湯建，曹裕旻，左亞鋒，李艷玲，靳彪，夏海平*

（1.亳州學院 中藥學院，安徽 亳州 236800；2.江蘇大學附屬四院 神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001）

紅藤［Sargentodoxa cuneata（Oliv.） Rehd. et Wils.］是我國特有的植物，屬于大血藤科（以前歸于木通科）大血藤屬植物，以根、藤入藥。紅藤為傳統(tǒng)中藥材，具有清熱解毒、理氣活血等作用，用以治療闌尾炎、風濕痹痛、跌打腫痛等［1］。已報道的化學成分包括酚類、有機酸、木脂素、三萜皂苷、黃酮、蒽醌等化學成分，藥理研究表明其具有抑菌、抗炎、抗病毒、抑制血小板聚集、增加冠脈血流量、抗心肌缺血等作用［2］。本組研究人員在前期的工作中發(fā)現(xiàn)，紅藤的75%乙醇提取物經(jīng)過乙酸乙酯萃取后剩余的水溶性部位（HTW，50 mg/kg）能有效減輕弗氏完全佐劑誘導（AA）的大鼠的繼發(fā)性腫脹（P＜ 0.05），顯著降低AA大鼠腹腔巨噬細胞中TNF-α和IL-1β的水平（P＜ 0.01）［3］。

目前，紅藤的藥理活性研究主要以提取物為主，尚缺少確切的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制方面的深入研究。近年來獲得長足發(fā)展的分子對接（Molecular docking）技術(shù)在中藥有效物質(zhì)基礎(chǔ)研究方面有著廣泛的應(yīng)用前景。針對某一特定的靶點，利用相關(guān)軟件對中藥化合物庫進行對接，虛擬篩選出與靶點蛋白結(jié)合密切的候選化合物，根據(jù)預測結(jié)果再進行有針對性的藥理實驗驗證，這將顯著提高中藥化學成分活性評價的效率，縮短中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究進程［4］。

本研究中采用LC-MS分析HTW中的主要化學成分，得到的14個小分子化合物（配體，表1）。同時分析與紅藤抗炎相關(guān)的通路、靶點［3，5，6］，本文選取腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等6種蛋白（表2）為對接受體，采用AutoDock Vina軟件［7］進行分子對接，虛擬篩選HTW中基于上述6種蛋白的抗炎活性成分，該研究將有助于確定紅藤抗炎免疫的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)和分子作用機制。

表1 HTW中14個化合物的MS和MS2準分子離子峰Tab.1 The main MS和MS2 fragments of 14 compounds in HTW

表2 6種抗炎靶點蛋白Tab.2 Six proteins associated with anti-inflammation

1 材料和方法

1.1 材料

Thermo LXQ液相色譜離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Thermo Fisher Scientific），Kromasil C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，4.5 μm），流動相用甲醇為色譜純，超純水（0.45 μm濾膜），紅藤藥材于2012年10月購自安徽亳州藥材市場（藥材經(jīng)過江蘇大學藥學院歐陽臻教授鑒定，標本號HT1012），紅藤水溶性部位（HTW）由本實驗室自制，于-20℃保存。

本研究中采用的軟件有ChemOffice Professional軟件（美國PerkinElmer公司），AutoDock Tools1.5.6和AutoDock Vina（美國The Scripps Research Institute），PyMOL（TM） 1.7.4.5 Edu（美國Schrodinger，LLC公司）和Discovery Studio 2016 client（美國BIOVIA公司）。

1.2 LC-MS分析HTW中化學成分

LC-MS分析條件：流動相為1%冰醋酸和甲醇（68% : 32%），等度洗脫；柱溫：30℃；流速：1 mL/min；檢測波長：327 nm；進樣量：20 μL。電噴霧離子源（ESI），噴霧電壓3.50 kV，毛細管溫度300℃，毛細管電壓-30 V，透鏡電壓-100.00 V，鞘氣（液氮）流速40 arb，輔助氣10 arb，掃描范圍：100.00 ～ 2 000.00 m/z，采用負譜全離子掃描方式采集數(shù)據(jù)。

