李欣雨，孟毅，賀寶元，周妍，魏怡，連嚴(yán)慧，張磊，土雙靜，薛海燕

（1.陜西科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，西安 710021；2.陜西科技大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，西安 710021；3. 陜西金牛乳業(yè)有限公司，陜西 渭南 714000）

0 引 言

羊乳成分被公認(rèn)為最接近人乳[1]，因其自身超高的營養(yǎng)價值和獨特的風(fēng)味被譽為“奶中之王”[2]，因此羊乳成為了嬰幼兒配方奶粉的良好原料[3]。要實現(xiàn)羊乳成分的母乳化調(diào)配通常需要降低羊乳總蛋白的含量，減少酪蛋白增加乳清蛋白以此來改善二者比例，所以羊乳中分離酪蛋白是組分化生產(chǎn)羊乳的關(guān)鍵[4]。目前，分離酪蛋白最常見的方法為酶法沉淀和酸法沉淀，但酶法和酸法分離酪蛋白容易受到pH 和溫度的影響，使得酪蛋白的持水性較差，鹽離子濃度的增加也會減弱酪蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性[5]。膜分離技術(shù)是在分子水平上不同粒徑分子的混合物在透過半透膜時，實現(xiàn)選擇性分離的技術(shù)[6]。膜分離技術(shù)是物理過程，所以具有能耗低、效率高、操作條件溫和、對熱和酸的敏感性較低等優(yōu)點，適合于處理熱敏物質(zhì)[7]。通過膜分離技術(shù)制備的酪蛋白膠束粉的天然結(jié)構(gòu)不會被破壞，溶解度更好，同時乳清粉的變性程度也較低[8]。利用膜分離技術(shù)生產(chǎn)的羊乳清粉，其營養(yǎng)價值高，功能性優(yōu)良，可廣泛用于嬰幼兒配方奶粉、功能性食品等領(lǐng)域[9]，截留液中的酪蛋白也可用于生產(chǎn)干酪制品。

國內(nèi)，張雨萌等[10]通過膜分離建立了牛羊乳酪蛋白和乳清蛋白的分離效果對比研究；李志賓等[11]利用膜分離提取牛乳中乳清蛋白，在一定程度上保護(hù)了乳清蛋白中的生物活性成分；陳建行等[12]通過比較100 nm和40 nm 孔徑的陶瓷膜對酪蛋白和乳清蛋白的分離效果，發(fā)現(xiàn)40 nm 孔徑的陶瓷膜能夠更好得到清澈透明的乳清。ZULEWSKA J 等[13]在50 ℃的條件下得出，聚合物膜與陶瓷膜相比對血清蛋白的截留率更高；HURT E 等[14]在50 ℃條件下將牛乳用陶瓷膜恒壓微濾，使得乳清蛋白的脫除率達(dá)到98.3%[15]，而目前有關(guān)羊乳的膜分離技術(shù)研究還較少。

本研究采用不同孔徑的中空纖維膜和卷式有機膜對脫脂羊乳進(jìn)行分離，其中截留液可用于制作酪蛋白膠束粉或者干酪產(chǎn)品，滲透液則可用于制備高品質(zhì)的乳清蛋白產(chǎn)品[15]。對微濾過程中膜通量、料液組分構(gòu)成、pH 值、電導(dǎo)率值、顏色、脫除率和膜的污染與清洗等方面進(jìn)行分析，評估量化膜截留酪蛋白的能力。并對透過液和截留液分別進(jìn)行濃縮、噴霧干燥，期望能夠獲得純度較高的酪蛋白膠束粉，為工業(yè)化生產(chǎn)羊乳基料提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮液態(tài)羊乳，陜西金牛乳業(yè)有限公司；小牛皺胃酶，上海源葉生物科技有限公司；濃鹽酸（分析純），南昌市昌九化工廠；無水氯化鈣，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS），美國Amersham 公司；β-巰基乙醇，普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；N,N,N',N'-四甲基乙二胺，上海源葉生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)R-250，加拿大Bio Basic 公司；濃鹽酸，北京化學(xué)試劑廠；冰醋酸，廣州化學(xué)試劑廠；無水硫酸鉀，天津科密歐公司；無水硫酸銅，天津天力化學(xué)試劑公司；四甲基乙二胺（TEMED），美國Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機（HC-3018R），安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；電導(dǎo)率儀，上海般特儀器制造有限公司；pH 計（PB-10），賽托利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；卷式有機膜過濾裝置，同舟縱橫（廈門）流體有限公司；中空纖維素膜，美國通用電氣公司；移液槍（Transferpette），德國BRAND 公司；蛋白質(zhì)電泳儀，南京新校園生物技術(shù)研究所；穩(wěn)壓電源，鴻寶電氣股份有限公司；半自動凱式定氮儀（KN780），阿爾瓦儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 膜過濾操作、樣品pH 值和電導(dǎo)率的測定

