董 雪， 劉曉露， 李麗蓓， 劉嫵妍， 雷 浩， 樊 霞

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京海淀 100081；2.陜西秦云農(nóng)產(chǎn)品檢驗(yàn)檢測(cè)股份有限公司，陜西渭南 714000）

目前，我國(guó)飼料行業(yè)已進(jìn)入綠色高質(zhì)量發(fā)展新階段。 2019 年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布第194 號(hào)公告，規(guī)定從2020 年7 月1 日起， 飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料，飼料行業(yè)正式邁入“禁抗”新紀(jì)元。 基于飼料全面禁抗的背景，飼料中的“替抗”產(chǎn)品蓬勃發(fā)展，微生態(tài)制劑亦列其中，成為研發(fā)熱點(diǎn)，《2021 年全國(guó)飼料工業(yè)發(fā)展概況》顯示我國(guó)微生態(tài)制劑型飼料添加劑產(chǎn)量同比增幅達(dá)17.4%，行業(yè)發(fā)展迅速。

飼用微生物亦稱飼用益生菌、 微生態(tài)制劑，《飼料添加劑品種目錄》（2013）及其修訂版中列出了34 種綠色無毒、健康環(huán)保、增效顯著的功能性微生物允許在飼料生產(chǎn)中使用，主要包括酵母菌、芽孢桿菌、乳酸菌、部分光合細(xì)菌和少數(shù)曲霉（王秋菊等，2018）。 芽孢桿菌在生物體和環(huán)境中廣泛存在，是飼養(yǎng)環(huán)境中的天然菌群，由于能夠產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等功能性酶，因此在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生及工業(yè)等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值（雷新雨等，2021；潘慧青等，2019）。 與傳統(tǒng)的益生菌相比， 以芽孢休眠體形式存在的芽孢桿菌具有更強(qiáng)抗逆性，耐高溫、耐酸堿、耐擠壓、貨架期長(zhǎng)，生產(chǎn)成本低于乳酸菌和酵母菌，適用范圍廣，進(jìn)入養(yǎng)殖動(dòng)物消化系統(tǒng)后也能保持高度的穩(wěn)定性（Cheng等，2021；Popov 等，2021）。 枯草芽孢桿菌 （于潔等，2020）、地衣芽孢桿菌（陳雪穎等，2022）、凝結(jié)芽孢桿菌（喬欣君，2021）等為目前養(yǎng)殖過程中使用最廣泛的三種益生芽孢桿菌。

地衣芽孢桿菌作為生產(chǎn)飼用芽孢桿菌制劑的主要菌種之一，其發(fā)酵能夠產(chǎn)生肽類、磷脂類、多烯類、氨基酸類等多種抗菌物質(zhì)，產(chǎn)出的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶具有良好的活性， 在保持養(yǎng)殖動(dòng)物腸道微生態(tài)系統(tǒng)平衡、 提高動(dòng)物機(jī)體抗病能力等方面均具有顯著作用（Muras 等，2021）。 但目前市場(chǎng)中菌劑制品最大的限制是易受溫濕度等儲(chǔ)存條件的影響，產(chǎn)品保質(zhì)期較短，若使用時(shí)有效活菌數(shù)未能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定值（1.0×109CFU/mL 或g）將會(huì)影響作用效果， 故大部分產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中會(huì)通過篩選培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件來提高有效成分，或通過工藝優(yōu)化和添加保護(hù)劑等方式減少產(chǎn)品有效活菌數(shù)的衰亡等（Wang 等，2021；Dianawati 等，2013）。 孫標(biāo)等（2021）通過優(yōu)化發(fā)酵工藝獲得凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)芽孢最佳培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件，最終產(chǎn)芽孢數(shù)達(dá)到2.848×1010CFU/mL，相比優(yōu)化前提高了61.72%。趙甜宇等（2020）在研究枯草芽孢桿菌固態(tài)菌劑制備工藝時(shí)， 通過單因素和正交試驗(yàn)獲得最適芽孢形成的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成與培養(yǎng)條件，芽孢數(shù)最高可達(dá)1.1×1010CFU/mL。 Su等（2019） 在解淀粉芽孢桿菌搖瓶發(fā)酵中優(yōu)化工藝使芽孢產(chǎn)量提高了25.7 倍， 濕基質(zhì)芽孢濃度達(dá)到7.24×1010CFU/g。

