張誓育， 李 詠， 朱 潤， 吳銀寶， 米見對

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東廣州 510642）

腸道微生物在新陳代謝和免疫耐受等眾多生理過程中與宿主互利共生， 良好的菌群結(jié)構(gòu)有益于宿主的腸道健康（支海美等，2022）。腸道菌群也是參與生物體營養(yǎng)代謝的重要成員， 一些本地優(yōu)良品種的豬具有與其他豬種不同的腸道微生物菌群，對其進行糞菌移植后發(fā)現(xiàn)，其他豬種的豬也擁有了本地豬種的優(yōu)良性能（Xiang 等，2020）。 腸道菌群也參與腸道形態(tài)的構(gòu)建， 試驗證明有一些菌種可以提高豬結(jié)腸緊密連接蛋白ZO-1 等的表達水平，保護腸道屏障、緩解炎癥（Hu 等，2017）。 而畜禽養(yǎng)殖業(yè)中大量使用抗生素（丁擷瑛，2019），不僅會使動物體內(nèi)的殘留抗生素隨糞便排出體外，影響食品安全、污染環(huán)境（張金飛，2017），而且會破壞動物腸道微生態(tài)平衡，誘發(fā)疫?。ㄒπ履甑龋?019；胡秀香，2016）。促生長類抗生素在我國已被禁用，“無抗養(yǎng)殖”成為未來生豬養(yǎng)殖的發(fā)展趨勢，因此，我們迫切需要尋找替代抗生素的產(chǎn)品。益生菌可以調(diào)控腸道微生態(tài)平衡、 維護腸道及宿主健康，是一種潛在的“抗生素替代品”。

乳桿菌屬中一些菌株是公認安全的益生菌（GRAS），具有制成益生菌制劑的前景。 腸道內(nèi)乳桿菌的增加可降低腸道pH，并能產(chǎn)生抑制有害菌群生長的抗菌物質(zhì)，有效抑制有害菌的繁殖（徐文佳，2022；張國華等，2013）。 乳桿菌還能提高動物自身免疫能力，多角度發(fā)揮作用抵御病原體入侵。因此， 乳桿菌在益生菌的研究和生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用（雷虹等，2017）。 研究表明，同源性乳桿菌對宿主的益生作用優(yōu)于異源性菌群， 即理想的菌株應(yīng)該來自同種動物的消化道 （Timmerman 等，2006），因此，分離豬源乳桿菌更有利于今后在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用（Gardiner 等，2004；Scheppler 等，2002）。

故本研究從健康無抗飼喂的成年豬糞中分離出乳桿菌，進行16S rRNA 菌株鑒定，并檢測其能否耐受胃部環(huán)境，綜合其生長性能、抗逆性能、耐藥性等多個方面的表現(xiàn)， 為實際生產(chǎn)中益生菌劑的開發(fā)提供后備菌株。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基及試劑配制 MRS 培養(yǎng)基： 蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，磷酸鉀2 g/L，檸檬酸二銨2 g/L，乙酸鈉5 g/L，葡萄糖20 g/L，吐溫80 g/L，七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O） 0.58 g/L，四水硫酸錳（MnSO4·4H2O）0.25 g/L，pH 5.5。

人工模擬的豬胃消化液及其制備方法： 將豬配合飼料和人工胃液按1 g：3 mL 的配比混合，調(diào)pH 至1.5 ~ 2.0，39 ℃振蕩1 ~ 2 h， 冷卻至4 ℃，8000 ~ 9000×g、4 ℃離心5 ~ 10 min，取上清液為人工模擬豬胃消化液。

人工胃液購自上海源葉生物科技有限公司。菌株生理生化鑒定管均購自海博生物技術(shù)有限公司和北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。

1.2 菌株的分離與鑒定 采取廣州某豬場未使用抗生素和未曾腹瀉的成年豬糞， 密封于無菌采樣袋后4 ℃下帶回實驗室進行菌株分離。 用無菌鑷子取1 g 豬糞， 加入PBS 稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7， 取10-4、10-5、10-6、10-7這四個濃度梯度涂布平板，每個濃度梯度3 個重復(fù)。置于37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。對長出的菌落進行反復(fù)劃線培養(yǎng)，獲得單一菌落。

挑取白色疑似乳桿菌的單個菌落， 接種至MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。 選用細菌基因組DNA 提取試劑盒 （Omega Bio-Tek，美國），采用細菌16S rRNA 通用引物：上游27F（5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'）；下 游 1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'） ， 引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