1.3.1.1 膜參數(shù)及切向流過濾原理

膜基本參數(shù)如表1 所示。

表1 膜基本參數(shù)

切向流過濾與直流過濾原理不同，其原理如圖1所示，過濾速度能在相對長的一段時間里保持在一個較高的水平，可以實現(xiàn)連續(xù)化運行，工業(yè)生產(chǎn)過程主要使用切向流過濾。

圖1 切向流

1.3.1.2 中空纖維膜過濾操作流程

首先將800 mL 脫脂鮮羊乳加入物料罐中，打開電源后開泵，設(shè)備運行30 s 后調(diào)節(jié)進(jìn)口壓力閥（137.9 kPa)，設(shè)備繼續(xù)運行1 min 平穩(wěn)后開始計時收集所需樣品。在透過液管下端放置第一個燒杯收集透過液1 min，之后每間隔2 min 更換燒杯收集1 min，將收集液按順序進(jìn)行編號1.2.3……。每個時段收集結(jié)束，立即測定每一個燒杯中透過液的體積、pH 和電導(dǎo)率，同時再將每個燒杯中的透過液混勻以觀察顏色。物料罐中的膜上截留液回流至物料罐混合均勻后立即測定pH 和電導(dǎo)率，測定后立即倒回物料罐混勻，每2 min 循環(huán)一次。循環(huán)操作直至物料罐中樣品達(dá)到物料罐最小容納體積量（200 mL）時關(guān)泵。

1.3.1.3 卷式有機膜過濾操作流程

首先將4 000 mL 脫脂鮮羊乳加入物料罐中，打開電源后開泵，設(shè)備運行30 s 后調(diào)節(jié)進(jìn)口壓力閥（25 kPa)，設(shè)備繼續(xù)運行1 min 平穩(wěn)后開始計時收集所需樣品。在透過液管下端放置第一個燒杯收集透過液1 min，之后每間隔2 min 更換燒杯收集1 min，將收集液按順序進(jìn)行編號1.2.3……。每個時段收集結(jié)束，立即測定每一個燒杯中透過液的體積、pH 和電導(dǎo)率，同時再將每個燒杯中的透過液混勻以觀察顏色。物料罐中的膜上截留液回流至物料罐混合均勻后立即測定pH 和電導(dǎo)率，測定后立即倒回物料罐混勻，每2 min 循環(huán)一次。循環(huán)操作直至物料罐中樣品達(dá)到物料罐最小容納體積量（200 mL）時關(guān)泵。

利用pH 計和電導(dǎo)率儀直接測量各溶液的pH 和電導(dǎo)率，使用前分別在室溫下進(jìn)行儀器校正。

1.3.2 料液蛋白質(zhì)含量分析

采用凱式定氮法，對脫脂乳、截留液和滲透液中的總氮、非蛋白氮和非酪蛋白氮含量進(jìn)行測定?？偟繀⒄瘴墨I(xiàn)[16]測定，此方法測定的值包括蛋白氮和非蛋白氮；按照GB/T21704—2008《乳與乳制品中非蛋白氮含量的測定》方法測定非蛋白氮含量[17]；按照王宜生[18]方法對非酪蛋白氮含量進(jìn)行測定。按式（1）～（4）計算各蛋白含量：

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）蛋白質(zhì)鑒定與分析

利用凝膠電泳測定各個階段的截留液和透過液中蛋白質(zhì)類型及大致含量。分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.5%，將截留液（稀釋10 倍）、透過液和脫脂乳（稀釋5 倍），按照1∶1 的比例加入2×SDS 裂解液，搖勻后于恒溫器95 ℃加熱1 min，離心后取10 μL 點樣，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)對凝膠進(jìn)行染色，脫色至膠背景透明用凝膠成像儀進(jìn)行拍攝。

