賀逍，郝麗，余華獻，李修志，申子剛，陳萍，2

1. 西南大學(xué) 蠶桑紡織與與生物質(zhì)科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2. 資源昆蟲高效養(yǎng)殖與利用全國重點實驗室，重慶 400715； 3. 重慶市蠶業(yè)管理總站，重慶 400020

脂肪酸是脂質(zhì)的主要成分,不僅參與生物體的生長發(fā)育[1]和營養(yǎng)代謝,還在生殖器官與生殖細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)育和成熟過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用.對于哺乳動物而言,不飽和脂肪酸(Unsaturated Fatty Acid,UFA)中的前列腺素對雄性或雌性的生殖功能及生殖能力具有積極促進作用[2].崔亞利等[3]研究表明,在小鼠飼料中添加共軛亞油酸可以顯著增加其發(fā)情期次級卵泡數(shù)量,提高胚胎數(shù)和產(chǎn)仔數(shù)[3].此外,雄性小鼠的生殖障礙與攝入的n-6/n-3多不飽和脂肪酸比值密切相關(guān)[4].對線蟲動物的研究發(fā)現(xiàn),減少n-6 多不飽和脂肪酸可以使秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)卵母細(xì)胞的大小縮小為野生型的20%,并導(dǎo)致后續(xù)胚胎發(fā)育和卵的孵化出現(xiàn)明顯的不良狀況[5,6].在節(jié)肢動物中,褐貽貝(Pernaperna)的生殖狀態(tài)與肉豆蔻酸、棕櫚油酸、油酸、異油酸以及花生四烯酸等脂肪酸關(guān)系密切[7].此外,高不飽和脂肪酸花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸能夠顯著促進甲殼類動物(如蝦、蟹)的卵巢發(fā)育,并提高后代的存活率,而不飽和脂肪酸之間的相對含量比值則會影響蝦和蟹的生殖性能[8-10].亞油酸對羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)的卵巢成熟和繁殖力具有促進作用[11].當(dāng)大型溞(Daphniamagna)體內(nèi)16碳單不飽和脂肪酸的相對含量最多時,其產(chǎn)卵量和孵化率顯著增加12].昆蟲方面的研究表明,給蠋蝽(Armachinensis)添食飽和脂肪酸會增加其后代中雌性個體的數(shù)量,而添食單不飽和脂肪酸則有利于其卵黃原蛋白的形成和生殖力的提高[13].此外,添食單不飽和脂肪酸能顯著縮短龜紋瓢蟲(Propylaeajaponica)產(chǎn)卵潛伏期,增加產(chǎn)卵總數(shù)[14].改變飼料中的脂質(zhì)濃度和ω-6/ω-3多不飽和脂肪酸比值會導(dǎo)致蜜蜂(Apismellifera)產(chǎn)卵量的改變[15].另外,給昆士蘭果蠅(Bactroceratryoni)幼蟲添食含有棕櫚油酸的小麥胚芽油可以提升其產(chǎn)卵量[16].Ling等[17]的研究結(jié)果表明,通過基因操作阻止埃及伊蚊(Aedesaegypti)卵巢積累脂質(zhì),會導(dǎo)致卵巢發(fā)育停滯,初級濾泡消失.Gutierrez等[18]研究發(fā)現(xiàn),在果蠅(Drosophilamelanogaster)中,通過敲除脂肪酸ω-羥化酶基因,其卵母細(xì)胞數(shù)量減少了50%.上述研究結(jié)果均強調(diào)了脂質(zhì)與昆蟲雌性生殖之間的密切關(guān)系．

