孟 悅， 潘 旭， 張?chǎng)嗡嚕?袁 帥， 劉婷婷，2，3 ， 袁 橙， 劉吉成

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161000；2.齊齊哈爾醫(yī)藥科學(xué)研究所博士后科研工作站，黑龍江齊齊哈爾 161000；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)博士后流動(dòng)站，黑龍江齊齊哈爾 161000）

黃芪（Astragalus membranaceus），屬于豆科植物，具有益氣解毒、強(qiáng)身健體、斂瘡生肌、調(diào)節(jié)新陳代謝等功效（梁子敬等，2018）。目前，黃芪人工種植技術(shù)日益成熟，其產(chǎn)量不斷增加，在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用日趨廣泛（韓戰(zhàn)強(qiáng)等，2022）。 將黃芪作為飼料添加劑能夠改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能， 調(diào)節(jié)免疫功能，提高養(yǎng)殖收益（孫超等，2022）。 黃芪黃酮是黃芪中一類(lèi)重要的化學(xué)成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌和抗血栓作用，在保健食品、制藥行業(yè)和動(dòng)物飼料領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用前景（付佳樂(lè)等，2022；Liu 等，2020）。王永林等（2013）研究表明，黃芪黃酮對(duì)促進(jìn)動(dòng)物免疫性能有積極作用，因此有望作為新型天然免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于畜禽業(yè)生產(chǎn)中。

黃酮類(lèi)化合物難溶于水， 傳統(tǒng)提取溶劑多為甲醇、 乙醇等揮發(fā)性有機(jī)溶劑， 對(duì)環(huán)境存在威脅（陳港等，2021）。 低共熔溶劑（DESs）是一種快速興起的可替代傳統(tǒng)有機(jī)溶劑的新型綠色溶劑，具有低揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性、可設(shè)計(jì)性、低毒性、可生物降解和制備簡(jiǎn)單等突出特點(diǎn)（周立錦等，2020；Xu等，2018；Abbott 等，2003）。DESs 各組分之間不僅可以通過(guò)氫鍵相互連接， 而且還可以與藥材中的活性成分形成氫鍵， 因此可以將多種物質(zhì)溶解出來(lái)，并適用于一些難溶于水的化合物（胡鵬程等，2018）。目前，DESs 已被應(yīng)用于提取中草藥的活性成分，Yin 等（2020）使用DESs 從牛蒡中提取了四種黃酮，其黃酮得率顯著高于甲醇提取。

當(dāng)前， 對(duì)DESs 的研究更多在于開(kāi)發(fā)新的DESs 體系和探索新的應(yīng)用領(lǐng)域。 DESs 在中草藥研究中尚處于初始階段，還存在許多問(wèn)題和制約，其中主要包括DESs 的黏度較高以及一類(lèi)DESs凝固點(diǎn)較高的問(wèn)題（Wang 等，2022）。 而本研究通過(guò)超聲強(qiáng)化技術(shù)不僅增加了黃酮的得率， 超聲機(jī)所產(chǎn)生的機(jī)械熱還可以改善DESs 的高凝固點(diǎn)問(wèn)題。 本研究旨在為高效提取黃芪黃酮及黃芪黃酮飼料添加劑的開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 黃芪中草藥飲片，采購(gòu)自北京同仁堂 （毫州） 飲片有限責(zé)任公司 （批號(hào)：201000098J），經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥物分析教研室鑒定為黃芪（Astragalus membranaceus）的干燥根；毛蕊異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）、刺芒柄花苷標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）、刺芒柄花素標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）、 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）、氯化膽堿（分析純），上海麥克林生化科技有限公司；草酸（分析純）、尿素（分析純）、乳酸（分析純）、丙二酸（分析純）、1，2-丙二醇（分析純）、1，3-丙二醇（分析純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純），天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

1100 型高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技公司；XS105DU 型電子天平， 美國(guó)梅特勒托利多公司；KJ-11030AL 型多頻超聲波清洗儀，深圳市科潔超聲科技有限公司；SHJ-2A 型磁力攪拌水浴鍋，常州金壇良友儀器有限公司；MFJ-W300 型多功能研磨機(jī)， 北京利仁科技股份有限公司；TD6A型離心機(jī)，長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DESs 的制備及篩選 采用加熱攪拌法制備DESs，將氫鍵受體（HBA）與氫鍵供體（HBD）按表1 中的摩爾比混合均勻，在80 ℃下不斷加熱攪拌， 直到形成澄清透明的液體即制備完成。 分別考察表1 中10 種不同的DESs 對(duì)黃芪中五種黃酮得率的影響，同時(shí)使用甲醇提取作為對(duì)照試驗(yàn)。不同組分DESs 的制備及其物理性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 不同組分DESs 的制備及其物理性質(zhì)