1.3.4 膜通量、濃縮倍數(shù)與脫除率的計算、膜的污染與清洗

膜通量的計算公式：

式中：F為膜通量，L/(m2·h)；V為滲透液的體積，L；J為膜面積，m2；t為過濾時間，h。

濃縮倍數(shù)的計算公式：

式中：M為脫脂羊乳的質(zhì)量，kg；m為過濾過程中某個時間滲透液的質(zhì)量，kg。

膜對乳清蛋白脫除率的計算公式：

式中：M1為滲透液中乳清蛋白的質(zhì)量，g；M2為脫脂乳中乳清蛋白的質(zhì)量，g。

膜對酪蛋白脫除率的計算公式：

式中：M1為截留液中酪蛋白的質(zhì)量，g；M2為脫脂乳中酪蛋白的質(zhì)量，g。

純水通量衰減系數(shù)（WFD），可衡量膜的污染程度，值越大表示膜污染程度越高。

式中：J0和Jt分別為膜過濾前及過濾后只用水清洗一次后的純水通量，L·m-2·h-1。

純水通量恢復(fù)系數(shù)（WFR），用于衡量膜的清洗效果。

式中：JQ和J0分別表示膜過濾前和清洗后的純水通量，L·m-2·h-1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各實驗均重復(fù)進(jìn)行3 次，結(jié)果表示為±s。利用SPSS 18.5 和Origin Pro 9.1 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理與繪圖分析。采用方差分析法進(jìn)行差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同孔徑中空纖維膜羊乳蛋白分離效果對比

2.1.1 不同孔徑中空纖維膜所得透過液外觀比較

為了充分對比3 種孔徑中空纖維膜對脫脂乳中乳蛋白的分離效果，試驗過程中對這幾種膜所得滲透液進(jìn)行了外觀對比。由圖2 可知，100、300 ku 和750 ku中空纖維膜滲透液分別呈清澈透明的黃綠色、輕微白色混濁和嚴(yán)重白色混濁，滲透液呈現(xiàn)黃綠色是含有VB 的緣故，ZULEWSKA J 等[19]研究發(fā)現(xiàn)透過液中的白色渾濁是由于部分酪蛋白發(fā)生滲透所造成的。

圖2 不同孔徑中空纖維膜所得透過液外觀

2.1.2 不同孔徑中空纖維膜羊乳蛋白分離效果定性分析

由圖3 可以看出，100、300、750 ku 這3 種孔徑的中空纖維膜對酪蛋白和乳清蛋白的分離效果是不同的，其中100 ku 的膜在過濾后酪蛋白和乳清蛋白均被截留，透過液中不含乳清蛋白，表明該孔徑并沒有將其分離，只是進(jìn)行了濃縮；300 ku 的膜在過濾后可以看出有少量的乳清蛋白存在于透過液中，同時截留液中依然存在部分乳清蛋白，表明酪蛋白和乳清蛋白并未完全分開；750 ku 的膜可以將酪蛋白和乳清蛋白有效地分離，大部分的乳清蛋白均被透過，只有極少部分的乳清蛋白存于截留液中，表明該孔徑的膜過濾效果較好。綜上所述，750 ku 的中空纖維膜能夠有效地將酪蛋白和乳清蛋白分離。

圖3 中空纖維膜乳蛋白分離SDS-PAGE

2.1.3 不同孔徑中空纖維膜羊乳蛋白分離效果定量分析

由表2 可以看出，隨著中空纖維膜孔徑的增大，酪蛋白占真蛋白的比例在截留液中有所增加，在透過液中減?。磺宓鞍渍颊娴鞍椎谋壤诮亓粢褐袦p小，在透過液中增加。結(jié)合蛋白質(zhì)的電泳定性分析，實驗選擇750 ku 的中空纖維膜可以兼顧截留酪蛋白和有效濾除乳清蛋白。

表2 3 種中空纖維膜乳蛋白分離樣品的蛋白質(zhì)含量

2.1.4 中空纖維膜截留液與透過液pH 和電導(dǎo)率的測定

由圖4（a）和（b）可知隨著時間的延長截留液的pH升高，透過液的pH 降低。這是由于在過濾中H+透過膜進(jìn)到透過液中導(dǎo)致透過液pH 降低，截留液pH 增加。