作為鱗翅目昆蟲之一,家蠶在絲綢生產(chǎn)和科學(xué)研究中有著廣泛應(yīng)用.家蠶的生殖調(diào)控對蠶種繁育和害蟲防治具有重要意義.已有研究表明,家蠶5齡幼蟲脂肪體的增長速度明顯大于其質(zhì)量的增長速度,其中雌蠶的脂肪體增長明顯高于雄蠶,但蛹化后,雌蛹體內(nèi)脂肪體的減少速度顯著高于雄蛹,這一現(xiàn)象表明脂肪體是蛹期卵巢生長發(fā)育的重要營養(yǎng)來源[19].進一步研究發(fā)現(xiàn),在給蠶蛹注射脂質(zhì)轉(zhuǎn)運顆粒抗體以抑制脂質(zhì)轉(zhuǎn)運后,成蟲卵巢中的卵質(zhì)量降低,數(shù)量減少[20],這說明脂質(zhì)在家蠶雌蛹的生殖發(fā)育中具有重要作用.目前,關(guān)于蠶蛹脂肪酸的研究主要集中在蛹油的開發(fā)和利用方面[21-27],而生殖方面有關(guān)脂肪酸的分析研究相對較少.本研究分析了不同發(fā)育時期的雌蛹蛹體和卵巢中的脂肪酸,結(jié)果可為深入研究脂肪酸在家蠶和其他昆蟲雌性生殖中的作用機制提供重要線索．

1 材料和方法

1.1 供試材料

在大造蠶5齡幼蟲早期,根據(jù)石渡氏腺選留雌性個體,常規(guī)常濕條件下桑葉飼養(yǎng),然后選取蛹化時間相差2 h以內(nèi)、蛹體大小相似且健康的雌性個體作供試個體．

1.2 卵巢解剖

飼養(yǎng)溫度24 ℃～25 ℃,濕度75%～80%,選取在此條件下蛹化時間相差2 h內(nèi)的雌蛹個體,從蛹化之時起,每隔24 h解剖觀察1次卵巢,每個時期觀察4～6個個體,至羽化前共觀察到9個發(fā)育時間的卵巢形態(tài)．

卵巢組織的解剖在磷酸緩沖液(PBS)(pH=7.4)中進行,清除其它雜質(zhì)后用PBS洗滌2～3次備用．

1.3 RNA提取、cDNA合成以及實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析

將剛剛摘取的卵巢于液氮中研磨,用Trizol法提取總RNA,隨后用ezDNase與樣品RNA在37 ℃孵育2 min,去除基因組DNA,再以oligo dT寡核苷酸為引物,與M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 (Promega)一起,參照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA.qRT-PCR分析用SYBR Green (T-hermofisher)熒光染料標(biāo)記,以BmTIF4基因為內(nèi)參,反應(yīng)體系為: 2xSYBR Green qRT-PCR mix 10 μL; cDNA 2 μL; 引物各0.4 μL; ddH2O 7.2 μL,反應(yīng)在ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems)上完成,反應(yīng)條件為: ① 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s; 60 ℃ 30 s; ② 95 ℃ 15 s; 60 ℃ 1 min; 95 ℃ 15 s,每個樣本設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù),相對表達量用2-ΔΔCt法計算.利用SPSS軟件中的ANOVA法進行方差分析,并選用多重比較進行顯著性差異分析,其中p<0.05表示樣本間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.基因BmEP80的正向引物為AAACGGCGTCCTACAACCCTT,反向引物為TCTTGAGCGGGTGGTGGACT,基因BmA.L12的正向引物為GTGTAATGGGACAGGT,反向引物為TAGTATGGAGAACCGC．

1.4 用于脂肪酸檢測樣品采集

將摘除卵巢組織的蛹體搗碎研磨,充分混勻,使其總質(zhì)量保持在5 g以上,用于蛹體脂肪酸分析; 將卵巢搗碎研磨,充分混勻,蛹化1～3 d的卵巢使其總質(zhì)量保持在0.5 g以上,蛹化4～6 d的卵巢使其總質(zhì)量保持在1 g以上,蛹化7～9 d的卵巢使其總質(zhì)量保持在3 g以上,用于卵巢脂肪酸分析．