1.2.2 超聲輔助DESs 提取黃芪中五種黃酮 黃芪飲片經(jīng)粉碎后過(guò)80 目篩，將黃芪粉末與一定量的DESs 均勻混合于錐形瓶中， 然后在超聲水浴中進(jìn)行提取。 提取液在8000 r/min 的條件下離心10 min，迅速分離上清液和藥渣，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后，注入HPLC，得到色譜圖，將峰面積帶入對(duì)應(yīng)的各標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程中可得出濃度，計(jì)算含量，黃酮得率（Y）計(jì)算公式如下：

式中：C 為供試品溶液的濃度，mg/mL；V 為供試品溶液體積，mL；M 為黃芪粉末的質(zhì)量，g。

1.2.3 黃酮含量測(cè)定方法 使用HPLC 法對(duì)黃芪中五種黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。 HPLC 分析參考梁麗娟等（2010）的方法并進(jìn)一步摸索洗脫條件，該條件可同時(shí)測(cè)定黃芪中五種黃酮的含量。色譜條件：色 譜 柱Agilent Eclipse XDB C18 Column （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%的甲酸水溶液（B）；梯度洗脫條件：0 ~ 15 min，15% A，85% B；15 ~ 25 min，20% A，80% B；25 ~ 40 min，25% A，75% B；40 ~ 55 min，37% A，63% B；55 ~60 min，46% A，54% B。 流速：1 mL/min； 檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.4 單因素試驗(yàn) 選擇超聲溫度分別為20、30、40、50、60 ℃； 超聲時(shí)間分別為20、30、40、50、60 min； 液固比分 別為10：1、15：1、20：1、25：1、30：1（mL/g）；含水量分別為0%、20%、40%、60%、80%； 超聲功率分別為120、240、360、480、600 W進(jìn)行單因素試驗(yàn)。 考察DESs 的超聲溫度、超聲時(shí)間、液固比、含水量、超聲功率對(duì)黃芪中五種黃酮總得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝 根據(jù)（BBD）設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以黃芪中五種黃酮的總得率為響應(yīng)值，選取超聲時(shí)間、超聲溫度、DESs的含水量這三個(gè)因素為變量， 使用Design Expert 13.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件的響應(yīng)面分析法（RSM）進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。 黃芪五種黃酮總得率響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)

響應(yīng)面二次回歸方程為：

式中：Y 為預(yù)測(cè)響應(yīng)值，k 為自變量的數(shù)量，Xi和Xj為編碼的自變量 （i=j），β0為常數(shù)系數(shù)，βi、βii和βij分別為一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)的系數(shù)。1.2.6 數(shù)據(jù)處理 以上試驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行三次。 采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件22.0 版進(jìn)行方差分析。 使用Design Expert 13.0 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析， 對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 DESs 的篩選 Smith 等（2014）將DES 分為四類(lèi)，第一類(lèi)為季銨鹽和金屬鹽，第二類(lèi)為季銨鹽和金屬水合物， 第三類(lèi)為金屬氯化物和有機(jī)化合物，第四類(lèi)為有機(jī)化合物和有機(jī)鹽。由于前三類(lèi)中均添加了金屬離子，不適合在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域的應(yīng)用。 本研究選擇的10 種DESs 均為第四類(lèi)，包括有機(jī)鹽氯化膽堿和有機(jī)化合物天然酸和有機(jī)醇。DESs 具有較強(qiáng)的可設(shè)計(jì)性，DESs 的理化性質(zhì)會(huì)隨HBA 和HBD 類(lèi)型和比例的變化而變化，不同性質(zhì)的溶劑（黏度、電導(dǎo)率和氫鍵作用力）對(duì)化合物的提取效果均不同。 從圖1 可知， 由氯化膽堿-草酸（摩爾比1：2）形成的DESs 對(duì)黃芪黃酮的提取能力最好，五種黃酮的總得率高于其他DESs和甲醇的提取， 這可能是因?yàn)橛刹菟岷吐然憠A組成的DESs 具有較強(qiáng)的氫鍵作用力。 因此，本試驗(yàn)選擇氯化膽堿-草酸（1：2）組成的DESs 作為提取溶劑。