圖4 中空纖維膜截留液與透過液pH、電導(dǎo)率隨過濾時間的動態(tài)變化

電導(dǎo)率能夠及時反映液體物料體系中電解質(zhì)的多寡，是動態(tài)跟蹤膜過濾過程的良好指標(biāo)。由圖4 的（c）和（d）可知，截留液的電導(dǎo)率隨時間逐漸降低，而透過液的電導(dǎo)率則增大。這是由于在過濾中Na+、K+、P3-等離子透過膜進(jìn)到透過液中導(dǎo)致透過液電導(dǎo)率上升，截留液電導(dǎo)率下降。這與李啟明等[20]的研究結(jié)果一致，牛乳中的Na+、K+、Cl-等一價離子幾乎全部在乳清相中，呈可溶性狀態(tài)。

2.2 不同孔徑卷式有機膜羊乳蛋白分離效果對比

2.2.1 不同孔徑卷式有機膜所得透過液外觀比較

為了充分對比2 種孔徑卷式有機膜對脫脂乳中乳蛋白的分離效果，試驗過程中對這幾種膜所得滲透液進(jìn)行了外觀對比。由圖5 可知，0.1 μm 和0.45 μm 卷式有機膜滲透液呈清澈透明的黃綠色和輕微白色混濁的黃綠色，這說明0.45 μm 膜過濾時有酪蛋白透過。

圖5 不同孔徑卷式有機膜所得透過液外觀

2.2.2 不同孔徑卷式有機膜羊乳蛋白分離效果定性分析

由圖6 所示，脫脂乳在0.1 μm 的卷式有機膜過濾后酪蛋白幾乎全部被截留，同時大部分的乳清蛋白均被透過；0.45 μm 的膜過濾后，有一部分的酪蛋白進(jìn)到了透過液中，表明該孔徑的膜偏大。綜上所述，0.1 μm 孔徑的卷式有機膜能夠有效的將酪蛋白和乳清蛋白分離。

圖6 卷式有機膜乳蛋白分離SDS-PAGE

2.2.3 不同孔徑卷式有機膜羊乳蛋白分離效果定性分析

由表3 可知，當(dāng)卷式有機膜的孔徑增大時，截留液中酪蛋白占真蛋白的比例增加，乳清蛋白占真蛋白的比例減?。煌高^液中酪蛋白占真蛋白的比例明顯增加，乳清蛋白占真蛋白的比例明顯減少。結(jié)果表明，0.1 μm 的膜可以有效截留酪蛋白并濾除乳清蛋白。

表3 2 種卷式有機膜乳蛋白分離樣品的蛋白質(zhì)含量

2.2.4 卷式有機膜截留液與透過液pH 和電導(dǎo)率的測定

如圖7（a）和（b）所示，隨著過濾時間的延長，截留液的pH 逐漸上升，透過液的pH 逐漸下降。截留液pH 在5.8～7.4 之間，透過液pH 在6.2～6.6 之間，變化趨勢較小，這是由于分離過程中離子變化導(dǎo)致的。

圖7 卷式有機膜截留液與透過液pH、電導(dǎo)率隨過濾時間的動態(tài)變化

如圖7（c）和（d）所示，截留液與透過液的電導(dǎo)率呈現(xiàn)相反的趨勢，隨著分離時間的延長，截留液電導(dǎo)率逐漸降低，透過液電導(dǎo)率逐漸增加，截留液電導(dǎo)率在6.16～6.32 間進(jìn)行波動，透過液電導(dǎo)率在6.25～6.50間波動，兩者的變化浮動都比較緩慢，0.45 μm 膜分離的截留液與透過液均略高于0.1 μm。電導(dǎo)率變化趨勢與中空纖維膜一致。

2.3 膜通量的比較

由于酪蛋白和乳清蛋白直徑有很大差異，因此可以通過膜技術(shù)對其進(jìn)行分離。膜過濾過程中，隨著時間的推移，截留液中固形物含量和料液黏度不斷增加，膜表面濃差化現(xiàn)象加劇且膜過濾的阻力增加，導(dǎo)致膜通量下降[21]。由圖8 可知，100、300、750 ku 的中空纖維膜初始膜通量分別為25.6、26.4、21.97 L/(m2·h)，使用后膜通量為9.2、10.1、10.9 L/(m2·h)；0.1 μm 和0.45 μm 的卷式有機膜初始膜通量為29.5 L/(m2·h) 和42.9 L/(m2·h)，使用后膜通量為20.1 L/(m2·h)和34.1 L/(m2·h)。卷式有機膜形成“二次膜”的速度小于中空纖維膜。由表2～3可知，750 ku 的中空纖維膜和0.1 μm 的卷式有機膜過濾效果較好。綜上所述，0.1 μm 的卷式有機膜即能有效地分離乳蛋白又能較慢的形成濾餅層。