1.5 樣品處理

精確稱取0.500 0 g 樣品,研磨均勻后置于10 mL離心管中,每組樣品進行3次生物學(xué)重復(fù).向勻漿中加入5 mL 氯仿-甲醇混合液,高速振蕩混勻1 min,然后50 ℃超聲提取1.5 h.超聲結(jié)束后,4 000 rpm 離心2 min,將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管,重復(fù)以上提取步驟一次,并混合兩次提取液.然后向提取液中加入2 mL飽和NaCl,振蕩混勻30 s,4 000 rpm 離心10 min.將有機相轉(zhuǎn)移到新離心管,加入0.5 g無水硫酸鈉干燥.4 000 rpm 離心10 min后,將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管,50 ℃氮吹干燥,得到粗脂肪.隨后向粗脂肪中加入5 mL正己烷和3 mL氫氧化鈉溶液,振蕩混勻,放入烘箱中60 ℃甲酯化30 min.4 000 rpm 離心10 min,取上清1 mL 過0.22 μm有機濾膜,最后加入進樣瓶中進行氣相色譜檢驗．

1.6 樣品檢測

Agilent GC 7890氣相色譜儀,FID檢測器,DB-FFAP毛細(xì)管色譜柱(60 m*0.25 mm*0.5 mm).進樣量: 1 μL; 進樣口溫度: 250 ℃; 后檢測器溫度: 280 ℃; 柱溫箱保持180 ℃恒溫.分流進樣,分流比為50∶1,流速: 1 mL/min.流量比: 氫氣∶空氣∶氮氣為40∶400∶40．

1.7 數(shù)據(jù)處理

從氣相色譜檢驗中得到了不同脂肪酸的峰面積,并以此計算出每種脂肪酸在總峰面積中的占比.對3次生物學(xué)重復(fù)進行均值計算.最后得到的結(jié)果即為脂肪酸的相對含量．

2 結(jié)果

2.1 家蠶蛹期卵巢形態(tài)學(xué)觀察

家蠶雌蛹有左右兩側(cè)對稱卵巢,每側(cè)卵巢有4根卵巢管.家蠶雌蛹不同發(fā)育時期的卵巢形態(tài)如圖1所示,僅在蛹化第1,2 d和蛹化第9 d(羽化前1 d)同時顯示了左右兩側(cè)的卵巢,其余時間均顯示一側(cè)卵巢．

圖1 家蠶雌蛹不同發(fā)育時期的卵巢形態(tài)

在蛹化當(dāng)天(圖1a),可以觀察到卵巢管突破卵巢被膜,隨著發(fā)育的進行,卵巢管不斷在體腔內(nèi)延伸,到蛹化第3 d,卵巢管長度顯著增加(圖1a-1c),并向體腔延長擴展.在蛹化初期,卵管細(xì),管內(nèi)卵小,且呈透明狀,從蛹化第4 d開始,可以觀察到卵巢管增粗,到了蛹化第6 d,卵巢管最遠(yuǎn)端的卵內(nèi)出現(xiàn)明顯的營養(yǎng)物質(zhì)積累,伴隨著卵體積的增大,卵色由白色轉(zhuǎn)變?yōu)榈S色(圖1d-1f).蛹化第7 d,卵巢管進一步擴張并充滿體腔,卵巢管中正在積累營養(yǎng)物質(zhì)的卵以及營養(yǎng)物質(zhì)積累完成的卵的數(shù)量由遠(yuǎn)及近顯著增加(圖1g).到了蛹化第8 d,卵巢管內(nèi)的大部分卵已經(jīng)完成了營養(yǎng)物質(zhì)的積累,遠(yuǎn)端的少部分卵形成卵殼,形狀也由圓形變?yōu)闄E圓形,卵色變淡,卵間橋連消失,彼此分離,卵子發(fā)育成熟 (圖1h).蛹化第9 d,卵巢幾乎占據(jù)了整個體腔,卵巢管內(nèi)的大部分卵發(fā)育成熟,等待排出體外(圖1i)．