圖1 低共熔溶劑種類(lèi)對(duì)黃芪五種黃酮得率的影響

2.2 黃酮含量測(cè)定 按照1.2.3 中方法， 使用HPLC 對(duì)五種黃酮含量進(jìn)行測(cè)定， 色譜圖見(jiàn)圖2。以各黃酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)（X，mg/mL），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到各標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程和線(xiàn)性范圍，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖2 高效液相色譜圖

表3 五種黃酮的線(xiàn)性回歸結(jié)果

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 超聲溫度對(duì)黃芪黃酮總得率的影響 超聲溫度對(duì)五種黃酮總得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。 在20~40 ℃時(shí)，溫度與黃酮總得率呈正線(xiàn)性關(guān)系。 當(dāng)超聲溫度為40 ℃時(shí)，黃酮總得率達(dá)到1.62 mg/g。 但當(dāng)超聲溫度超過(guò)40 ℃時(shí)，黃酮總得率隨著溫度的升高而降低。 溫度的升高有利于降低黃酮與其所在位置之間的物理吸附和相互作用， 游離的黃酮在氫鍵的作用下與DESs 結(jié)合 （Guo 等，2021）。DESs 的黏度隨溫度的升高而降低， 促進(jìn)了傳質(zhì)，提高了溶劑的擴(kuò)散速率，從而提高了提取率（Adetunji 等，2017）。 然而，如果溫度過(guò)高，黃酮可能會(huì)發(fā)生降解，導(dǎo)致總得率降低。 因此，提取黃芪中五種黃酮的最佳超聲溫度為40 ℃。

圖3 超聲溫度對(duì)黃芪黃酮總得率的影響

2.3.2 超聲時(shí)間對(duì)黃芪黃酮總得率的影響 不同超聲時(shí)間對(duì)黃芪黃酮總得率的影響如圖4 所示，在20 ~ 40 min 時(shí)， 總黃酮的得率隨著超聲時(shí)間的增加而增加。 但是超過(guò)40 min 后，總黃酮的得率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。這可能是因?yàn)?，在早期階段， 黃酮類(lèi)化合物會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸滲透到DESs 中，使得率不斷增加。 經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，反應(yīng)體系達(dá)到平衡，如果繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間，總黃酮的得率不會(huì)顯著增加。 相反，長(zhǎng)時(shí)間的超聲輻射還可能會(huì)降解一些黃酮類(lèi)化合物，導(dǎo)致總得率下降。 這與王君等（2022）提取菊花中總黃酮的趨勢(shì)一致。五種黃酮的總得率在40 min 時(shí)達(dá)到最大值1.64 mg/g，因此本試驗(yàn)選擇40 min 作為提取條件。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)黃芪黃酮總得率的影響

2.3.3 液固比對(duì)黃芪黃酮總得率的影響 如圖5所示，黃酮的得率與液量呈正線(xiàn)性關(guān)系。當(dāng)液固比達(dá)到25 mL/g 時(shí)， 繼續(xù)增加液體比例至30 mL/g，黃酮總得率沒(méi)有顯著增加（P > 0.05）。 增加溶劑量，可使提取溶劑更充分的與植物細(xì)胞接觸，有利于黃芪類(lèi)黃酮化合物的擴(kuò)散與溶出， 從而提高總黃酮的得率。 溶劑量不足可能會(huì)導(dǎo)致DESs 體系快速飽和，限制提取。但是液量過(guò)多不僅會(huì)導(dǎo)致浪費(fèi)以及后續(xù)分離純化的困難還會(huì)增加其他雜質(zhì)的溶出（隋志方等，2022）。綜合考慮成本因素和黃酮的得率，選擇液固比為25 mL/g 作為提取條件。

