III 代表非洲血統(tǒng),基因型 IV 代表歐洲血統(tǒng),基因型 V 代表美洲血統(tǒng)。2021年Zhao等[16]對2名男性血培養(yǎng)物中分離的布魯氏菌進(jìn)行SNP分析,發(fā)現(xiàn)所研究的2株菌株屬于同一基因型,但屬于不同的亞群,1株與從近東(塞浦路斯)分離的菌株最相似,1株與從中亞(俄羅斯:圖瓦共和國)分離的菌株最相似,表明了2株菌株各自的起源。通過以上研究發(fā)現(xiàn)SNP分析是布魯氏菌屬種內(nèi)鑒別的有力工具,可為追溯分析提供有關(guān)地理來源的有用信息,能對疫苗株和野生株進(jìn)行鑒別。

SNP技術(shù)自問世以來發(fā)展迅速,因其自身的特性,在細(xì)菌分型與進(jìn)化、流行病學(xué)調(diào)查研究中得到廣泛應(yīng)用。

盡管SNP技術(shù)在細(xì)菌的分型上應(yīng)用很普遍,但它本身也具有某些缺陷:1)SNP研究要求操作人員具有較高的專業(yè)水平,分析數(shù)據(jù)時需要強(qiáng)大的生信分析能力;2)對研究菌株的WGS數(shù)據(jù)品質(zhì)要求非常高,為了保證基因組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度和一致性,需要選擇很嚴(yán)謹(jǐn)?shù)募夹g(shù)標(biāo)準(zhǔn),如SNP之間的最小覆蓋范圍和允許間隔。

為打贏脫貧攻堅這場硬仗，積極引進(jìn)培育農(nóng)業(yè)經(jīng)營主體，大力發(fā)展農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)，石柱縣探索并構(gòu)建了“1+4”資產(chǎn)收益扶貧政策體系，即出臺了《關(guān)于推廣資產(chǎn)收益模式促進(jìn)經(jīng)營主體與貧困戶利益聯(lián)結(jié)共同發(fā)展的實施意見》1個實施意見，并配套股權(quán)收益扶貧、基金收益扶貧、信貸收益扶貧和旅游收益扶貧4個實施方案，多方整合財政補(bǔ)助資金，最大限度提高涉農(nóng)資金的使用效益，帶動貧困戶長期穩(wěn)定增收。

3.5 金黃色葡萄球菌 金黃色葡萄球菌是常見的食源性致病菌,廣泛存在于自然環(huán)境中。在適當(dāng)?shù)臈l件下,能夠產(chǎn)生腸毒素,引起食物中毒。2006年Huygens等[28]對在澳大利亞昆士蘭州東南部收集的 391 個金黃色葡萄球菌分離株進(jìn)行了SNP基因分型。共使用了8個SNP集,提供了整個金黃色葡萄球菌SNP數(shù)據(jù)庫的辛普森多樣性指數(shù)(SDI)為0.95,并定義了61個現(xiàn)存的金黃色葡萄球菌基因型和主要克隆復(fù)合物。2014年Holmes等[29]利用SNP分型方法對代表蘇格蘭流行的EMRSA-15基因型104株金黃色葡萄球菌分離株進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。在這些菌株的核心基因組中共鑒定出904個高質(zhì)量SNP,研究選擇了對EMRSA-15亞型具有判別意義的17個SNP進(jìn)行分析。2020年P(guān)irolo等[30]對67株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌序列398(LA-MRSA ST398)菌株進(jìn)行了全基因組測序分析,發(fā)現(xiàn)LA-MRSA ST398在意大利南部的引入和傳播存在兩種并發(fā)模式,一種是通過與包括丹麥和法國在內(nèi)的其他歐盟國家進(jìn)行仔豬交易,多次引入LA-MRSA ST398菌株;另一種是獨立的ST398克隆體的擴(kuò)展,特別是在與其他意大利農(nóng)場交易動物的農(nóng)場。通過分析證實SNP是一種快速、穩(wěn)健、可重復(fù)(分析內(nèi)變異系數(shù)<25%)的鑒別技術(shù),可以潛在地應(yīng)用于金葡菌鑒定及溯源。

