吳昀宣，李德明，何宇然，徐加英，童星，秦立強

（1. 蘇州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 蘇州 215123；2.蘇州大學(xué)放射醫(yī)學(xué)與防護學(xué)院，江蘇 蘇州 215123；3.蘇州大學(xué)蘇州醫(yī)學(xué)院實驗中心，江蘇 蘇州 215123）

0 引 言

當(dāng)前，全球肥胖患病率大幅上升。肥胖不僅與胰島素抵抗、高血壓和心血管疾病等代謝性疾病發(fā)病率升高密切相關(guān)，也是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的重要誘因。目前藥物治療代謝性疾病的手段較少，且存在不良反應(yīng)。因此，針對肥胖的發(fā)病機制進行營養(yǎng)干預(yù)，對延緩肥胖的發(fā)生發(fā)展和降低肝臟膽固醇積累風(fēng)險具有重要意義。

乳鐵蛋白（Lactoferrin，Lf）是一種主要存在于乳汁、唾液和膽汁中的糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族。Lf最豐富的來源是乳汁，特別是初乳[1]。Lf 具有許多生理功能，如抗氧化、抗炎、抗病毒和抗菌作用等[2]。Lf在調(diào)控脂肪細胞發(fā)育代謝中發(fā)揮重要作用[3]，動物實驗發(fā)現(xiàn)Lf 能降低高脂飼料（HFD）喂養(yǎng)動物的體重和血脂/肝脂水平[4-7]。脂代謝異常和肝臟膽固醇積累是肥胖的重要特征之一[8]。膽固醇的轉(zhuǎn)化和代謝必須在肝臟完成，主要由內(nèi)源性膽固醇合成、外源性膽固醇吸收以及機體內(nèi)膽固醇的外排3 個方面進行調(diào)控[9]。人體主要依靠將膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸來實現(xiàn)膽固醇的外排，腸道中的膽固醇大多數(shù)又通過腸肝循環(huán)回流至肝臟并被肝臟重吸收，即膽固醇逆轉(zhuǎn)運（Reverse cholesterol transport, RCT）[9]。體內(nèi)膽固醇平衡通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)來維持，肝X 受體（LXRs）分為LXRα和LXRβ2 種亞型，是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族中的一員。LXRs 與其它核受體超家族成員一起促進膽固醇貯存、轉(zhuǎn)運和分解代謝[10]。本研究以HFD 喂飼大鼠，從LXRα 及其相關(guān)基因調(diào)節(jié)的角度探討Lf 干預(yù)改善肝臟膽固醇積累的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

乳鐵蛋白，Hilamr 公司；總膽固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride, TG）試劑盒，南京建成生物工程研究所；動物飼料，戴茨生物科技（無錫）有限公司；引物合成，蘇州金唯智生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄和PCR 試劑盒，翌圣生物科技上海有限公司；DMI8 型顯微鏡，徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司；離心機，艾本德（上海）國際貿(mào)易有限公司。

1.2 動物和分組

30 只5～6 周齡的雄性SD 大鼠購于浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于（22±2）°C 的恒溫和60%相對濕度，12 h 的日/夜循環(huán)的SPF 動物房中。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機分為3 組：（1）CON 組，喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料AIN-93G；（2）HFD 組，喂飼高脂飼料（脂肪供能比60%）誘導(dǎo)肥胖模型；（3）HFD+Lf 組，將HFD 中0.4%酪蛋白替換成Lf（委托戴茨生物科技（無錫）有限公司加工）進行飼喂。本研究在HFD 喂養(yǎng)的同時進行Lf 干預(yù)，觀察其預(yù)防效果。在16 周的干預(yù)過程中，自由進食飲水，每周記錄體重及攝食量。實驗經(jīng)蘇州大學(xué)動物福利委員會審核批準(zhǔn)（202102A077）。

1.3 收集肝臟和小腸標(biāo)本

干預(yù)結(jié)束前12 h 禁食，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后腹腔腹主動脈取血離心得血清，迅速分離肝臟和腸組織。取部分肝臟置于10%福爾馬林溶液固定，用于組織病理學(xué)觀察；部分肝臟和生理鹽水清洗干凈的回腸末端轉(zhuǎn)移到凍存管，于-80 °C 冰箱中保存。用于肝臟脂肪測定和膽固醇代謝相關(guān)基因水平測定。

