任萃文，陸 勇

（哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司，黑龍江 哈爾濱 150025）

甲鈷胺注射液（規(guī)格：1 ml:0.5 mg）為治療周圍神經(jīng)病類藥，主要適用于缺乏維生素B12引起的巨紅細胞性貧血的治療[1]。甲鈷胺注射液原研廠家為日本衛(wèi)材株式會社，商品名為“彌可保”，規(guī)格為1 ml:0.5 mg，參比制劑為Eisai Co.,Ltd.在國內(nèi)上市的原研藥品和衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司的國外原研企業(yè)在中國境內(nèi)生產(chǎn)的藥品。《中國藥典》2020年版收載了甲鈷胺和甲鈷胺注射液[2]，日本和韓國藥典收載了甲鈷胺質(zhì)量標準[3-4]。本文對甲鈷胺注射液質(zhì)量標準中有關(guān)物質(zhì)的分析方法進行了研究和優(yōu)化，以期為藥品研發(fā)人員提供參考。

1 甲鈷胺理化性質(zhì)

甲鈷胺（mecobalamin），化學名稱：Coα-[α-（5,6-二甲基苯并咪唑基）]-Coβ-甲基鈷酰胺，分子式：C63H91CoN13O14P，分子量：1344.40。深紅色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，見光易分解；在水或乙醇中略溶，在乙腈、丙酮或乙醚中幾乎不溶。甲鈷胺原料具有引濕性；200 ℃左右變黑，240 ℃左右分解；水溶液（1→100）pH值約為6，解離常數(shù)pKa=2.7（測定法：紫外-可見分光光度法）。其結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 甲鈷胺結(jié)構(gòu)式

2 儀器與試藥

2.1 儀器

2695型高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；MS205DU型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；SHH-200HWD-2型藥品高溫試驗箱（重慶市永生實驗儀器廠）；SHH-200DG型藥品強光穩(wěn)定性試驗箱（重慶市永生實驗儀器廠）；FE28型酸度計（瑞士梅特勒公司）。

2.2 試藥

甲鈷胺對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100692-201805）；氰鈷胺對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100248-201705）；羥鈷胺對照品（批號：EP H1428000）；甲鈷胺注射液[哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司，批號：200801，200802，200803，日本衛(wèi)材株式會社，批號：170479，170674，衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司，批號：190105A，190206A]；乙腈（色譜純，美國Fisher Chemical公司）。

3 方法與結(jié)果

3.1 色譜條件

色譜柱：Agela Venusil MP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A：含0.47 %己烷磺酸鈉的0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸或氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH至4.5）-乙腈（85:15），流動相B：乙腈，柱溫：40 ℃，流速：1.3 ml/min，波長：266 nm，進樣量：10 μl，洗脫梯度變化見表1。

表1 洗脫梯度表

3.2 溶液配制

3.2.1 甲鈷胺對照品溶液 取甲鈷胺對照品適量，精密稱定，加水溶解并稀釋制成每1 ml中含5 μg的溶液。

3.2.2 羥鈷胺對照品溶液 取羥鈷胺對照品適量，精密稱定，加水溶解并稀釋制成每1 ml水中約含羥鈷胺10 μg的溶液。

3.2.3 供試品溶液 取樣品5支，混勻。

3.2.4 系統(tǒng)適用性溶液 取氰鈷胺和羥鈷胺對照品適量，加水溶解并稀釋成每1 ml中含氰鈷胺、羥鈷胺各約25 μg的溶液。

3.3 系統(tǒng)適用性試驗

取系統(tǒng)適用性溶液，按3.1項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。按氰鈷胺、羥鈷胺的順序出峰，氰鈷胺峰與羥鈷胺峰分離度大于3.0。

3.4 專屬性試驗

3.4.1 空白干擾試驗 取溶劑、空白輔料溶液、系統(tǒng)適用性溶液、甲鈷胺對照品溶液和供試品溶液，按3.1項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。

3.4.2 酸降解試驗 取本品1 ml，加入1 mol/L鹽酸溶液100 μl，放置12 h，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液100 μl中和，搖勻，作為酸破壞降解溶液。

