潘瑞雪，江玉娟，許 敏，王 莉，袁倩倩，高 超，崔 陽(yáng)，劉 杰

（山東明仁福瑞達(dá)制藥股份有限公司 山東省骨科疼痛類(lèi)藥物工程研究中心，山東 濟(jì)南 250104）

他達(dá)拉非是磷酸二酯酶（PDE5）的選擇性抑制劑，用于治療男性勃起功能障礙及勃起功能障礙合并良性前列腺增生的癥狀和體征，與其他同類(lèi)藥物相比，他達(dá)拉非具有選擇性高、半衰期長(zhǎng)、耐受性好等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。他達(dá)拉非片原研公司為美國(guó)禮來(lái)，2002年11月在歐盟15個(gè)成員國(guó)獲準(zhǔn)上市；2003年11月獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，2004年12月獲批進(jìn)口中國(guó)[3]。

近年，仿制藥質(zhì)量和療效一致性評(píng)價(jià)工作不斷推進(jìn)。本研究以國(guó)家藥品監(jiān)督管理局公布的參比制劑目錄為依據(jù)，選定由禮來(lái)公司生產(chǎn)的希愛(ài)力作為參比制劑，仿制了規(guī)格為20 mg的他達(dá)拉非片。參考國(guó)家頒布的相關(guān)指導(dǎo)原則[4-5]，通過(guò)槳法研究他達(dá)拉非片在不同pH介質(zhì)中的溶出行為，建立了他達(dá)拉非片具有區(qū)分力的溶出度檢查法，以期為后續(xù)仿制藥一致性評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-2040C 3D型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Logan 812A-12型智能溶出儀（美國(guó)LOGAN公司）；XPE205型電子天平（梅特勒-托利多公司）；ZWY-111B型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智誠(chéng)）。

1.2 藥品與試劑

他達(dá)拉非對(duì)照品（E P 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，批號(hào)：2.0）；他達(dá)拉非原料藥（山東海佑福瑞達(dá)制藥有限公司，批號(hào)：20170908）；他達(dá)拉非自制片（山東明仁福瑞達(dá)制藥股份有限公司，批號(hào)：20041601，20051801，20051901）；他達(dá)拉非參比制劑（美國(guó)禮來(lái)公司，商品名希愛(ài)力，批號(hào)：D189502）；十二烷基硫酸鈉（SDS，西隴科學(xué)，化學(xué)純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)他達(dá)拉非溶解度及他達(dá)拉非片溶出度。色譜柱：Agilent Zorbax SB-C8柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（65:35）；檢測(cè)波長(zhǎng)：225 nm；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量20 μl。

2.2 溶出介質(zhì)配制

0.2 %SDS水溶液：精密稱(chēng)取SDS 2.0 g，加水適量溶解，并用水稀釋至1000 ml，搖勻。

0.2 %SDS鹽酸溶液（pH 1.2）：精密量取鹽酸7.65 ml，加水適量稀釋?zhuān)尤隨DS 2.0 g，用水溶解并稀釋至1000 ml，搖勻。

0.2 %SDS醋酸鹽緩沖液（pH 4.5）：精密量取2 mol/L醋酸溶液（取冰醋酸120.0 g或114 ml，用水稀釋至1000 ml）14 ml，加入醋酸鈉2.99 g，加水適量使溶解，加入SDS 2.0 g，用水溶解并稀釋至1000 ml，搖勻。

0.2 %SDS磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）：取0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液（取磷酸二氫鈉24 g，用水溶解并稀釋至1000 ml，搖勻）250 ml與0.2 mol/L氫氧化鈉溶液（取8.00 g氫氧化鈉，用水溶解并稀釋至1000 ml，搖勻）112.0 ml，混合，加水適量稀釋?zhuān)尤隨DS 2.0 g，用水溶解并稀釋至1000 ml，搖勻。

2.3 溶液的配制

2.3.1 對(duì)照品溶液 取他達(dá)拉非對(duì)照品約25 mg，精密稱(chēng)定，置于100 ml量瓶中，加50 %乙腈溶液適量，超聲30 min使他達(dá)拉非完全溶解，用50 %乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，作為他達(dá)拉非對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取他達(dá)拉非對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，分別用4種溶出介質(zhì)稀釋配制成每1 ml中約含他達(dá)拉非2 μg的對(duì)照品溶液。