1.4 肝臟TC 和TG 測定

取冷凍保存的肝臟組織，冰浴研磨，離心（2 500 r/min，10 min）取上清，按試劑盒說明書操作測定TG 和TC水平。

1.5 肝臟組織病理學(xué)觀察

取10%福爾馬林溶液固定的肝臟組織，進行常規(guī)包埋、切片（4 μm）和蘇木精-伊紅（HE）染色。切片在顯微鏡（100 倍和200 倍）下觀察并采集圖像，并進行脂肪變性評分和NAFLD 活動度評分（NAS）[11]。NAS得分在10 倍鏡下任取5 個視野，由肝細胞脂肪變、小葉內(nèi)炎癥和肝細胞氣球樣變3 方面綜合評分。NAS>4分可診斷非酒精性脂肪肝。

1.6 PCR 檢測基因表達

取冷凍保存的肝臟及回腸，提取cDNA 后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為mRNA，按照qPCR 說明書將其與上下游引物及PCR 反應(yīng)液混合后離心上機，采用2-ΔΔCt 法計算結(jié)果，GAPDH 為內(nèi)部對照。用熔解曲線分析來評估擴增的特異性。所用引物序列Forward Primer（5’to 3’）及Reverse Primer（5’to 3’）分別為：GAPDH:CTCTCTGCTCCTCCCTGTTC,CGATACG GCCAAATCCGTTC;LXRα:TGCCCACTTTACTGA GCTGG,TCTCCAGAAGCATCACCTCG;ABCA1:GG GCTCCTCCCTGTTTTTGA;TCTGAGAAACACTG TCCTCCTTT;ABCG1:ATCATGCGGGACTCGGTA CT,AGAACAGGAAGCCGGAGTTG;ABCG5:CTTAG GTAGCTCAGGCTCAGG,GCCGTTCACAAACACT TCCC;NPC1L1:GTGGCCCCCATAAGGATGAG,AT ACGCTGCTAGACCCCCTT。

1.7 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)（Mean）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，用SPSS 26.0 軟件（美國SPSS 公司）進行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計分析采用單因素方差分析（ANOVA），然后使用Bonferroni的事后檢驗進行多重比較。P<0.05 表示2 組間具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 Lf 對體重、肝臟脂肪含量的影響

干預(yù)第16 周時，與CON 組比較，HFD 組大鼠體重顯著增加，體重增加超20%，因此HFD 喂飼成功誘導(dǎo)了大鼠肥胖。與HFD 組相比，HFD+Lf 組大鼠的體重顯著降低了13%，如圖1（a）。相應(yīng)地，HFD 組大鼠肝臟TG 和TC 含量也顯著升高，而Lf 干預(yù)抑制了HFD 誘導(dǎo)的肝臟TC 和TG 含量的增加，如圖1（b）及圖1（c）所示。結(jié)果提示Lf 干預(yù)具有降低體重和肝臟脂肪含量的作用。

圖1 各組大鼠體重、肝臟TG 及TC 含量

2.2 Lf 對肝臟形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的影響

肥胖通常伴有肝臟的脂肪變性，病例組織學(xué)是診斷NAFLD 和判斷其預(yù)后的金標(biāo)準(zhǔn)。肝臟HE 染色后CON 組大鼠的肝細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常，HFD 組則觀察到許多大小不均的脂滴空泡堆積、大泡性脂肪變性和微泡狀脂肪變性，顯示HFD 誘導(dǎo)了大鼠肥胖和肝臟脂肪堆積。但是HFD+Lf 組的空泡的數(shù)量和體積減小，如圖2（a）所示。半定量分析進一步顯示HFD+Lf組顯著降低了HFD 組中升高的steatosis 評分和NAS評分，如圖2（b）及圖2（c）所示。表明Lf 干預(yù)可以改善大鼠肝臟脂滴積累，改善肝臟脂肪變性。AOYAMA Y[12]的研究也發(fā)現(xiàn)，Lf 可以顯著降低高脂喂養(yǎng)的Cx32ΔTg大鼠肝臟的NAS 評分和纖維化面積，從而緩解其脂肪性肝炎。