2.2 雌蛹發(fā)育過程中卵巢發(fā)育和卵子發(fā)生階段的代表性時期

卵巢發(fā)育和卵子發(fā)生是一個連續(xù)的過程.在蛹期,卵巢發(fā)育的同時,卵管內(nèi)的卵子也在迅速發(fā)育,直到羽化時,卵巢內(nèi)的所有卵子均發(fā)育成熟.卵子發(fā)生可以分為6個階段: 卵黃生成前期、卵黃生成期、卵黃生成末期、卵殼生成前期、卵殼生成期和卵殼生成末期[27].通過對卵巢形態(tài)和卵管內(nèi)卵子的連續(xù)觀察,結(jié)合蛹期的發(fā)育過程,將蛹化后的4個時期作為卵巢發(fā)育和卵子發(fā)生的代表性時期,即: 蛹化第1 d(卵巢管突破卵巢被膜,管內(nèi)卵子依稀可見)、蛹化第3 d(卵巢管快速延伸增長,管內(nèi)卵子透明且清晰可見)、蛹化第6 d(卵巢管最遠(yuǎn)端卵子內(nèi)有明顯的營養(yǎng)物質(zhì)積累,體積增大,顏色由白色轉(zhuǎn)為淡黃色)和蛹化第9 d(除近端的少數(shù)卵外,卵管內(nèi)的大部分卵子成熟,形成卵殼,形狀由圓形變成橢圓形,卵間橋連消失,彼此分離并移向輸卵管)．

圖2 兩個家蠶蛹卵巢發(fā)育標(biāo)志基因的表達變化

在卵管內(nèi),卵子按線性順序依次發(fā)育,相鄰卵子之間的發(fā)育時間間隔為 2～2.5 h,最先發(fā)育和成熟的是最遠(yuǎn)端的卵子[27].然而,這種順序發(fā)育的特點可能導(dǎo)致上述時期在卵子發(fā)生方面的代表性不足.為此,使用qRT-PCR分析了蛹化第3 d和蛹化第6 d卵巢中卵黃膜蛋白編碼基因BmEP80(卵黃生成期標(biāo)志基因)和絨毛膜B類蛋白L12基因BmA.L12(卵殼生成期標(biāo)志基因)的表達情況.結(jié)果如圖2所示,卵黃生成期標(biāo)志基因BmEP80在蛹化第3 d微量表達,在蛹化第6 d有高量表達,兩個時期的基因表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.而卵殼生成標(biāo)志基因BmA.L12在兩個時期均未檢測到表達.因此,可以得出以下結(jié)論: ① 蛹化第3 d,卵子發(fā)育處于卵黃生成的萌發(fā)階段; ② 蛹化第6 d,卵子發(fā)育正處于卵黃大量生成階段,卵殼形成尚未開始.這兩個時期在卵子發(fā)生上存在明顯差異,可以作為卵子發(fā)生階段的代表性時期.故蛹化后卵子發(fā)生階段的4個代表性時期為: 蛹化第1 d,卵子發(fā)育啟動; 蛹化第3 d,卵黃生成開始; 蛹化第6 d,卵黃大量生成; 蛹化第9 d,卵子成熟,卵殼生成完畢．

2.3 蛹發(fā)育過程中雌蛹體脂肪酸豐度

利用高效氣相色譜(GC)從蛹體的粗脂肪中搜索C4至C24共37種脂肪酸,結(jié)果檢測到了12種脂肪酸,分別是肉豆蔻酸、十五碳烯酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、珍珠酸、銀杏酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸、花生酸、花生三烯酸.在蛹體中,α-亞麻酸含量最豐富,豐度最高,為37.687%～48.640%,油酸次之,豐度為19.262%～20.280%,后面依次是棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸,豐度分別為14.085%～15.716%,8.613%～14.199%,6.349%～8.501%,這些脂肪酸總豐度在96%以上,屬于蛹體的主要脂肪酸,其余7種脂肪酸總豐度不超過4%,屬于微量脂肪酸(表1,表2)．