2.3.2 線性溶液 精密稱(chēng)取他達(dá)拉非對(duì)照品約20 mg，置100 ml量瓶中，加50 %乙腈溶液適量，振搖使他達(dá)拉非完全溶解，用50 %乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為他達(dá)拉非對(duì)照品貯備液；精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1，2，3，5，7 ml至50 ml量瓶中，分別用2.2項(xiàng)下溶出介質(zhì)稀釋至刻度，即得線性1～線性5溶液，濃度約為4，8，16，20，28 μg/ml。

2.3.3 不同pH值溶液的配制

pH 1.2水溶液：取鹽酸7.65 ml，加水稀釋至1000 ml。

pH 2.0水溶液：取鹽酸1.17 ml，加水稀釋至1000 ml。

pH 3.8水溶液：取2 mol/L醋酸溶液22.6 ml與醋酸鈉0.67 g，加水溶解并稀釋至1000 ml。

pH 4.5水溶液：取2 mol/L醋酸溶液14.0 ml與醋酸鈉2.99 g，加水溶解并稀釋至1000 ml。

pH 5.5水溶液：取2 mol/L醋酸溶液3.0 ml與醋酸鈉5.98 g，加水溶解并稀釋至1000 ml。

pH 6.0水溶液：取0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液250 ml與0.2 mol/L氫氧化鈉溶液28 ml，加水稀釋至1000 ml。

pH 6.8水溶液：取0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液250 ml與0.2 mol/L氫氧化鈉溶液112 ml，加水稀釋至1000 ml。

pH 8.0水溶液：取0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液250 ml與0.2 mol/L氫氧化鈉溶液230.5 ml，加水稀釋至1000 ml。

2.3.4 不同pH值0.2 %SDS溶液的制備 分別按2.3.3項(xiàng)下方法制備不同pH溶液，加入SDS 2 g，溶解，即得不同pH值0.2 %SDS溶液。

2.4 溶出曲線測(cè)定方法

采用槳法，溶出介質(zhì)體積為1000 ml，轉(zhuǎn)速為每分鐘50轉(zhuǎn)，分別于5，10，15，20，30，45，60，90 min時(shí)，取出溶出液5 ml，濾過(guò)，作為供試品溶液，并即時(shí)補(bǔ)充相同溫度、相同體積的溶出介質(zhì)。取上述溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，繪制溶出曲線。

2.5 溶解度的測(cè)定

2.5.1 不同pH值溶液中溶解度的測(cè)定 取過(guò)量的他達(dá)拉非原料藥，置50 ml量瓶中，精密加入pH 1.2，pH 2.0，pH 3.8，pH 4.5，pH 5.5，pH 6.0，pH 6.8，pH 8.0溶液及水各25 ml，置恒溫振蕩器中，37 ℃下振搖24 h，過(guò)濾，取續(xù)濾液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算他達(dá)拉非溶解度。結(jié)果顯示，他達(dá)拉非為水難溶性藥物，且無(wú)pH依賴(lài)性，水作為溶出介質(zhì)無(wú)區(qū)分能力。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 他達(dá)拉非在不同pH溶液及水中溶解度

2.5.2 不同濃度SDS溶液中溶解度的測(cè)定 取過(guò)量的他達(dá)拉非原料藥，置50 ml量瓶中，精密加入0.1 %，0.15 %，0.20 %，0.25 %，0.30 %，0.35 %，0.40 %，0.45 %，0.50 %，0.55 %SDS溶液各25 ml，置恒溫振蕩器中，37 ℃下振搖24 h，過(guò)濾，取續(xù)濾液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算他達(dá)拉非溶解度。結(jié)果顯示，他達(dá)拉非溶解度與介質(zhì)中SDS濃度基本呈正比，且在0.2 %SDS中的溶解度與他達(dá)拉非片在1000 ml溶出介質(zhì)中完全溶出時(shí)的濃度（20 μg/ml）基本一致，說(shuō)明本品在0.2 %及以上濃度SDS溶液中可達(dá)到完全溶出。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 他達(dá)拉非在不同濃度SDS溶液中的溶解度