3.4.3 堿降解試驗 取本品1 ml，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液100 μl，放置12 h，加入1 mol/L鹽酸溶液100 μl中和，搖勻，作為堿破壞降解溶液。

3.4.4 氧化降解試驗 取本品1 ml，加入3 %過氧化氫溶液100 μl，劇烈振搖，放置10 h，作為氧化破壞降解溶液。

3.4.5 熱降解試驗 取本品，于100 ℃條件放置1 h后取出，放冷至室溫，作為熱破壞降解溶液。

3.4.6 光降解試驗 取本品，于5000 Lux光照條件下30 s后取出，作為光破壞降解溶液。

空白干擾試驗結(jié)果見圖2。由圖2可見，溶劑及空白輔料溶液對甲鈷胺、氰鈷胺和羥鈷胺均無干擾。強制降解試驗結(jié)果見圖3。由圖3可見，甲鈷胺注射液在酸、堿、氧化、高溫條件下均不穩(wěn)定，在光照條件下極不穩(wěn)定。產(chǎn)生的未知降解雜質(zhì)均能與主峰及已知雜質(zhì)得到良好的分離，專屬性良好。

圖2 空白干擾試驗圖譜

圖3 強制降解試驗圖譜

3.5 檢測限和定量限

分別取甲鈷胺和羥鈷胺對照品適量，用水定量逐級稀釋，以信噪比（S/N）=3時相應濃度為檢測限，以信噪比（S/N）=10時相應濃度為定量限。結(jié)果本品甲鈷胺和羥鈷胺的檢測限均為0.5 ng，定量限分別為1.7 ng和1.6 ng。

3.6 線性試驗

取甲鈷胺對照品貯備液（濃度：0.5 mg/ml）和羥鈷胺對照品儲備液（濃度：1.0 mg/ml），精密量取各對照品儲備液適量，分別梯度稀釋成甲鈷胺濃度為0.2，1.0，2.0，5.0，10 μg/ml，羥鈷胺濃度為0.2，2.0，5.0，10.0，20 μg/ml的系列溶液，以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸。甲鈷胺回歸方程為y=0.1199x-0.003，r=0.9999，羥鈷胺回歸方程為y=0.0875x-0.005，r=1，表明甲鈷胺在0.2～10 μg/ml，羥鈷胺在0.2～20 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.7 精密度試驗

取供試品溶液，連續(xù)進樣6針，羥鈷胺峰面積RSD為0.5 %，甲鈷胺峰面積RSD為1.2 %，表明儀器精密度良好。

3.8 重復性試驗

取6份供試品溶液，重復進樣，羥鈷胺含量RSD為0.3 %，最大單個雜質(zhì)含量RSD為0.6 %，總雜質(zhì)含量RSD為0.2 %。

3.9 中間精密度試驗

不同實驗人員于不同日期，在不同儀器上進行重復性試驗，12份供試品羥鈷胺含量RSD為2.9 %，最大單個雜質(zhì)含量RSD為1.5 %，總雜質(zhì)含量RSD為3.1 %。

3.10 回收率

取本品，加入羥鈷胺對照品使其含量分別為限度濃度的20 %，100 %，150 %，平行配制3份，分別進樣，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 回收率檢測結(jié)果

3.11 溶液穩(wěn)定性和耐用性試驗

供試品溶液在室溫避光放置48 h后與0 h相比，各雜質(zhì)含量的相對偏差均小于2.0 %。波長變化±2 nm、柱溫變化±5 ℃、流速變化±0.2 ml/min、流動相中磷酸鹽濃度變化±0.01 mol/L和不同批號色譜柱條件下，系統(tǒng)適用性溶液中氰鈷胺峰與羥鈷胺峰分離度均大于3.0；與標準條件比較，供試品溶液各雜質(zhì)含量變化相對偏差均在5 %以內(nèi)，表明方法的耐用性好。