蛹化第1 d到第6 d,蛹體中各主要脂肪酸的豐度變化較小.然而,從蛹化第6 d到第9 d,可以觀察到α-亞麻酸豐度明顯下降,從48.207%降至37.687%,下降幅度為10.520%; 相反,硬脂酸的豐度顯著增加,從8.613%上升至14.199%,增長幅度為5.586%.在此期間,亞油酸的豐度略微升高,從6.948%上升至8.501%,增長幅度為1.553%.其它兩種主要脂肪酸的豐度變化幅度較小(表1).主要脂肪酸的總豐度在蛹化第1 d至第6 d變化較小,而在第9 d出現(xiàn)明顯下降(表1).7種微量脂肪酸的豐度變化方向各不相同,但總體隨發(fā)育的進行而增加,這與主要脂肪酸的變化趨勢不同.值得注意的是,微量脂肪酸在蛹化第1 d至第6 d的變化幅度明顯小于第6 d到第9 d的變化幅度,這與主要脂肪酸的變化特征相似(表2)．

表1 家蠶雌蛹蛹體(不帶卵巢)主要脂肪酸豐度

表2 家蠶雌蛹蛹體(不帶卵巢)微量脂肪酸豐度

2.4 雌蛹發(fā)育過程中卵巢脂肪酸豐度

在卵巢中,同樣檢測到了12種脂肪酸,其中α-亞麻酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸的豐度均超過5%,屬于主要脂肪酸,其總豐度為88%～98%(表3); 剩余7種脂肪酸是微量脂肪酸,其總豐度在蛹化第1 d以外的其它3個時期都低于6%(表4)．

與蛹體不同,卵巢中大多數(shù)主要脂肪酸在整個發(fā)育過程中均發(fā)生了明顯變化,蛹化第1 d至第6 d的變化幅度大于第6 d至第9 d的變化幅度(表3,表4).總體而言,脂肪酸變化的趨勢如下: 隨著發(fā)育的進行,不飽和脂肪酸的豐度增加,飽和脂肪酸的豐度下降(表3).其中,油酸的豐度隨發(fā)育不斷上升,而硬脂酸的豐度隨發(fā)育不斷下降;α-亞麻酸和亞油酸的豐度從蛹化第1 d至第6 d持續(xù)上升,然后略微下降; 棕櫚酸的豐度在蛹化第1 d至第6 d先下降,后略微升高(表3).整個過程變化幅度最大的是α-亞麻酸,其豐度從10.760%上升至46.802%,增長幅度為36.042%,其次是硬脂酸,其豐度從31.811%下降至6.835%,下降幅度為24.976%; 棕櫚酸的豐度從27.469%下降至14.171%,下降幅度為13.298%; 油酸的豐度從12.937%上升至24.420%,增長幅度為11.483%; 亞油酸的豐度由5.758%上升至8.978%,增長幅度為3.220%,變化幅度最小(表3).卵巢中主要脂肪酸的總豐度在蛹化第1 d至第6 d隨發(fā)育不斷升高,但增長速度逐漸減緩,在第6 d至第9 d變化甚微.卵巢主要脂肪酸的總豐度呈上升趨勢．

表3 家蠶蛹卵巢主要脂肪酸豐度

表4 家蠶蛹卵巢微量脂肪酸豐度

卵巢微量脂肪酸在整個發(fā)育過程中豐度變化顯著,且蛹化第1 d至第6 d的變化幅度大于蛹化第6 d至第9 d的變化幅度(表4).與主要脂肪酸的變化趨勢不同的是,卵巢中微量脂肪酸的總豐度隨發(fā)育逐漸下降．