挑選LC-MS色譜圖中含量較高的14種成分（表1）進行分析。4.9 min處的準分子離子峰431.3［M-H］-，其二級質(zhì)譜MS2為299.2，減少132，推測含有芹糖片段。結(jié)合文獻［2，8］推測該化合物為osmanthuside H（1）。在5.8 min、6.4 min和7.4 min處均有353的準分子離子峰，前兩個化合物MS2均有389.1［M+Cl］-和191.1 ［M-H-163］-峰，第三個化合物MS2有191.0 ［M-H-163］-峰，結(jié)合文獻［2，8，9］推測這三個化合物分別為新綠原酸（Neochlorogenic acid，2）、綠原酸（Chlorogenic acid，3）、隱綠原酸（Cryptochlorogenic acid，4）。8.0 min處的準分子離子峰551.3［M-H］-，結(jié)合文獻［2，8］推測該化合物為Glehlinoside C（5）。9.0 min處的準分子離子峰179.1 ［M-H］-，其MS2為135.1，減少44（CO2），結(jié)合文獻［2，8］推測該化合物為咖啡酸（Caffeic acid，6）。10.6 min處的準分子離子峰741.1 ［M-H］-，結(jié)合文獻［2，8］推測該化合物為鵝掌楸苷（Liriodendrin，7）。10.9 min處的準分子離子峰475.1 ［M-H+AcOH］-，其MS2為415.3 ［M-H］-，減少60（AcOH），結(jié)合文獻［2，8］推測該化合物為Icariside D1（8）。類似地，推測13.9 min處的準分子離子峰為化合物phenethyl-O-α-L-rhamnosyl-β-D-glucoside（10）。13.4 min、19.8 min、21.0 min、22.7 min和23.1 min處的準分子離子峰，經(jīng)與文獻［2，8］核對，推測分別為（+）-南燭木樹脂酚-9′-O-β-D-葡萄糖苷［（+）-lyoniresin-9′-yl-β-glucoside，9］、野菰苷（Aegineoside，10）、木通苯乙醇苷B（Calceolarioside B，12）、無梗五加苷B（Acanthoside B，13）和5-甲氧基野菰苷（5-methoxyaegineoside，14）。這14種化合物分別屬于苯丙酸、苯乙醇苷和木脂素類成分。ChemDraw軟件繪制分子結(jié)構(gòu)（圖1），并用Chem3D轉(zhuǎn)化成三維結(jié)構(gòu)，MM2力場進行最小能量優(yōu)化，結(jié)果保存為mol2格式。AutoDock Tools1.5.6對小分子進行加氫，計算Gasteiger電荷，合并非極性氫，最終保存為pdbqt格式文件，以備AutoDock Vina進行分子對接。

圖1 HTW中14種化合物結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of 14 compounds in HTW

1.3 靶標蛋白結(jié)構(gòu)的獲取和預處理

前期研究［3］發(fā)現(xiàn)HTW對TNF-α和IL-1β有明確的抑制作用，因此本文中選取包括TNF-α、Caspase-1（IL-1β轉(zhuǎn)化酶）在內(nèi)的6個與紅藤抗炎密切的靶點蛋白（表2），并通過檢索PDB結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org）下載對應(yīng)的靶點蛋白晶體復合物PDB文件，將這些文件依次導入PyMOL軟件中，刪除原配體、水分子、無機物以及有機物，在AutoDock Tools1.5.6軟件中加氫，保存為pdbqt格式，以備AutoDock Vina進行分子對接［6］。

1.4 參數(shù)設(shè)置和分子對接

AutoDock Vina 采用的是格點對接，均方根偏差（RMSD）在2?范圍內(nèi)，其他參數(shù)均為缺省值，分別進行20次對接。受體蛋白的晶格中心設(shè)置見表2，對接空間（Grid Box）：40 nm × 40 nm × 40 nm，能量范圍為4。將靶點蛋白晶體復合物中化合物（配體）取出，重新與受體對接，其對接值為閾值。

HTW中14個化合物（圖1）分別與表2中6種靶點蛋白對接，顯示前9位的結(jié)合態(tài)的結(jié)合能打分值，均選擇第一行（即dist from rmsd l.b.值和best mode rmsd u.b.值均為0）的打分值。根據(jù)能量打分值確定潛在的活性物質(zhì)基礎(chǔ)，將能量值優(yōu)于或接近閾值的化合物認定為HTW中主要的抗炎活性成分。