圖5 液固比對(duì)黃芪黃酮總得率的影響

2.3.4 含水量對(duì)黃芪黃酮總得率的影響 含水量對(duì)黃芪中五種黃酮得率的影響見(jiàn)圖6， 隨著含水量的增加， 黃酮總得率呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)。 在含水量為60%時(shí)， 黃酮總得率達(dá)到最大值1.66 mg/g。 這可能是因?yàn)橄駾ESs 體系中加入一定量的水可以降低溶劑的黏度，增加傳質(zhì)量，提高提取效率。 但是過(guò)量的水會(huì)破壞DESs 的超分子結(jié)構(gòu)，削弱DESs 和目標(biāo)化合物之間的相互作用， 導(dǎo)致DESs 的提取能力下降（Dai 等，2015）。 含水量是影響DESs 提取目標(biāo)化合物的關(guān)鍵因素， 因此要嚴(yán)格控制水的添加量，本試驗(yàn)將含水量60%作為后續(xù)研究參數(shù)。

圖6 含水量對(duì)黃芪黃酮總得率的影響

2.3.5 超聲功率對(duì)黃芪黃酮總得率的影響 超聲功率對(duì)黃芪中五種黃酮得率的影響如圖7 所示，五種黃酮的得率與超聲功率呈正線(xiàn)性關(guān)系， 且超聲功率為480 W 和600 W 時(shí)，總黃酮的得率沒(méi)有顯著性差異（P > 0.05）。 超聲輻射可通過(guò)空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)等破壞植物細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，促進(jìn)溶劑穿透植物細(xì)胞，或細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)成分?jǐn)U散出細(xì)胞（Jha 等，2021）。 因此，超聲輔助DESs 提取黃芪中的類(lèi)黃酮化合物可以顯著提高黃酮的得率。 但是過(guò)度超聲可能會(huì)破壞黃酮類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)，因此本試驗(yàn)選擇超聲功率480 W 作為試驗(yàn)條件。

圖7 超聲功率對(duì)黃芪黃酮總得率的影響

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析 以五種黃芪黃酮的總得率為響應(yīng)值， 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取對(duì)總得率影響顯著的三個(gè)因素（超聲時(shí)間、超聲溫度和含水量）， 進(jìn)行三因素三水平分析試驗(yàn)。BBD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表4，方差分析見(jiàn)表5。

表4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及黃芪中五種黃酮總得率

表5 響應(yīng)面擬合回歸方程的方差分析結(jié)果

將表4 的數(shù)據(jù)用Design-Expert 13.0 軟件進(jìn)行二次多元線(xiàn)性回歸方程擬合， 可得到黃芪中五種黃酮總得率響應(yīng)面模型的二次多元線(xiàn)性回歸方程為：Y=0.691+1.08×10-2A+2.38×10-2B+9.3×10-3C+5×10-5AB+2.5×10-5AC-5×10-5BC-1.6×10-4A2-2.6×10-4B2-7.7×10-5C2。

從表5 中的P 值可以看出，各種因素對(duì)五種黃芪黃酮總得率的影響是不同的。 該模型F 值為28.56（P < 0.01），說(shuō)明該模型極顯著且方案可行。決定系數(shù)R2=0.9735，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9394，說(shuō)明此模型方程能具有較好的反應(yīng)響應(yīng)值。此外，一次項(xiàng)（A、B 和C）和二次項(xiàng)（A2、B2和C2）被認(rèn)為對(duì)黃酮總得率有極顯著的影響（P < 0.01），交互項(xiàng)BC 被認(rèn)為對(duì)黃酮總得率有顯著的影響 （P <0.05）?；貧w方程各項(xiàng)方差分析中的F 值可以判斷自變量對(duì)因變量的影響， 由此得到各因素對(duì)五種黃酮總得率影響的主次順序?yàn)锽=C＞A，即超聲溫度和DESs 的含水量對(duì)黃酮總得率的影響一致，其次是超聲時(shí)間。

2.4.2 各因素交互作用分析 為了研究這三個(gè)參數(shù)及其相互作用對(duì)黃芪中五種黃酮總得率的影響， 分別將黃酮的總得率與兩個(gè)試驗(yàn)變量進(jìn)行比較，另一變量固定在零水平，依次來(lái)考察交互作用對(duì)黃酮總得率的影響。 各影響因素的交互作用對(duì)五種黃酮總得率的影響如圖8 所示。