2.5 蛹發(fā)育過程中雌體卵巢脂肪酸豐度差異

通過比較雌蛹蛹體和卵巢中的主要脂肪酸豐度可以發(fā)現(xiàn),在蛹化初期,卵巢主要脂肪酸中的不飽和脂肪酸豐度低于蛹體,特別是α-亞麻酸和油酸,二者在卵巢中的豐度明顯低于蛹在體中的豐度,而卵巢中的飽和脂肪酸(硬脂酸和棕櫚酸)的豐度明顯高于蛹體(圖3).隨著發(fā)育的進行,卵巢中各主要脂肪酸的豐度與蛹體中主要脂肪酸的豐度之間的差距逐漸縮小,直到趨于一致,但在發(fā)育后期又出現(xiàn)了差異.具體而言,α-亞麻酸豐度差異在蛹化第1 d為37.880%,第3 d為21.095%,第6 d為1.045%,第9 d為6.366%; 硬脂酸豐度差異在蛹化第1 d為23.191%,第3 d為12.958%,第6 d為1.520%,第9 d為7.364%; 棕櫚酸豐度差異在蛹化第1 d為11.753%,第3 d為3.330%,第6 d為0.086%,第9 d為1.106%; 油酸豐度差異在蛹化第1 d為6.325%,第3 d為0.630%,第6 d為0.619%,第9 d為4.158%; 亞油酸豐度差異在蛹化第1 d為0.924%,第3 d為0.352%,第6 d為2.030%,第9 d為0.765%(表5).蛹化第6 d,卵巢和蛹體中的α-亞麻酸、油酸、硬脂酸和棕櫚酸豐度,差異最小,但到了蛹化第9 d,卵巢和蛹體中相應(yīng)脂肪酸的差異略微增大.與其它主要脂肪酸相比,亞油酸豐度變化稍有不同: 蛹化第3 d,它在蛹體和卵巢中的豐度差異最小,而在蛹化第6 d,豐度差異最大(圖3b,3c).微量脂肪酸在蛹體和卵巢之間的豐度差異變化趨勢與主要脂肪酸相似,即在蛹化初期差異最大,隨發(fā)育逐漸縮小.除個別脂肪酸(如棕櫚油酸)在卵巢和蛹體中的豐度差異在蛹化第9 d最小外,其余微量脂肪酸在蛹化第6 d差異最小,第9 d差異略有增加(表2,表4)．

圖3 不同時期蛹體-卵巢主要脂肪酸豐度比較

3 討論

家蠶蛹期的雌性生殖發(fā)育包括卵子發(fā)生和卵巢發(fā)育.卵子發(fā)生隨卵巢發(fā)育而啟動[28].在發(fā)育過程中,卵巢會出現(xiàn)明顯的形態(tài)變化.然而,由于卵巢管內(nèi)排列的眾多卵子具有不同步的連續(xù)發(fā)育時間特性,僅依靠卵巢形態(tài)觀察來區(qū)分雌性生殖發(fā)育階段的代表性時期可靠性較低.為了解決這一問題,研究采用qRT-PCR分析了卵巢卵黃生成標(biāo)志基因BmEP80和卵殼生成標(biāo)志基因BmA.L12,在蛹化第3 d(卵管快速伸長期)和蛹化第6 d(初見卵內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)積累期)的表達水平.研究結(jié)果顯示,蛹化第3 d卵子發(fā)育處于卵黃生成的萌發(fā)階段,而蛹化第6 d卵子發(fā)育正值卵黃大量生成和卵殼形成前期.這兩個時期在卵子發(fā)生方面表現(xiàn)出明顯差異,因此具有代表性,可以用來區(qū)分雌性生殖發(fā)育階段．