本研究采用單因素和正交試驗(yàn)的方法對(duì)地衣芽孢桿菌CICC 20514 產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化， 旨在提高發(fā)酵液中芽孢數(shù)量及比例， 為后續(xù)地衣芽孢桿菌制品的開發(fā)及延長(zhǎng)相應(yīng)產(chǎn)品貨架期奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備與材料 TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(jì) （北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），ZWY-100H 恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司），GI54DWS 高壓滅菌器（廈門致微儀器有限公司），AC2-4S1 生物安全柜（新加坡ESCO 科技有限公司），CX33 生物顯微鏡（日本OLYMPUS 株 式 會(huì) 社），SHP-080 生 化 培 養(yǎng) 箱 等（上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

地衣芽孢桿菌（編號(hào)：CICC 20514）購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；牛肉浸粉、酵母浸粉、蛋白胨、營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；蔗糖、葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、糖蜜、磷酸氫二鉀、碳酸鈣（北京索萊寶科技有限公司）；硫酸錳、硫酸鎂（上海麥克林生化科技有限公司）；氯化鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉5 g/L、K2HPO44 g/L、MnSO40.4 g/L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將地衣芽孢桿菌CICC 20514 接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板37 ℃培養(yǎng)18 ~ 24 h，取平面培養(yǎng)物加無菌生理鹽水制成約108CFU/mL菌懸液， 以5%接種量接種于50 mL 無菌營(yíng)養(yǎng)肉湯中，置于37 ℃，220 r/min 恒溫?fù)u箱中培養(yǎng)。 以生理鹽水為空白對(duì)照， 每隔4 h 測(cè)定種子液的OD600nm值，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.2.2 地衣芽孢桿菌測(cè)定 活菌數(shù)： 將發(fā)酵液按10 倍稀釋法制成不同濃度稀釋液， 選擇2 ~ 3 個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，吸取0.2 mL 接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板內(nèi)，涂布棒涂布，每個(gè)稀釋度接種2 個(gè)平板。待接種物被培養(yǎng)基完全吸收， 倒置平皿水平放于（37±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（48±2）h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

芽孢數(shù)：將發(fā)酵液按10 倍稀釋法制成不同濃度稀釋液， 選擇2 ~ 3 個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，置（80±1）℃水浴10 min，冷卻至室溫后吸取0.2 mL接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板內(nèi)，涂布棒涂布，每個(gè)稀釋度接種2 個(gè)平板。待接種物被培養(yǎng)基完全吸收，倒置平皿水平放于（37±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（48±2）h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

芽孢率/%=芽孢數(shù)（CFU/mL）/活菌數(shù)（CFU/mL）×100。

1.2.3 碳源成分及濃度篩選 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分不變，以10 g/L 的果糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、糖蜜代替葡萄糖篩選碳源成分。 將已 篩 選的 最 佳 碳 源 按 照5、10、15、20、25、30 g/L濃度添加，篩選產(chǎn)芽孢最佳碳源濃度。

1.2.4 氮源成分及濃度篩選 在單因素篩選的最佳碳源及濃度基礎(chǔ)上，以10 g/L 的蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉、玉米漿、豆粕、花生餅粉代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的混合氮源，篩選氮源成分。將已篩選的最佳氮源按照5、10、15、20、25、30 g/L 濃度添加，篩選產(chǎn)芽孢最佳氮源濃度。

1.2.5 無機(jī)鹽成分及濃度篩選 在已篩選的最佳碳氮源及濃度基礎(chǔ)上， 分別用1、3、5、7、9 g/L 的K2HPO4和NaCl，0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L 的Mn-SO4、MgSO4和CaCO3， 代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽成分，篩選無機(jī)鹽成分及濃度，選擇具有促芽孢生成效果的無機(jī)鹽及其濃度進(jìn)行正交試驗(yàn)，篩選最優(yōu)搭配組合。

1.2.6 接種量篩選 以發(fā)酵產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基最優(yōu)搭配組合為基礎(chǔ)， 按1%、3%、5%、7%、9%接種量將種子液接種發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min 培養(yǎng)48 h 篩選最佳產(chǎn)芽孢接種量。