圖8 中空纖維膜與卷式有機膜通量變化

2.4 膜的清洗與污染

在整個過濾過程中經(jīng)過不斷的稀釋，濾餅層逐漸形成，中空纖維膜和卷式有機膜的膜通量由最初的142、435 L/(m2·h)降至51.5、262.5 L/(m2·h)，這是因為在膜表面形成了一層濾餅，增加了滲透液體的阻力，說明膜受到了一定程度的污染。稀釋過濾后對2 種膜分別進(jìn)行了1 mol/L NaOH 清洗、pH=3 磷酸清洗和0.3 %次氯酸鈉與NaOH 混合清洗。污染與清洗情況如表4 所示，由表4 數(shù)據(jù)可知750 ku 中空纖維膜的純水通量衰減系數(shù)（63.7%）大于0.1 μm 的卷式有機膜的純水通量衰減系數(shù)（39.7%），說明在過濾過程中中空纖維膜的污染速度較快，污染程度較高。同時可以看出，以上的3 種清洗方法中，次氯酸鈉與NaOH 混合清洗后中空纖維膜的純水通量恢復(fù)系數(shù)為88.5%；卷式有機膜的純水通量恢復(fù)系數(shù)為97.1%，清洗效果優(yōu)于其他2 種清洗方法，膜通量得到了很好的恢復(fù)。綜上所述，0.1 μm 的卷式有機膜用次氯酸鈉與NaOH 混合的方法清洗膜通量恢復(fù)效果最佳。

表4 不同階段純水通量變化

2.5 最佳膜分離效果比較

由表5 可知，750 ku 中空纖維膜過濾后，透過液中羊乳酪蛋白脫除率為98.8 %，截留液中乳清蛋白脫除率為82.7 %；0.1 μm 卷式有機膜過濾后透過液中羊乳酪蛋白脫除率為99.6 %，截留液中清蛋白脫除率為82.7 %。與徐殊等[22]采用100 nm 陶瓷膜所分離酪蛋白和乳清蛋白相比，分離效果更佳。膜法分離能夠有效的截留酪蛋白，可用于奶酪的生產(chǎn)。透過液中清蛋白/酪蛋白的比值都大概為11，比原料乳中的0.22 提高了50 倍，該乳清蛋白與酪蛋白的比例滿足嬰幼兒配方奶粉的應(yīng)用要求。比較2 種膜分離過程中膜通量的變化來看，0.1 μm 卷式有機膜出現(xiàn)“二次膜”的速度較慢，污染程度更低，清洗后膜通量恢復(fù)率更大，表明其更易于清洗和恢復(fù)。與傳統(tǒng)的酶法和酸法提取酪蛋白相比，膜法所得的酪蛋白中不含殘留的凝乳酶、發(fā)酵劑、乳酸等，更加綠色環(huán)保，所以0.1 μm 卷式有機膜更適于工業(yè)化應(yīng)用。

表5 最佳膜分離效果比較

3 結(jié) 論

將2 種不同材質(zhì)的中空纖維膜（100、300、750 ku）與卷式有機膜（0.1 μm、0.45 μm）進(jìn)行比較分析后發(fā)現(xiàn)，750 ku 中空纖維膜和0.1 μm 卷式有機膜既能將酪蛋白較好的截留，又能有效的將乳清蛋白透過，2 種孔徑膜通過實驗得到的平均膜通量值分別是25.7 和25.2 L/(m2·h)。比較膜的污染與清洗結(jié)果，0.1 μm 卷式有機膜純水通量衰減系數(shù)（39.7%）小于750 ku 中空纖維膜系數(shù)（63.7%），說明該卷式有機膜污染慢，污染程度低，通過3 種膜清洗方案比較，發(fā)現(xiàn)次氯酸鈉與NaOH 混合液清洗的效果最佳，使750 ku 中空纖維膜的水通量恢復(fù)系數(shù)達(dá)到88.5%，0.1 μm 卷式有機膜的純水通量恢復(fù)系數(shù)達(dá)到97.1%。綜上所述，0.1 μm 卷式有機膜是最適合分離乳蛋白的膜。