研究檢測了不同發(fā)育時期雌蛹體內(nèi)脂肪酸,結(jié)果顯示,在所有時期均檢測到了12種脂肪酸的存在.其中,棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸的豐度較高,被認(rèn)為是主要脂肪酸,這一結(jié)果與之前的報道一致[20-26].不同的是,α-亞麻酸是蛹體中豐度最高的脂肪酸,與大多數(shù)雌雄混合分析認(rèn)為油酸是家蠶蛹體含量最高的脂肪酸不同,可能是α-亞麻酸含量在雌蛹比在雄蛹高的緣故[29-30].此外,還檢測到了7種微量脂肪酸,包括肉豆蔻酸、棕櫚油酸、花生酸、花生三烯酸、十五碳烯酸、十七烷酸和銀杏酸.然而,研究未檢測到蔡沙等[25]和張雨麗等[22]發(fā)現(xiàn)的十三碳酸、月桂酸(十二烷酸)和十九酸．

雌蛹脂質(zhì)含量隨發(fā)育快速減少[19,31].結(jié)果顯示,在蛹化第1 d至第6 d,雌蛹蛹體中各主要脂肪酸的豐度變化較小且相對穩(wěn)定.這表明,在這個發(fā)育階段,主要脂肪酸被消耗利用的速度與總脂質(zhì)下降的速度相似,并且各主要脂肪酸利用均衡.蛹化第6 d至第9 d,蛹體內(nèi)主要脂肪酸的總豐度下降,這可能是豐度最高的α-亞麻酸顯著下降所致.這表明,在這個時期,雌蛹蛹體對α-亞麻酸有偏好利用的趨勢.與此同時,蛹體中硬脂酸和亞油酸豐度發(fā)生了明顯增加,這可能源于蛹體中豐度最高的α-亞麻酸消耗較多,導(dǎo)致豐度相對較低的脂肪酸出現(xiàn)增加,這些脂肪酸在機體中消耗利用較少甚至不被利用.此外,隨著發(fā)育的進行,蛹體中微量脂肪酸的總豐度逐漸增加,尤其是在蛹化第6 d至第9 d,當(dāng)主要脂肪酸的豐度出現(xiàn)下降時,微量脂肪酸的豐度明顯上升.這可能是由于機體利用和消耗微量脂肪酸的速度低于主要脂肪酸或總脂肪酸的速度.本研究中雌蛹體內(nèi)的5種主要脂肪酸的豐度,雖然在大小順序上與現(xiàn)有的報道一致,但在具體的豐度上有些脂肪酸存在明顯差異,這可能源于所用實驗材料和方法不同[29]．

蛹化后,卵巢隨發(fā)育迅速增長.在蛹化初期,卵巢內(nèi)含有細(xì)小的卵管和少量卵.隨著卵管的快速延伸和卵內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的積累,卵巢迅速增大,并最終占據(jù)了蛹體大部分的體腔.據(jù)報道,羽化前卵巢中的脂質(zhì)含量是蛹化當(dāng)天卵巢中脂質(zhì)含量的100多倍,并且羽化前單位卵巢質(zhì)量的脂質(zhì)濃度比蛹化當(dāng)天單位卵巢質(zhì)量的脂質(zhì)濃度高75%以上,卵巢隨發(fā)育聚集了大量脂質(zhì)[31].結(jié)果顯示,蛹體內(nèi)的5種主要脂肪酸同樣也是卵巢中的主要脂肪酸.在整個蛹期,卵巢各主要脂肪酸的豐度隨發(fā)育不斷變化,不同類型的脂肪酸的變化幅度和方向各不相同.其中,不飽和脂肪酸的豐度隨發(fā)育增加,飽和脂肪酸豐度則顯著下降.在發(fā)育過程中卵巢對不同類型脂肪酸的積累速度存在差異.卵巢更傾向于積累不飽和脂肪酸,因此α-亞麻酸和油酸豐度顯著增加.與蛹化第6 d相比,蛹化第9 d卵巢主要脂肪酸的總豐度變化微小.然而,豐度最高的α-亞麻酸發(fā)生下降,而油酸的豐度明顯升高,這表明,在這個階段卵巢積累α-亞麻酸的速度下降、而積累油酸的速度提高,很可能與卵殼生成、卵子成熟有關(guān).有研究表明雌蛹卵巢脂肪酸的豐度在發(fā)育過程中變化較小且相對穩(wěn)定,α-亞麻酸與硬脂酸的豐度相似,并明顯低于油酸、棕櫚酸和亞油酸的豐度.這與本實驗結(jié)果有很大不同[31-32].然而,他后來提出的家蠶早期胚胎中主要脂肪酸的豐度大小順序與本實驗結(jié)果中蛹化第9 d卵巢的主要脂肪酸豐度大小順序完全一致[31-32]．