1.2.7 裝樣量篩選 按10%、15%、20%、25%、30%裝樣量將發(fā)酵培養(yǎng)基置500 mL 錐形瓶中， 以最佳接種量接種種子液，37 ℃，220 r/min 培養(yǎng)48 h 篩選最佳產(chǎn)芽孢裝樣量。

1.2.8 發(fā)酵液初始pH 篩選 按最佳裝樣量配制發(fā)酵培養(yǎng)基后， 用1 mol/L NaOH 和1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基pH 至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 后滅菌，按最佳接種量接種種子液，37 ℃，220 r/min 培養(yǎng)48 h 篩選最佳產(chǎn)芽孢初始pH。

1.2.9 發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間篩選 以NY/T 1461-2007《飼料微生物添加劑 地衣芽孢桿菌》 中培養(yǎng)時(shí)間48 h 為依據(jù)，分別將48、60、72、84、96 h 作為發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行活菌和芽孢計(jì)數(shù)， 篩選最佳產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 地衣芽孢桿菌以5%接種量接種至50 mL 的營(yíng)養(yǎng)肉湯，37 ℃，220 r/min 條件下培養(yǎng)36 h，生長(zhǎng)曲線如圖1 所示。0~4 h 生長(zhǎng)緩慢，為延滯期；4 ~ 20 h 大量增殖，為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；20~36 h 趨于平穩(wěn)，為穩(wěn)定期。 為獲取較高濃度種子液且保持菌株的生長(zhǎng)活力，通常選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期和穩(wěn)定生長(zhǎng)前期進(jìn)行發(fā)酵液的接種，因此本研究選擇16~20 h 作為種子液培養(yǎng)終止時(shí)間。

圖1 地衣芽孢桿菌CICC 20514 生長(zhǎng)曲線

2.2 產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基成分及濃度篩選

2.2.1 碳源成分及濃度篩選 碳源是微生物碳架的組成部分， 也是多數(shù)微生物生長(zhǎng)不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 本研究將10 g/L 葡萄糖、果糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米淀粉和糖蜜作為培養(yǎng)基的碳源，以芽孢數(shù)和芽孢率為指標(biāo)進(jìn)行篩選， 結(jié)果如圖2 所示。不同碳源對(duì)產(chǎn)芽孢數(shù)和芽孢率具有顯著影響，其中蔗糖最低且低于對(duì)照培養(yǎng)基，以果糖、可溶性淀粉和玉米淀粉為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基的芽孢數(shù)顯著高于其他處理組（P < 0.05；圖2A），此三組間雖差異不顯著，但以果糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基芽孢率明顯高于玉米淀粉和可溶性淀粉，符合擴(kuò)大生產(chǎn)和研究目的， 因此確定果糖為地衣芽孢桿菌CICC 20514 發(fā)酵產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基的最佳碳源。 再以果糖為碳源進(jìn)行最佳濃度篩選，結(jié)果如圖2B 所示。 發(fā)酵液中芽孢數(shù)在5 ~ 25 g/L 果糖濃度內(nèi)差異不顯著（P>0.05），其中20 g/L 芽孢數(shù)最高，30 g/L 濃度下芽孢數(shù)顯著下降。 從芽孢率結(jié)果可知，隨果糖濃度的升高芽孢率整體呈下降趨勢(shì)， 其中5 g/L 芽孢率最高，10~20 g/L 相近， 其中20 g/L 芽孢率相對(duì)最高，25~30 g/L 芽孢率很低； 同時(shí)考慮到活菌數(shù)對(duì)芽孢率計(jì)算的影響，5 g/L 果糖的活菌數(shù)為濃度梯度中最低，故最終選擇20 g/L 果糖作為最佳碳源濃度。 整體結(jié)果也可以說明果糖為速效碳源，能夠直接供給菌體所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)活菌增殖，但過高的糖濃度對(duì)后期芽孢的形成有抑制作用。