2.5.3 不同pH值0.2 %SDS溶液中溶解度的測(cè)定 取過(guò)量他達(dá)拉非原料藥，置50 ml量瓶中，精密加入含0.2 %SDS的pH 1.2、pH 2.0、pH 3.8、pH 4.5、pH 5.5、pH 6.0、pH 6.8、pH 8.0介質(zhì)和水各25 ml，置恒溫振蕩器中，37 ℃下振搖24 h，過(guò)濾，取續(xù)濾液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算他達(dá)拉非溶解度。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 他達(dá)拉非在不同pH值0.2 %SDS溶液中溶解度

SDS濃度為0.2 %時(shí)，不同pH溶液中的溶解度無(wú)明顯的pH依賴(lài)性。參照普通口服固體制劑溶出度試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則[5-6]、他達(dá)拉非片進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)及美國(guó)藥典（USP41）溶出數(shù)據(jù)庫(kù)中的內(nèi)容，選擇2.2項(xiàng)下0.2 %SDS鹽酸溶液（pH 1.2）、0.2 %SDS醋酸鹽緩沖液（pH 4.5）、0.2 %SDS磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）和0.2 %SDS水溶液4種介質(zhì)進(jìn)行篩選。

2.6 溶出度測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 稱(chēng)取按處方比例配制的空白輔料約33 mg，置100 ml量瓶中，分別加2.2項(xiàng)下4種溶出介質(zhì)適量，振搖，并用相應(yīng)的溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為空白輔料溶液。

精密量取空白輔料溶液、4種溶出介質(zhì)、2 μg/ml他達(dá)拉非對(duì)照品溶液各20 μl，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示4種溶出介質(zhì)及空白輔料均不干擾溶出度測(cè)定。色譜圖見(jiàn)圖1～3。

圖1 溶出介質(zhì)（0.2 %SDS水溶液）色譜圖

圖2 空白輔料溶液（以0.2 %SDS水溶液配制）色譜圖

圖3 對(duì)照品溶液（以0.2 %SDS水溶液配制）色譜圖

2.6.2 線性試驗(yàn) 取2.3.2項(xiàng)下線性溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以濃度（C，μg/ml）對(duì)峰面積（A）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)，他達(dá)拉非在4種溶出介質(zhì)中線性關(guān)系良好。

表4 線性關(guān)系

2.6.3 定量限 取2.3.2 項(xiàng)下線性溶液1（濃度約為4 μg/ml），分別用4種溶出介質(zhì)依次逐級(jí)稀釋?zhuān)?.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比為10計(jì)算定量限。結(jié)果顯示，他達(dá)拉非在0.2 %SDS鹽酸溶液（pH 1.2）、0.2 %SDS醋酸鹽緩沖液（pH 4.5）、0.2 %SDS磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）和0.2 %SDS水溶液中的定量限分別為0.2431，0.1616，0.1135，0.1926 μg/ml。

2.6.4 精密度試驗(yàn) 取2.3.2 項(xiàng)下線性溶液4（濃度約為20 μg/ml）為對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，4種溶出介質(zhì)配制的對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次峰面積的RSD依次1.4 %，0.1 %，0.2 %，0.1 %，均小于2.0 %，說(shuō)明儀器的精密度良好。

2.6.5 回收率試驗(yàn) 取他達(dá)拉非對(duì)照品約50 mg，置100 ml量瓶中，用50 %乙腈溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為回收率貯備液。稱(chēng)取處方量空白輔料，置25 ml量瓶中，加入回收率貯備液0.3 ml（30 %濃度水平）、0.5 ml（50 %濃度水平）、0.8 ml（80 %濃度水平）、1.0 ml（100 %濃度水平），分別用4種溶出介質(zhì)稀釋至刻度，每個(gè)濃度平行配制3份，取續(xù)濾液作為回收率試驗(yàn)供試品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以測(cè)得量與加入量計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，方法準(zhǔn)確度良好，見(jiàn)表5。

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6.6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取分別以2.2項(xiàng)下4種溶出介質(zhì)配制的濃度為20 μg/ml他達(dá)拉非對(duì)照品溶液及2.6.5項(xiàng)下加樣濃度水平為100 %的回收率試驗(yàn)供試品溶液，室溫放置，分別于0，2，4，6，8，12 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。隨著時(shí)間的增加，各樣品溶液峰面積RSD均在2 %以?xún)?nèi)，表明各樣品溶液至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