蛹化后,蛹體的脂質(zhì)逐漸減少,而卵巢中的脂質(zhì)明顯增加[19,31].研究結(jié)果顯示,蛹體中主要脂肪酸的總豐度呈現(xiàn)下降趨勢,而卵巢中主要脂肪酸明顯上升.相反,微量脂肪酸的總豐度在蛹體中上升,在卵巢中明顯下降,這表明隨著發(fā)育的進行,主要脂肪酸在蛹體中大量消耗、在卵巢中大量積累,而微量脂肪酸在蛹體中的消耗較少、卵巢中的積累也較少,由此推測主要脂肪酸與蛹期雌性生殖發(fā)育的相關(guān)性大于微量脂肪酸．

昆蟲卵泡在體外新合成的脂肪酸量相當(dāng)于成熟卵子中脂肪酸的1%左右,而卵巢自身很少或幾乎不合成脂肪酸[33-34].卵巢中積累的脂質(zhì)主要來自蛹體轉(zhuǎn)運[31].對比蛹體與卵巢中主要脂肪酸的豐度發(fā)現(xiàn),二者在蛹化當(dāng)天存在顯著差異,隨著發(fā)育的進行,卵巢和蛹體之間的差異逐漸縮小,卵巢中原本豐度低于蛹體的脂肪酸開始增加,而原本豐度高于蛹體的脂肪酸開始下降.蛹化第6 d,棕櫚酸、硬脂酸、油酸和α-亞麻酸的差異最小,即此時它們在卵巢的豐度與蛹體的豐度相似.從蛹化第1 d至第6 d,蛹體中各主要脂肪酸的豐度變化較小,而這個發(fā)育時期中蛹體棕櫚酸、硬脂酸、油酸、α-亞麻酸的豐度,與蛹化第6 d卵巢中相應(yīng)脂肪酸的豐度接近,這種同質(zhì)性表明卵巢發(fā)育和卵黃生成對蛹體的高度依賴性.至蛹化第9 d,這4種主要脂肪酸的豐度差異略微增加,可能與卵殼生成和卵子成熟有關(guān),同時也與成蟲器官重塑即將完成有關(guān),因為在這個階段,蛹體中主要脂肪酸的消耗速度超過總脂質(zhì)的消耗速度,而卵巢中主要脂肪酸的積累速度與總脂質(zhì)的積累速度接近.與前述4種主要脂肪酸不同,亞油酸在蛹化第3 d的差異最小,而在蛹化第6 d的差異最大,它在卵巢中的豐度顯著升高并明顯高于蛹體中亞油酸的豐度,出現(xiàn)了亞油酸的豐度高于硬脂酸的情況,這種現(xiàn)象一直持續(xù)到蛹化第9 d.這與蛹體中硬脂酸豐度高于亞油酸豐度的恒定順序不同,顯示了卵巢發(fā)育卵子發(fā)生的特異性．

4 結(jié)論

通過分析卵巢發(fā)育卵子發(fā)生特征時期蛹體-卵巢脂肪酸豐度,顯示了卵巢發(fā)育、卵子發(fā)生過程中蛹體脂肪酸消耗和卵巢脂肪酸積累的特征,為進一步深入探究脂肪酸在變態(tài)昆蟲(如家蠶)生殖中的作用及機制提供了線索．