圖2 碳源及濃度菌落計(jì)數(shù)篩選結(jié)果

2.2.2 氮源成分及濃度篩選 氮源是微生物構(gòu)成菌體蛋白和DNA 等含氮物質(zhì)的必要營(yíng)養(yǎng)成分。 本研究預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無機(jī)氮源對(duì)CICC 20514 地衣芽孢桿菌產(chǎn)芽孢無明顯促進(jìn)作用， 因此選用蛋白胨、酵母浸粉、玉米干漿、花生餅粉、豆粕6 種有機(jī)氮源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源篩選。不同氮源對(duì)發(fā)酵液中芽孢數(shù)的影響見圖3A。 添加有機(jī)氮源的處理組芽孢數(shù)和芽孢率均高于對(duì)照組，其中以酵母浸粉為氮源的培養(yǎng)基發(fā)酵后的芽孢數(shù)最低且與其他處理組呈顯著性差異，以蛋白胨、牛肉浸粉和玉米干漿為氮源的培養(yǎng)基發(fā)酵后的芽孢數(shù)無顯著性差異，以花生餅粉和豆粕為氮源的培養(yǎng)基促芽孢生成效果明顯高于其他處理組（P < 0.05），但以豆粕為氮源的培養(yǎng)基發(fā)酵后的芽孢數(shù)及芽孢率平均值較高，因此選用豆粕作為最佳氮源。隨后對(duì)豆粕的添加濃度進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見圖3B。 隨著豆粕濃度的升高，發(fā)酵液芽孢數(shù)和芽孢率均呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中在15 ~ 20 g/L 濃度間芽孢數(shù)差異不顯著 （P >0.05）， 但20 g/L 豆粕濃度的芽孢率遠(yuǎn)高于15 g/L，故選用20 g/L 豆粕作為最佳氮源濃度。

圖3 氮源及濃度菌落計(jì)數(shù)篩選結(jié)果

2.2.3 無機(jī)鹽成分及濃度篩選 無機(jī)鹽是菌體在生長(zhǎng)和繁殖過程中不可缺少的生理活性物質(zhì)，其中金屬離子在一定濃度范圍內(nèi)可以促進(jìn)芽孢形成。本研究以20 g/L 果糖、20 g/L 豆粕為基礎(chǔ)分別添加5種不同濃度的無機(jī)鹽進(jìn)行促芽孢生成效果的比較，結(jié)果如圖4 所示。 與對(duì)照組相比K2HPO4和NaCl均具有明顯促芽孢生成作用，且隨著添加濃度的升高芽孢數(shù)和芽孢率均呈先上升后下降的趨勢(shì)，最佳產(chǎn)芽孢濃度均為5 g/L。MgSO4在0.4~0.8 g/L 濃度下芽孢數(shù)明顯高于對(duì)照組，CaCO3在0.4 ~ 1.0 g/L濃度下對(duì)芽孢生成有明顯促進(jìn)作用，兩者作用效果穩(wěn)定性良好，芽孢數(shù)均在0.6 g/L 達(dá)到最高值。 Mn-SO4在本研究中與對(duì)照組差異較小（P>0.05），該濃度范圍促芽孢生成作用不明顯。

圖4 無機(jī)鹽及濃度菌落計(jì)數(shù)篩選結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果， 為進(jìn)一步提高芽孢數(shù)量，以20 g/L 果糖和20 g/L 豆粕為基礎(chǔ)，分別選取K2HPO4、CaCO3、NaCl 和MgSO4進(jìn)行L9（43）正交試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。 芽孢數(shù)極差排序?yàn)镽D>RB>RC>RA，最佳搭配組合為A2B2C3D3，芽孢率極差排序?yàn)镽B>RD>RC>RA， 最終的優(yōu)化方案也為A2B2C3D3。 表2 方差分析結(jié)果顯示， 無機(jī)鹽CaCO3、K2HPO4和MgSO4均對(duì)發(fā)酵液芽孢數(shù)量 有顯著性影響， 且主次因素為CaCO3＞K2HPO4＞Mg-SO4； 表3 方差分析結(jié)果表明， 無機(jī)鹽CaCO3和K2HPO4對(duì)發(fā)酵液芽孢率有顯著影響，影響作用為K2HPO4＞CaCO3。

表2 無機(jī)鹽正交試驗(yàn)芽孢數(shù)結(jié)果方差分析

表3 無機(jī)鹽正交試驗(yàn)芽孢率結(jié)果方差分析

綜上，芽孢數(shù)和芽孢率的最佳發(fā)酵液無機(jī)鹽搭配組合均為A2B2C3D3，未在正交試驗(yàn)表中，需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)， 因A 因素極差較小， 可將A1B2C3D3、A3B2C3D3、A1B3C3D3試驗(yàn)方案與正交表中芽孢數(shù)和芽孢率最高的A2B2C3D3進(jìn)行比較， 選擇最優(yōu)組合。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果如圖5 所示，地衣芽孢桿菌產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳搭配組合為A2B2C3D3，即20 g/L 果糖、20 g/L 豆粕、7 g/L NaCl、5 g/L K2HPO4、0.8 g/L CaCO3和0.8 g/L MgSO4。