以上溶出度測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證指標(biāo)均滿足要求，提示建立的溶出度測(cè)定方法可行。

2.7 參比制劑溶出曲線的測(cè)定

取他達(dá)拉非片參比制劑（批號(hào)：D189502），分別考察于不同溶出介質(zhì)[0.2 %SDS鹽酸溶液（pH 1.2）、0.2 %SDS醋酸鹽緩沖液（pH 4.5）、0.2 %SDS磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）和0.2 %SDS水溶液]中溶出曲線，結(jié)果見(jiàn)圖4。他達(dá)拉非片參比制劑（批號(hào)：D189502）在4種溶出介質(zhì)中，30 min溶出率均能達(dá)到85 %，無(wú)拐點(diǎn)和突釋?zhuān)砻魅艹鼋橘|(zhì)具有較強(qiáng)的區(qū)分能力，且不會(huì)過(guò)度區(qū)分，適用于評(píng)價(jià)參比制劑和自制片的一致性[6]。

圖4 參比制劑在不同溶出介質(zhì)中的溶出曲線（n=12）

2.8 溶出曲線相似性評(píng)價(jià)

采用相似因子（?2）法比較參比制劑和自制片溶出曲線的相似性：若50≤?2≤100，可認(rèn)為2條溶出曲線相似，計(jì)二者的溶出量平均差異＜10 %。比較不同處方自制片與參比制劑在4種溶出介質(zhì)[0.2 %SDS鹽酸溶液（pH 1.2）、0.2 %SDS醋酸鹽緩沖液（pH 4.5）、0.2 %SDS磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）和0.2 %SDS水溶液]中溶出曲線的?2值，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可見(jiàn)，參比制劑和自制他達(dá)拉非片在4種溶出介質(zhì)中的溶出曲線間的?2值均大于50，表明自制他達(dá)拉非片具有與參比制劑相似的溶出特性。

表6 自制他達(dá)拉非片在不同溶出介質(zhì)中的溶出曲線對(duì)比

3 討論

他達(dá)拉非為水難溶性藥物，且無(wú)pH依賴(lài)性，水作為溶出介質(zhì)無(wú)法滿足漏槽條件且無(wú)區(qū)分能力。通過(guò)溶解度試驗(yàn)結(jié)果可知，他達(dá)拉非溶解度與溶劑中SDS濃度基本成正比，但當(dāng)SDS濃度濃度過(guò)大時(shí)，他達(dá)拉非片呈快速溶出狀態(tài)，滿足漏槽條件但基本無(wú)區(qū)分力。本研究最終確定在溶出介質(zhì)中加入0.2 %SDS可使溶出條件更具有區(qū)分力。參考指導(dǎo)原則推薦的溶出條件，最終篩選得到具有區(qū)分力的4種不同的溶出介質(zhì)。

他達(dá)拉非片進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)中溶出度定量檢測(cè)方法為UV法，采用吸光度的一階導(dǎo)數(shù)法計(jì)算他達(dá)拉非溶出量，計(jì)算過(guò)程比較復(fù)雜；美國(guó)藥典USP43中溶出度測(cè)定方法為HPLC法，但流動(dòng)相為甲醇-水（50:50），黏度較大，極易損傷色譜柱，且主成分出峰時(shí)間較晚，分析時(shí)間較長(zhǎng)。本研究所用液相色譜條件可使他達(dá)拉非快速出峰且峰形良好，溶劑及輔料峰均不干擾測(cè)定，能較大程度提高檢測(cè)效率，同時(shí)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量計(jì)算，即使供試品溶液濃度范圍波動(dòng)較大也能保證計(jì)算結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，本研究對(duì)他達(dá)拉非在不同溶出介質(zhì)中的溶出度定量測(cè)定方法進(jìn)行了驗(yàn)證，本方法專(zhuān)屬性、準(zhǔn)確度、精密度良好，且在最低與最高溶出度范圍內(nèi)，他達(dá)拉非濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均符合規(guī)定。最終確定本方法用于測(cè)定他達(dá)拉非溶出度準(zhǔn)確可靠。

溶出曲線相似性評(píng)價(jià)結(jié)果表明，自制片與參比制劑在各溶出介質(zhì)中的溶出行為基本相似，為仿制藥一致性評(píng)價(jià)提供了試驗(yàn)依據(jù)。