PCR 反應(yīng)體系 （25 μL）：2×Taq plus Buffer 12.5 μL，2 μL 模板DNA，上游、下游引物各1 μL，ddH20 8.5 μL。以ddH2O 作為陰性對照。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35 次，72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，有合格條帶后進行測序， 測序由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

將挑出的菌落接種至MRS 肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h， 取60 μL 培養(yǎng)后的肉湯滴于載玻片上。烘干后，依次加入結(jié)晶紫染色液染色1 min，再用革蘭氏碘液染色1 min，丙酮乙醇混合液（丙酮：95%乙醇= 3：7）脫色30 s，最后經(jīng)過沙黃染色液復(fù)染1 min， 在光學(xué)顯微鏡下觀察 （黃建江等，2021）。參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》《伯杰氏細菌鑒定手冊》第八版及《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對上述菌株進行生理生化性質(zhì)的鑒定。

1.3 菌株生長曲線的測定 分別取對數(shù)生長期菌液按2.0%的接種量接種于MRS 肉湯培養(yǎng)基中。 放入培養(yǎng)箱37 ℃靜置培養(yǎng)，每0.5 h 取樣測定四株乳桿菌吸光度（OD600），重復(fù)5 次取平均值繪制生長曲線。

1.4 測定菌株在模擬胃環(huán)境下的存活率 取對數(shù)生長期的四種乳桿菌， 以2%的接種量加入到人工模擬的豬胃液中，39 ℃培養(yǎng)4 h。在結(jié)束后分別取樣1 mL，傾注法涂板計數(shù)，計算存活率，由此判斷菌株能否通過胃環(huán)境進入受體腸道。

1.5 測定菌株耐酸性能 取對數(shù)生長期的四種乳桿菌，每株菌取兩組各4 mL，離心（10000 r/min，5 min），棄上清，加入等量無菌水，無菌水分別調(diào)節(jié)pH 至2.5 和7.0，37 ℃培養(yǎng)2 h，按4%接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20 h 后測定吸光度（OD600）。

1.6 測定菌株耐膽鹽性能 與1.5 菌株耐酸性能測試的處理相同， 將添加的無菌水替換為無菌的0.1%、0.3%、0.5%膽鹽溶液，操作同上，測定吸光度（OD600）。

1.7 測定菌株耐高溫性能 取對數(shù)生長期的四種乳桿菌，以2%的接種量加入到MRS 肉湯培養(yǎng)基中，分別放置于50、80 ℃培養(yǎng)。 在0、30、60 min時分別取樣1 mL，傾注法涂板計數(shù)，計算存活率，由此判斷菌株耐熱性能。 計算公式如下：

存活率/%=（高溫處理后的培養(yǎng)基活菌數(shù)/未高溫處理的培養(yǎng)基活菌數(shù)）×100。

1.8 測定菌株的耐藥性 制備氨芐青霉素濃度為32 μ/mL 的MRS 肉湯培養(yǎng)基Ⅰ、硫酸卡那霉素濃度為64 μg/mL 的MRS 肉湯培養(yǎng)基Ⅱ、鏈霉素濃度為16 μg/mL 的MRS 肉湯培養(yǎng)基Ⅲ、強力霉素濃度為16 μg/mL 的MRS 肉湯培養(yǎng)基Ⅳ各100 mL。 分別取對數(shù)生長期菌液按2.0%的接種量接種于上述四種MRS 肉湯培養(yǎng)基中。 放入培養(yǎng)箱37 ℃靜置培養(yǎng)， 每0.5 h 取樣測定四株乳桿菌吸光度（OD600），重復(fù)5 次取平均值，繪制生長曲線。

1.9 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，對每組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布則采用單因素方差分析 （One-Way ANOVA），方差齊則采用LSD 檢驗，若方差不齊則采用Games-Howell（A）檢驗；以P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P ＜0.01 為極顯著差異，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標準誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定 本試驗從未腹瀉且未用抗生素的成年豬直腸內(nèi)容物中分離純化菌株，繼而進行革蘭氏染色， 得到革蘭氏陽性的4 個菌株，分別命名為SYgz1119，KNgz0128，HYgz0212，ZLgz1227，將這四株乳桿菌與參考菌株進行比對，繪制出進化樹。 如圖1 所示， 結(jié)果顯示菌株SYgz1119 歸屬于敏捷乳桿菌 （Lactobacillus agilis）；KNgz0128 歸屬于香 腸乳桿菌（Lactobacillus farciminis）； 菌株HYgz0212 歸屬于嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）； 菌株ZLgz1227 歸屬于約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）。