圖8 各影響因素的交互作用對(duì)五種黃酮總得率的影響結(jié)果

圖8a 描述了將DESs 的含水量固定在零水平時(shí)， 超聲時(shí)間和超聲溫度對(duì)黃酮總得率的交互作用。隨著超聲時(shí)間和超聲溫度的增加，黃酮總得率顯著增加， 而隨著超聲時(shí)間和超聲溫度的進(jìn)一步增加，總得率呈降低趨勢(shì)，與羅蓉等（2022）的研究結(jié)果一致。 固定超聲溫度為零水平的含水量與超聲時(shí)間相互作用的三維響應(yīng)面如圖8b 所示。含水量的增加可增強(qiáng)溶液體系中氫鍵的相互作用，但是含水量超過(guò)某個(gè)值后， 可能會(huì)得到不含DESs的水溶液，導(dǎo)致總得率下降，這與Cui 等（2018）的研究結(jié)果一致。圖8c 表示在固定超聲時(shí)間條件下的含水量和超聲溫度的相互作用的響應(yīng)面結(jié)果，從圖8c 可以看出該響應(yīng)面坡度非常陡峭。通常響應(yīng)面坡度越陡峭， 表明該響應(yīng)值對(duì)于條件的改變?cè)矫舾?，該因素?duì)黃酮總得率的影響就越大；反之坡度越平緩則表明該因素對(duì)總得率的影響越?。◤埿惴业龋?022）。 此外，橢圓形的等高線(xiàn)越密集代表這兩個(gè)因素之間的交互作用越強(qiáng)（閆旭宇等，2021）， 比較該等高線(xiàn)圖可以發(fā)現(xiàn)， 超聲溫度和DESs 含水量之間的等高線(xiàn)最密集，也就是說(shuō)這兩個(gè)因素之間的交互作用對(duì)五種黃酮的總得率的影響最為顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)Design-Expert 13.0 軟件對(duì)回歸擬合方程進(jìn)行分析，得出最優(yōu)提取條件為：超聲時(shí)間42.80 min， 超聲溫度43.63 ℃， 含水量54.50%。 考慮到實(shí)際操作的可行性，將以上條件調(diào)整為超聲時(shí)間43 min，超聲溫度44 ℃，含水量54%。并在上述條件下進(jìn)行了三次驗(yàn)證試驗(yàn)，總黃酮的平均得率為1.70 mg/g， 接近理論值1.71 mg/g，相對(duì)誤差為0.58%，證明優(yōu)化結(jié)果可靠。

3 討論與結(jié)論

與傳統(tǒng)提取溶劑甲醇相比， 本方法使用的低共熔溶劑具有不揮發(fā)、綠色安全等諸多優(yōu)點(diǎn)。但同時(shí)研究者們也發(fā)現(xiàn)DESs 具有黏度高的特性，與植物組分僅通過(guò)浸泡等方式難以均勻高效的傳質(zhì)， 因此需要一些物理強(qiáng)化方式以及向其中加入一定量的水來(lái)降低黏度。 此外，隨著更多的DESs體系被發(fā)現(xiàn)，其優(yōu)點(diǎn)與局限性也進(jìn)一步被放大。本研究所選用的氯化膽堿與草酸形成的低共熔溶劑具有凝固點(diǎn)高的特性， 雖然其提取率高于其他溶劑，但是此溶劑具有在室溫下操作困難的缺點(diǎn)。本研究在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)， 超聲提取所產(chǎn)生的機(jī)械熱效應(yīng)可以顯著改善低共熔溶劑這一特性， 為這一類(lèi)低共熔溶劑在中草藥成分提取領(lǐng)域的局限性提供了解決思路。

本研究使用超聲強(qiáng)化技術(shù)輔助低共熔溶劑提取黃芪中的五種黃酮類(lèi)化合物， 以五種黃酮的總得率為指標(biāo)， 從10 種DESs 中篩選出了氯化膽堿-草酸（1：2）為最佳提取溶劑。 通過(guò)單因素試驗(yàn)考察了超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比、含水量和超聲功率對(duì)這五種黃酮總得率的影響， 并使用響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。 優(yōu)化后的最佳提取條件為：超聲時(shí)間43 min，超聲溫度44 ℃，含水量54%。此時(shí)，黃酮的得率可達(dá)到1.70 mg/g，得率高于傳統(tǒng)的甲醇提取法。 表明試驗(yàn)工藝具有可行性和合理性，可以為開(kāi)發(fā)黃芪資源提供參考。