圖5 正交搭配組合菌落計(jì)數(shù)篩選結(jié)果

2.3 產(chǎn)芽孢培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.3.1 接種量篩選 不同接種量對(duì)發(fā)酵液產(chǎn)芽孢數(shù)量也具有一定影響， 本研究設(shè)置5 個(gè)梯度接種量，結(jié)果見圖6，在1%~9%接種量，芽孢數(shù)和芽孢率均隨接種量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中5%接種量的芽孢數(shù)最多，3%和7%接種量與之相比差異不顯著 （P > 0.05）；1%接種量的芽孢率最低，3%~9%接種量的芽孢率相近，其中5%接種量的芽孢率最高，故芽孢桿菌的最佳接種量為5%。

圖6 接種量對(duì)芽孢數(shù)和芽孢率的影響

2.3.2 裝樣量篩選 本研究采用錐形瓶（500 mL）進(jìn)行裝樣量的試驗(yàn)，容器剩余空間大小可能也對(duì)芽孢率和芽孢數(shù)產(chǎn)生影響，結(jié)果見圖7。隨著裝樣量的增多， 產(chǎn)芽孢數(shù)和芽孢率均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，裝樣量在10%~20%芽孢數(shù)和芽孢率均無顯著性差異且明顯高于其他處理組（P < 0.05），為方便后續(xù)發(fā)酵液的大量收集，研究的最佳裝樣量為20%。

圖7 裝樣量對(duì)芽孢數(shù)和芽孢率的影響

2.3.3 發(fā)酵液初始pH 篩選 發(fā)酵液初始pH 對(duì)地衣芽孢桿菌產(chǎn)芽孢能力的相關(guān)研究較少， 本研究對(duì)此因素進(jìn)行探討，結(jié)果如圖8 所示。產(chǎn)芽孢數(shù)和芽孢率在pH 6 ~ 8 均呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)，發(fā)酵液初始pH 維持在6.5 ~ 7.5 芽孢數(shù)量和芽孢率較高，且三組間結(jié)果間差異不顯著（P > 0.05），初始pH 在6 和8 時(shí)產(chǎn)芽孢能力均顯著低于三組中性條件， 說明芽孢桿菌產(chǎn)芽孢能力在中性條件下比較穩(wěn)定， 偏酸性或偏堿性都會(huì)減弱其產(chǎn)芽孢數(shù)量和芽孢率。

圖8 初始pH 對(duì)芽孢數(shù)和芽孢率的影響

2.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間篩選 地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)36 h 的發(fā)酵液中芽孢數(shù)量較少，因此本研究自發(fā)酵培養(yǎng)48 h 開始取樣并持續(xù)觀察至發(fā)酵培養(yǎng)的96 h。 結(jié)果如圖9 所示。 發(fā)酵液終止培養(yǎng)時(shí)間在48 ~ 72 h 芽孢數(shù)量無明顯差異（P> 0.05）， 芽孢率也無明顯差異，84 ~ 96 h 發(fā)酵液芽孢數(shù)量和芽孢率均有所下降， 本著節(jié)能提效的宗旨，本研究選用48 h 作為發(fā)酵終止培養(yǎng)時(shí)間。