圖1 菌株序列的進化樹分析

對這四株菌進行生理生化特性的鑒定。 所用生化鑒定管有硝酸鹽還原生化管、 纖維二糖生化管、果糖生化管、半乳糖生化管、乳糖生化管、葡萄糖生化管、麥芽糖生化管等31 種生化管，結(jié)果如表1 所示。 生理生化管的結(jié)果驗證了16S rRNA的結(jié)果，分離出的四種菌分別歸屬于Lactobacillus agilis；Lactobacillus farciminis；Lactobacillus acidophilus；Lactobacillus johnsonii。

表1 四株菌的生理生化特性

2.2 菌株的生長曲線 如圖2 所示，ZLgz1227 在0 ~ 10 h 總體生長迅速，2 h 后進入對數(shù)生長期，12 h 后進入平臺期。 KNgz0128 在0 ~ 10 h 總體生長迅速，2 h 后進入對數(shù)生長期，12 h 后進入平臺期。 HYgz0212 在0 ~ 20 h 總體生長較為迅速，4 h 后進入對數(shù)生長期，20 h 后進入平臺期。SYgz1119 在0 ~ 8 h 總體生長迅速，1 h 后進入對數(shù)生長期，8 h 后進入平臺期。 這四株菌生長趨勢接近，生長最迅速的是SYgz1119，最快到達對數(shù)生長期和平臺期。

圖2 四株菌的生長曲線

2.3 菌株在模擬胃環(huán)境下的存活率 豬胃的pH在0.9~1.5，強酸性環(huán)境可能會破壞菌株的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致活菌數(shù)大幅降低，影響其在胃腸道發(fā)揮作用。由圖3 可知，ZLgz1227 在模擬胃環(huán)境下4 h后存活率為132.29%；KNgz0128 在模擬胃環(huán)境4 h后存活率為21.73%；HYgz0212 在模擬胃環(huán)境4 h后存活率為127.31%；SYgz1119 模擬胃環(huán)境4 h 后存活率為87.99%。 ZLgz1227、HYgz0212、SYgz1119都有較好的過胃能力， 不會被胃液破壞，而KNgz0128 存活率較低，說明其很可能會在胃環(huán)境內(nèi)被破壞， 難以在腸道內(nèi)定植發(fā)揮作用。 其中ZLgz1227 的存活率最高， 分別比KZgz0128、SYgz1119、HYgz0212 高出110.56、44.3、4.98 個百分點，擁有最強的過胃能力。

圖3 四株菌的過胃存活率

2.4 菌株耐酸耐膽鹽性能 在培養(yǎng)20 h 后，測量、記錄吸光度（OD600），將吸光度統(tǒng)一調(diào)至1.5。在接入不同培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h 后記錄吸光度（OD600），并對各株菌的數(shù)值進行差異顯著性分析。 由表2數(shù)據(jù)可知， 這四株菌在pH 2.5 時都能較為正常的生 存， 吸 光 度 均 在1.4 以 上；KNgz0128 和HYgz0212 都對0.1%的膽鹽不耐受，ZLgz1227 和SYgz1119 能在0.1%的膽鹽濃度下正常生長；膽鹽濃度為0.3%時，KNgz0128 和HYgz0212 都無法正常 生 長， 吸 光 度 都 在0.4 以 下，ZLgz1119 和SYgz1119 表現(xiàn)出較好的適應(yīng)能力；0.5%的膽鹽濃度下， 僅有ZLgz1227 表現(xiàn)出較好的適應(yīng)能力，HYgz0212、KNgz0128、SYgz1119 均不能正常生長。

表2 4 株四株菌的耐酸耐膽鹽性能

2.5 菌株耐高溫性 在80 ℃和50 ℃這兩種不同溫度環(huán)境下培養(yǎng)四株菌，在80 ℃培養(yǎng)時，四種菌株都難以存活，培養(yǎng)30 min 后稀釋涂板，存活率均低于1‰，培養(yǎng)60 min 后稀釋涂板，未有活菌長出， 由此可見這四株菌均不耐80 ℃的高溫。在實際應(yīng)用時需要避免過高的溫度防止菌株失活。如圖4 所示，在50 ℃培養(yǎng)時四株菌均能存活，存活率相差較大：ZLgz1227 在50 ℃處理30 min后能有65.78%的存活率，在50 ℃處理60 min 后有77.11%的存活率，存活率高于處理30 min 時，這可能是有一些單菌被馴化后能夠適應(yīng)50 ℃的高溫， 存活甚至繁殖。 KNgz0128 與ZLgz1227 類似，50 ℃處理30、60 min 后存活率分別為5.31%和10.41%， 提示這兩株菌可能有耐高溫的潛力。SYgz1119 在50 ℃處理30 min 后存活率高達185.47%，這說明這段時間SYgz1119 進行了增殖，而在50 ℃處理60 min 后，存活率降至175.51%，這表明該乳桿菌可能能夠忍受短時間的50 ℃高溫， 長期暴露于這樣的溫度下仍舊會影響其生存繁殖。HYgz0212 與之類似，50 ℃處理30 min 后存活率達147.48%，而在50 ℃處理60 min 后，存活率降至109.22%。