3.12 有關(guān)物質(zhì)檢測

測定3家企業(yè)的7批樣品有關(guān)物質(zhì)，自制樣品質(zhì)量水平均不低于參比制劑，結(jié)果見表3。

表3 不同廠家、不同批次樣品有關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果/%

4 討論

4.1 洗脫方法

對比分析韓國藥典、日本藥典、中國藥典及文獻[5]所使用的有關(guān)物質(zhì)檢測方法，主要區(qū)別于在檢測波長和流動相系統(tǒng)。中國藥典采用的檢測波長是342 nm，日本和韓國藥典采用的是266 nm；流動相均采用了磷酸鹽和乙腈體系，日本和韓國另加入了離子對試劑。經(jīng)實驗證實，流動相中離子對試劑對氰鈷胺、羥鈷胺的洗脫和分離影響較大，氰鈷胺、羥鈷胺使用低有機相比例的流動相分離度較好，但甲鈷胺在低有機相比例中保留明顯增強，整個檢測時間延長。因此，為了使各雜質(zhì)能夠有效分離，溶劑和空白輔料不干擾測定，同時確保雜質(zhì)檢出的靈敏度，在國內(nèi)外藥典檢測方法基礎(chǔ)上，設計梯度洗脫，最終確定優(yōu)化的色譜條件。

4.2 檢測波長

對甲鈷胺對照品溶液、氰鈷胺對照品溶液、羥鈷胺對照品溶液在190 nm～400 nm波長掃描。結(jié)果，甲鈷胺最大吸收波長為266 nm和342 nm，氰鈷胺最大吸收波長為278 nm和360 nm，羥鈷胺最大吸收波長為274 nm和350 nm。對經(jīng)強光、高溫和氧化強降解后的自制樣品和參比制劑分別采用DAD全波長掃描，參照各國標準中有關(guān)物質(zhì)檢測波長，提取266 nm和342 nm波長的檢測數(shù)據(jù)。已知雜質(zhì)氰鈷胺在強降解條件下變化不大，已知雜質(zhì)羥鈷胺342 nm檢出量優(yōu)于266 nm，未知雜質(zhì)266 nm的檢出總量及檢出個數(shù)優(yōu)于342 nm，自制樣品與參比制劑結(jié)果基本一致，故選擇266 nm作為有關(guān)物質(zhì)檢測波長，數(shù)據(jù)結(jié)果見表4。

表4 強降解后樣品考察結(jié)果

4.3 色譜柱對雜質(zhì)檢出的影響

本試驗分別對GL Sciences Inertsil ODS-3v（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters xselect@HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、OMNI Orca C18-AB（250 mm×4.6 mm，5 μm）3個廠家的色譜柱分離及檢出效果進行考察，見圖4。結(jié)果顯示，不同品牌和型號的色譜柱對雜質(zhì)的分離度及雜質(zhì)的檢出量影響較大，系統(tǒng)適用性測試需關(guān)注不同色譜柱的影響。

圖4 不同廠家色譜柱HPLC圖譜比較

4.4 各雜質(zhì)限度

制劑的降解產(chǎn)物會影響產(chǎn)品的安全性，必須依據(jù)藥典、ICH要求及參比制劑質(zhì)量進行控制，以減少對患者的影響。產(chǎn)品中每種雜質(zhì)及總雜質(zhì)限度更應基于參比制劑質(zhì)量進行設定[6]。已知雜質(zhì)羥鈷胺是甲鈷胺注射液中的主要降解產(chǎn)物，本法設定的266 nm波長并非為羥鈷胺的最大吸收波長，為了能更準確地控制該雜質(zhì)，采用外標法進行計算，羥鈷胺限度為不大于2.0 %；參照多批樣品穩(wěn)定性考察結(jié)果，制定其他單個雜質(zhì)不大于0.5 %、總雜質(zhì)不大于2.5 %，限度嚴于國家標準。

5 小結(jié)

本文對甲鈷胺注射液有關(guān)物質(zhì)分析方法從洗脫方法、檢測波長、色譜柱選擇等方面進行優(yōu)化研究，并進行了方法學驗證，采用建立的新方法對多批產(chǎn)品進行分析，并與參比制劑進行質(zhì)量對比，科學合理地制定了雜質(zhì)的計算方法和限度，提高了產(chǎn)品質(zhì)量，以保證患者的用藥安全。