3.6 在其他細(xì)菌分型中的應(yīng)用 隨著SNP技術(shù)在生物分子分型上的應(yīng)用,也有研究人員將SNP技術(shù)應(yīng)用于其他細(xì)菌研究中。例如,利用WGS數(shù)據(jù)與流行病學(xué)數(shù)據(jù)一起分析得出2017-2018年南非李斯特菌病暴發(fā)的源頭是Enterprise Foods生產(chǎn)的即食加工肉制品[31],使用SNP分型方法對全球傷寒沙門氏菌血清型進(jìn)行分型,有助于全球流行病學(xué)分析[32],采用宏基因組學(xué)聯(lián)合全基因組SNP分析等其他檢測技術(shù)對志賀菌暴發(fā)進(jìn)行病原學(xué)分析[33],使用SNP技術(shù)對大腸埃希氏菌進(jìn)行地理溯源研究[34],通過SNP基因分型推測麻風(fēng)分枝桿菌傳入我國可能的2條路線[35]。

隨著設(shè)備運(yùn)行時間的增加，使用中逐步出現(xiàn)一些問題。選煤廠對這些常見問題進(jìn)行了分析總結(jié)，掌握了故障的處理方法，同時根據(jù)現(xiàn)場實際進(jìn)行了改造，使設(shè)備運(yùn)行得以更加完善。

4 SNP生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)庫及在線工具的應(yīng)用

隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展以及相應(yīng)成本的下降,SNP數(shù)據(jù)信息日漸豐富,由此形成了許多關(guān)于致病菌的SNP信息庫。2010年McKenna A等[36]開發(fā)了基因組分析工具包(GATK),這是一個結(jié)構(gòu)化的編程框架,旨在利用MapReduce的功能編程理念為下一代DNA測序儀開發(fā)高效、穩(wěn)健的分析工具。GATK編程框架使開發(fā)人員和分析人員能夠快速和輕松地編寫高效和健壯的NGS工具,其中許多已經(jīng)被納入大規(guī)模測序項目,如1000基因組項目和癌癥基因組圖譜。2011年Winsor GL等[37]為了提供一個高質(zhì)量、帶注釋的基因組資源,便于假單胞菌物種進(jìn)行跨菌株和跨物種基因組比較,開發(fā)了假單胞菌屬基因組數(shù)據(jù)庫,有助于分析密切相關(guān)菌株之間的表型變異,以及更廣泛的群體基因組學(xué)和進(jìn)化研究。2013年Chattopadhyay S等[38]為了分析細(xì)菌菌株之間的遺傳差異(基因存在/缺失和核苷酸多態(tài)性),了解細(xì)菌發(fā)病的分子機(jī)制和選擇新的抗菌治療的靶點,建立了微生物變異組數(shù)據(jù)庫,包括22株大腸桿菌和17株腸炎沙門氏菌的完全測序基因組的核心蛋白編碼基因的點突變數(shù)據(jù)。這些資源數(shù)據(jù)庫的建立極大地方便了人類病原體的研究,并推動SNP技術(shù)的發(fā)展。

5 展 望

一種好的分型方法檢測原理要清晰嚴(yán)謹(jǐn),通量大,具有一定的自動化規(guī)模,技術(shù)上簡單快捷、成本低、精度高、可靠性強(qiáng)、分型性能好、結(jié)果易于解釋等特點。比較而言,SNP技術(shù)是相對較為理想的一種方法,隨著相關(guān)技術(shù)的不斷創(chuàng)新,方法的改進(jìn)及各類編程語言和專門化軟件的應(yīng)用使得數(shù)據(jù)分析更為便利,SNP分型技術(shù)也將向更加高效、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的方向發(fā)展。該技術(shù)具有操作簡單、快捷、點位量大、范圍廣、通量高、分辨率高等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于病原體分型?，F(xiàn)階段第二代和第三代測序技術(shù)均得到了廣泛應(yīng)用,基于細(xì)菌全基因組序列的SNP研究越來越多,大量細(xì)菌SNP數(shù)據(jù)庫也在陸續(xù)建立和完善,有利于全世界范圍內(nèi)的菌株進(jìn)行參比,進(jìn)一步深化人類對各種致病菌遺傳進(jìn)化、溯源、分子流行病學(xué)等方面的認(rèn)識,有效提升人類防控疾病的水平。SNP技術(shù)作為新一代分子標(biāo)記技術(shù)具有不可替代的優(yōu)勢,在許多致病菌的系統(tǒng)發(fā)育研究中發(fā)揮著不可取代的作用。

利益沖突：無