圖9 發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間對(duì)芽孢數(shù)和芽孢率的影響

3 討論

自然界微生物生長(zhǎng)依賴于天然營(yíng)養(yǎng)物，而實(shí)驗(yàn)室或企業(yè)通常選擇人工合成的培養(yǎng)基來獲得目標(biāo)微生物， 不同的微生物所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)種類和濃度有很大差異， 因此需要通過一定的科學(xué)方法篩選和優(yōu)化培養(yǎng)基配方， 以找到適宜特定微生物生長(zhǎng)繁殖并獲得目標(biāo)產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)組分和比例（李金榮等，2022）。 Khardziani 等（2017）研究影響枯草芽孢桿菌孢子產(chǎn)量關(guān)鍵因素時(shí)發(fā)現(xiàn)， 葡萄糖及濃度對(duì)芽孢形成能力的表達(dá)起著至關(guān)重要的作用。 魏強(qiáng)等（2019）優(yōu)化地衣芽孢桿菌10236 發(fā)酵條件發(fā)現(xiàn)最佳碳源是葡萄糖，葡萄糖是大多微生物能夠直接利用的單糖， 本研究以提高CICC 20514 地衣芽孢桿菌的產(chǎn)芽孢數(shù)量為目標(biāo)，對(duì)培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化，在篩選碳源時(shí)發(fā)現(xiàn)果糖和可溶性淀粉同樣能有效促進(jìn)芽孢萌發(fā)，且效果均優(yōu)于葡萄糖。 對(duì)于地衣芽孢桿菌CICC 20514 產(chǎn)芽孢碳源以果糖為最佳， 說明針對(duì)不同的目標(biāo)產(chǎn)物， 所需最佳碳源種類有所不同。 本研究在鏡檢過程中還發(fā)現(xiàn)，以可溶性淀粉為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基部分菌體出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，且后續(xù)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)時(shí)產(chǎn)芽孢數(shù)量不穩(wěn)定，回收率差。 地衣芽孢桿菌不能直接利用可溶性淀粉為能量來源， 淀粉酶分解可溶性淀粉為單糖有益于微生物充分利用。 本研究中以可溶性淀粉為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)芽孢性能不穩(wěn)定，或許與地衣芽孢桿菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生淀粉酶的時(shí)間和數(shù)量有關(guān)，但具體原因有待進(jìn)一步研究。

氮源是構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)、核酸和其他含氮化合物的主要物質(zhì)。 有研究表明有機(jī)氮源含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和未知的生長(zhǎng)因子， 更能促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)， 而無機(jī)氮源營(yíng)養(yǎng)成分相對(duì)單一常常需要輔助多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)才能達(dá)到較好的利用效果（陳志超等，2022）。 本試驗(yàn)僅對(duì)CICC 20514地衣芽孢桿菌進(jìn)行了產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基有機(jī)氮源的篩選， 結(jié)果顯示花生餅粉和豆粕均具有良好的促芽孢生成效果， 原因可能是花生餅粉和豆粕富含多種氨基酸和維生素， 這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可作為生長(zhǎng)因子， 對(duì)菌體的生長(zhǎng)和芽孢的萌發(fā)有特殊的促進(jìn)作用。Su 等（2019）研究表明，在優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)基過程中加入少量玉米粕、豆粕和麥麩有利于菌株的生長(zhǎng)， 這些富含淀粉和蛋白質(zhì)固體基質(zhì)不僅是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)， 也是細(xì)菌增殖的載體，本研究結(jié)果與之相同。

無機(jī)鹽是菌體生長(zhǎng)繁殖過程中調(diào)節(jié)生理活性作用的物質(zhì)， 主要功能包括構(gòu)成菌體組成成分、作為酶的激活劑或抑制劑、調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH和滲透壓等， 其種類和含量對(duì)菌體生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的生成具有很大影響（嚴(yán)凌斌等，2020）。 本試 驗(yàn) 采 用K2HPO4、NaCl、MnSO4、MgSO4和CaCO3進(jìn)行了產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基無機(jī)鹽組成的研究，結(jié)果顯示Na+、K+、Ca2+、Mg2+均對(duì)地衣芽孢桿菌產(chǎn)芽孢具有促進(jìn)作用，梁棟等（2018）表示，Ca2+是影響芽孢數(shù)量的顯著性因素， 常與芽孢核心成分2，6-吡啶二羧酸 （DPA） 形成螯合物Ca2+-DPA，促進(jìn)芽孢萌發(fā)。 多篇文獻(xiàn)報(bào)道，Mn2+有促進(jìn)微生物生長(zhǎng)和芽孢萌發(fā)的作用， 但在本研究中無明顯效果， 可能是CICC 20514 地衣芽孢桿菌對(duì)Mn2+的需求和其他菌株不同 （楊旭等，2022；Ren 等，2018）。