2 結(jié)果與分析

本研究將HTW中含量較為豐富的14個化合物分別靶點蛋白Caspase-1、IKK-β、TNF-α、iNOS及TLR2進行對接。綜合化合物結(jié)合能、閾值以及平均值等方面評價（圖2）顯示，TLR2對化合物最為敏感，與新綠原酸（2）、綠原酸（3）、鵝掌楸苷（7）、野菰苷（11）、木通苯乙醇苷B（12）、無梗五加苷B（13）的結(jié)合能均超過-9.0 kcal/mol，遠超過閾值-7.2 kcal/mol，其中與化合物12結(jié)合力最強，為-9.7 kcal/mol。特別是該部位中比較豐富的化合物2和3，均與TLR2有較好的結(jié)合力，進一步提示，綠原酸類化合物對抗炎活性發(fā)揮著較大的作用。iNOS對HTW中化合物也較敏感，特別是化合物10和11的結(jié)合能分別為-9.8 kcal/mol和-9.4 kcal/mol，超過自身閾值-9.3 kcal/mol。對TLR2及iNOS最敏感的木通苯乙醇苷B（12）、phenethyl-O-α-L-rhamnosyl-β-D-glucoside（10）均為苯乙醇苷類化合物，說明該類化合物可能也是紅藤抗炎活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。野菰苷（11）的衍生物（13）與TLR2及iNOS均有較強的結(jié)合能（-9.0 kcal/mol，-8.9 kcal/mol），說明木脂素類化合物可能也對紅藤抗炎作用有重要貢獻。但IL-6（PDB ID：1ALU）和Caspase-1（PDB ID：1RWN）與化合物的結(jié)合能普遍較低，其平均值（M2）僅有-6.2 kcal/mol和-6.8 kcal/mol。

圖2 化合物1-14與6種靶點蛋白對接結(jié)合能Fig.2 Affinity scores of compounds 1-14 docking with 6 proteins

而在眾多藥理實驗中均表現(xiàn)較好藥理活性的咖啡酸（6）對6種蛋白的結(jié)合能均較低，平均值僅-6.7 kcal/mol，這可能是因為配體化合物除了應(yīng)具有相關(guān)的官能團外還應(yīng)具備一定的空間體積，以便于與所處位置的氨基酸殘基有較強的結(jié)合，而咖啡酸分子量較小，相對其他13種化合物，其結(jié)構(gòu)較簡單［10］。

通過圖3A可見，化合物10較好地嵌在2Y37（iNOS）的空腔中，表現(xiàn)出較強的結(jié)合能力（-9.8 kcal/mol），且超過其閾值-9.3 kcal/mol。分子對接平面圖（圖4）中可見其與2Y37蛋白中的ILE238等氨基酸殘基之間存在范德華力；葡萄糖糖環(huán)內(nèi)氧與GLY365之間、4′-OH的氫與TRP366之間分別形成氫鍵；苯環(huán)與TRP188、PHE363之間存在Pi-Pi作用；苯環(huán)與LEU203之間形成Pi-Alkyl作用；鼠李糖3′′-OH的氧與PRO344之間、4′′位碳與GLN257之間分別存在一種弱的氫鍵。

圖3 化合物10與2Y37（A）及化合物12與5D3I（B）分子對接圖Fig.3 Docking of compound 10 with 2Y37 （A） and 12 with 5D3I （B）

圖4 化合物10與2Y37蛋白分子對接平面圖Fig.4 2D diagram of compound 10 docking with protein 2Y37

通過圖3B可見，化合物12幾乎完全被封裝在5D3I（TLR2）的“口袋”中，表現(xiàn)出較強的結(jié)合能力（-9.7 kcal/mol），遠超過其閾值-7.2 kcal/mol。分子對接平面圖（圖5）中可見其與5D3I蛋白中的LEU334等氨基酸殘基之間存在范德華力；苯乙醇片段中3-OH的氧VAL303、咖啡酸片段中的4′′-OH的氫同時與LEU292、GLY291形成氫鍵；上述兩種片段中的苯環(huán)分別與VAL302和LEU289形成Pi-Alkyl作用，后者的苯環(huán)與PHE325形成Pi-Pi作用力。糖中2′-OH氫、咖啡酸片段中的3′′-OH的氧與ASN296、ASN290之間存在斥力。