圖2 各組大鼠肝臟HE 染色以及脂肪變性評分和NAFLD 活動度評分

2.3 Lf 對肝臟膽固醇代謝相關(guān)基因表達的影響

LXRα 在肝臟中大量存在，脂肪、腸等組織也普遍存在和表達。LXRα 主要通過參與RCT，促進膽固醇在肝臟中的代謝，促進膽固醇在小腸中的排泄并阻止其外周細胞的攝取等途徑，發(fā)揮其降低膽固醇的作用[10]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與CON 組相比，HFD 組大鼠肝臟LXRα 的mRNA 表達水平，有下調(diào)趨勢，但是HFD+Lf 組LXRα 的mRNA 表達水平顯著高于HFD 組，如圖3 所示，表示其在Lf 調(diào)節(jié)膽固醇代謝中發(fā)揮作用。在肝臟中，LXRα 通過上調(diào)膽固醇轉(zhuǎn)運體（ABCA1、ABCG1、ABCG5）介導(dǎo)外周組織細胞膽固醇流出從而調(diào)節(jié)RCT 過程[10]，我們也發(fā)現(xiàn)Lf 上調(diào)了ABCA1、ABCG1 和ABCG5 的mRNA 的表達水平，其中ABCA1 和ABCG5 具有統(tǒng)計學(xué)差異，如圖3 所示。LXRα 和SREBP 互為拮抗分子，共同維持膽固醇代謝的平衡，SREBP2 是調(diào)控膽固醇從頭合成的轉(zhuǎn)錄因子，并能作用于低密度脂蛋白受體，使細胞攝取更多膽固醇[13-14]，HFD 組大鼠肝臟SREBP2 的mRNA 表達水平顯著高于CON 組，HFD+Lf 組逆轉(zhuǎn)其上調(diào)，表達水平顯著低于HFD 組，如圖3 所示，即Lf 顯著下調(diào)了SREBP2 基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而降低膽固醇的從頭合成并促進膽固醇外排。另外，LXRα 還是調(diào)節(jié)膽汁酸代謝的核受體，用高膽固醇飼料喂養(yǎng)LXRα 敲除小鼠，不能上調(diào)膽汁酸代謝經(jīng)典途徑的限速酶CYP7A1，從而導(dǎo)致肝臟膽固醇積累[15]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)Lf 干預(yù)高脂高膽固醇膳食喂養(yǎng)小鼠8 周后，增加了糞便中總膽汁酸和結(jié)合型膽汁酸含量[6]。結(jié)合本研究的發(fā)現(xiàn)，我們可以推測，Lf 可能通過調(diào)節(jié)LXRα增加了膽汁酸排泄，通過下調(diào)SREBP2 減少膽固醇的合成，進而減少了肝臟膽固醇積累。

圖3 肝臟膽固醇代謝相關(guān)基因的表達

2.4 Lf 對腸道膽固醇代謝相關(guān)基因表達的影響

在小腸中，LXRα 的激活通過基底側(cè)ABCA1 增加高密度脂蛋白合成，并通過ABCG1 及ABCG5 促進膽固醇外排和經(jīng)腸道的膽固醇分泌。與CON 組相比，HFD 組大鼠回腸末端LXRα 的mRNA 表達水平有下調(diào)趨勢，但是HFD+Lf 組LXRα 的表達則顯著高于HFD 組。與HFD 組比較，ABCA1、ABCG1 和ABCG5的表達水平則顯著上調(diào)，如圖4 所示。因此，Lf 上調(diào)小腸LXRα、ABCA1、ABCG1 和ABCG5 的mRNA 水平，從而促進膽固醇外排。另外，HFD 組大鼠腸道膽固醇吸收相關(guān)蛋白NPC1L1 的mRNA 表達水平顯著高于CON 組，HFD+Lf 組的表達水平顯著低于HFD 組，如圖4 所示。LXRα 能通過抑制NPC1L1 直接抑制膽固醇吸收[9]。同時，Lf 下調(diào)了NPC1L 的基因表達，從而抑制了膽固醇吸收。Lf 是乳清蛋白的重要組成成分，我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)乳清蛋白能顯著上調(diào)HFD 喂養(yǎng)小鼠的腸道LXRα 和ABCG1 蛋白表達，增加膽固醇外排[16]。

圖4 腸道膽固醇代謝相關(guān)基因的表達

3 結(jié) 論

綜上所述，Lf 干預(yù)緩解了HFD 導(dǎo)致的肝臟脂肪積累，這可能與Lf 上調(diào)肝臟和腸道的LXRα、ABCA1和ABCG5 的mRNA 水平，下調(diào)肝臟SEBP2 及腸道NPC1L1 的mRNA 表達水平，從而促進膽固醇的外流，并減少腸道膽固醇的吸收有關(guān)。