除培養(yǎng)基組成影響微生物生長(zhǎng)繁殖外，培養(yǎng)條件也是決定微生物是否能夠高效生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的關(guān)鍵因素（余萍等，2021）。 本試驗(yàn)初步研究了接種量、初始pH、裝樣量和發(fā)酵終止時(shí)間對(duì)地衣芽孢桿菌CICC20514 產(chǎn)芽孢效果的影響，結(jié)果顯示過多或過少的接種量均會(huì)影響發(fā)酵液產(chǎn)芽孢數(shù)量， 適當(dāng)?shù)慕臃N量可以有效縮短發(fā)酵產(chǎn)芽孢周期。 裝樣量的改變通常代表溶氧濃度，裝樣量越少溶氧能力越強(qiáng)， 裝樣量過高則發(fā)酵液中的溶氧量不足，會(huì)影響菌體生長(zhǎng)繁殖。 張璐璐等（2015）研究球孢白僵菌發(fā)酵工藝時(shí)使用250 mL錐形瓶進(jìn)行試驗(yàn)，裝樣量20%為最佳，本研究以500 mL 錐形瓶研究裝樣量的影響， 也是20%為最佳。 培養(yǎng)基初始pH 的改變會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)和代謝，Singh 等（2022）研究表明，地衣芽孢桿菌AP1 在pH 6.5 時(shí)生物氫的產(chǎn)量最佳，過酸或過堿都會(huì)影響生產(chǎn)效果，CICC 20514 地衣芽孢桿菌在pH 過高或過低條件下產(chǎn)芽孢效果也有所減少，但在pH 6.5 ~ 7.5 產(chǎn)芽孢數(shù)量差異不明顯，本研究配制的發(fā)酵液初始pH 基本維持在中性范圍，可直接使用不需再進(jìn)行調(diào)節(jié)。 不同的發(fā)酵終止時(shí)間對(duì)能否收獲到足夠數(shù)量的芽孢有著重要影響，本試驗(yàn)選擇持續(xù)監(jiān)測(cè)48 ~ 96 h 發(fā)酵液芽孢數(shù)量的變化， 發(fā)現(xiàn)在一定時(shí)間范圍內(nèi)芽孢數(shù)量不隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生顯著性變化，但當(dāng)發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，數(shù)量有所下降。 通過鏡檢發(fā)現(xiàn)48 ~ 72 h 發(fā)酵液中大部分芽孢呈萌發(fā)狀態(tài)，未完全脫落，84 ~ 92 h 發(fā)酵液芽孢開始脫落，成為單獨(dú)的個(gè)體， 菌體因發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的大量積累出現(xiàn)自溶現(xiàn)象， 故選用48 h 作為發(fā)酵終止培養(yǎng)時(shí)間。

微生物生長(zhǎng)繁殖是一個(gè)復(fù)雜的過程，其生長(zhǎng)過程存在多種影響因素， 這些因素之間往往存在交互作用， 通過科學(xué)的方法對(duì)特定菌株的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化， 使目標(biāo)產(chǎn)物達(dá)到最大值，不僅能節(jié)省成本，也能進(jìn)一步研究各因素與目標(biāo)產(chǎn)物之間的關(guān)系。 本試驗(yàn)僅對(duì)CICC 20514 地衣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了單因素和正交試驗(yàn)的篩選， 下一步將針對(duì)不同因素之間交互作用影響進(jìn)行深入研究，以優(yōu)化達(dá)到更好的產(chǎn)芽孢條件，為相關(guān)菌劑產(chǎn)品的制作、生產(chǎn)與利用提供理論支撐。

4 結(jié)論

地衣芽孢桿菌CICC 20514 發(fā)酵產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基最優(yōu)搭配組合為20 g/L 果糖、20 g/L 豆粕、7 g/L NaCl、5 g/L K2HPO4、0.8 g/L CaCO3和0.8 g/L MgSO4，在37 ℃，220 r/min，接種量5%，裝樣量20%，發(fā)酵液初始pH 6.5~7.5 條件下，培養(yǎng)48 h，活菌數(shù)可達(dá)7.2×109CFU/mL，芽孢數(shù)達(dá)5.8×109CFU/mL，芽孢率達(dá)80%。 經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)，優(yōu)化后的培養(yǎng)基產(chǎn)芽孢數(shù)及芽孢率均具有良好的的穩(wěn)定性， 能滿足飼用地衣芽孢桿菌制劑的研制需求。