圖5 化合物12與5D3I蛋白分子對接平面圖Fig.5 2D diagram of compound 12 docking with protein 5D3I

3 討論

紅藤是臨床上常用的祛風除濕、抗炎止痛中藥材，前期的研究中發(fā)現(xiàn)其水溶性部位（HTW）能有效減輕AA大鼠的繼發(fā)性腫脹，對其腹腔巨噬細胞產(chǎn)生的TNF-α和IL-1β抑制率分別為22%和55%，作用強度接近于陽性對照藥雷公藤多苷［3］。紅藤的提取物還對IL-6、iNOS等炎癥因子以及NF-κB通路均有良好的抑制作用［3，11］，網(wǎng)絡(luò)藥理學研究也提示TNF-α、IL-1β以及TLR2可能是紅藤抗炎的關(guān)鍵靶點蛋白［12］。為了進一步發(fā)現(xiàn)HTW中潛在的抗炎物質(zhì)以及抗炎作用機制，本研究中采用AutoDock Vina軟件，對與紅藤抗炎密切相關(guān)的6種蛋白TNF-α、IL-1β、IL-6、IKK-β、iNOS及TLR2等進行了分子對接，虛擬篩選出關(guān)鍵蛋白和活性化合物。

與前期的細胞實驗中抑制TNF-α的報道一致，HTW中確有一些化合物，如：1-3、7、10和14對2AZ5蛋白（TNF-α）的結(jié)合能均超過-8.0 kcal/mol，接近或強于閾值（-8.5 kcal/mol）。這些化合物可能與HTW抗炎、抑制TNF-α有關(guān)。TNF-α在類風濕關(guān)節(jié)炎的病理過程中居中心地位，TNF-α能誘導其它細胞產(chǎn)生更加廣泛的致炎物質(zhì)，針對TNF-α的小分子抗炎免疫藥物篩選是重要的工作，也是重要抗炎免疫的重要調(diào)節(jié)因子［13］。但HTW中化合物對Caspase-1的結(jié)合能普遍較低，這與前期實驗數(shù)據(jù)［3］不一致，可能因為分子對接的預測本身和實際有不一致的地方，也可能是HTW抑制IL-1β是通過其他通路進行的。IL-6與化合物的對接值普遍較低，其平均值（M2）是6種蛋白中最低的，這與藥理實驗結(jié)果［2］以及網(wǎng)絡(luò)藥理學預測［12］不一致。IL-1β和IL-6是抗炎的關(guān)鍵靶點［14］，但目前的對接方式未能體現(xiàn)其抗炎的關(guān)鍵作用，說明需要改進。

根據(jù)分子對接結(jié)果（圖2），除化合物6外，其他13個化合物與iNOS（2Y37）和TLR2（5D3I）的結(jié)合能在-8.1 ～ -9.8 kcal/mol之間，其均值（M2）分別為-8.6 kcal/mol和-8.8 kcal/mol，表現(xiàn)出較強的結(jié)合能力，可能是潛在的關(guān)鍵靶點。這與文獻［12］中關(guān)于TLR2可能是抗炎關(guān)鍵靶點的預測是一致的，但在前期的藥理實驗中未曾發(fā)現(xiàn)。一氧化氮（NO）是炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)分子，iNOS作為合成NO的調(diào)控因子，成為眾多天然小分子抗炎的治療靶點［15］。TLR2通過MyD88促進轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活，指導下游炎癥介質(zhì)的釋放，成為抗炎免疫的重要靶點［16］。根據(jù)本次實驗，綠原酸和以化合物10、12為代表的苯乙醇苷等成分可能是HTW的最重要的抗炎活性物質(zhì)；其抗炎活性與TNF-α、iNOS、TLR2等靶點密切相關(guān)，后續(xù)進一步的研究中，將重點關(guān)注這些炎癥因子。