圖4 四株菌的耐高溫性能（50 ℃）

2.6 菌株耐藥性 對分離出的四株乳桿菌進行耐藥性檢測， 選用了現(xiàn)階段畜牧養(yǎng)殖業(yè)常用的幾種抗生素：氨芐西林、卡那霉素、鏈霉素、強力霉素，他們分別屬于β-內(nèi)酰胺類，氨基糖苷類（卡那霉素、鏈霉素），四環(huán)素類抗生素。 由圖5 可知，這四株菌中，ZLgz1227 對氨芐西林耐藥性最弱，吸光度維持在0.82， 幾乎無法在氨芐西林脅迫下生存，而HYgz0212 對氨芐西林耐藥性較強，吸光度達到了1.7；SYgz1119 對卡那霉素、鏈霉素、強力霉素的耐藥性略強于其他三株菌， 吸光度基本都達到了3.0。 這四株菌普遍不耐氨芐西林，對卡那霉素、鏈霉素、強力霉素都有一定的耐藥性。

圖5 四株菌對幾種常用抗生素的耐藥性

3 討論

這四株菌都能發(fā)酵部分糖類， 生理生化特性相近。 SYgz1119 是這四株菌中生長最快的菌，最快到達平臺期。 耐酸耐膽鹽的能力關(guān)系到菌株過胃的能力， 影響之后在動物體內(nèi)的定植成功率（Mu 等，2018），故而這項指標亦有較高的參考價值。菌株如果被胃酸分解破壞就無法發(fā)揮其作用，所以本試驗進行了體外過胃模擬試驗， 結(jié)果顯示在模擬胃液處理4 h 后， 四株菌都能存活，除KNgz0128 之外的三株菌都生長良好，說明后續(xù)在實際應(yīng)用時這些菌株均能通過胃部， 進入豬的腸道發(fā)揮作用。 膽鹽耐受性是益生菌能發(fā)揮作用的必要條件之一， 四株菌株對0.1%的膽鹽耐受，對0.3%的膽鹽有一定的耐受性，對0.5%的膽鹽不耐受。 而正常動物小腸中的膽鹽濃度為0.03% ~0.3%（戴青等，2008）， 這說明這四株菌都有制作成豬益生菌產(chǎn)品的潛力。

已有研究表明，嗜熱鏈球菌、鼠李糖乳桿菌和動物雙歧桿菌含有三重耐藥基因 （梁媛媛等，2022），本研究中HYgz0212 對氨芐西林有較強的耐藥性，對卡那霉素、鏈霉素、強力霉素都有較強的耐藥性， 實際運用后可能會帶來抗生素抗性基因的傳播風(fēng)險。SYgz1119 對卡那霉素、鏈霉素、強力霉素的耐藥性略強于其他三株菌， 也有較高的抗生素抗性基因傳播風(fēng)險。 在實際生產(chǎn)時也要考慮到耐藥菌帶來的危險，嚴格控制劑量。

在50 ℃處理30、60 min 后四株菌均有較高的存活率， 說明這四株乳桿菌能接受50 ℃的高溫，而溫度升高至80 ℃時，四種菌株很快就全部死亡，說明這些菌不耐高溫，在后續(xù)應(yīng)用時，如果需要對菌株進行加工制成菌劑， 要控制好溫度以免破壞菌株活性。

在尋找能夠替代抗生素的優(yōu)良菌株， 乳桿菌作為早就被批準添加的益生菌成功進入了人們的視線（李國建，2022），國內(nèi)外有很多分離豬源乳桿菌的研究，約氏乳桿菌、加氏乳桿菌、植物乳桿菌、短乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等（吳雨晗等，2022；曹海鵬，2021）， 這說明乳桿菌是廣泛分布在豬消化道中的。已有研究在人類身上證實，某些乳桿菌可以幫助重建腸道微生物生態(tài)平衡， 恢復(fù)患者胃腸功能（鐘碧瑩，2022），這提示外源添加從健康、抗逆性強的豬消化道中分離出的乳桿菌， 可能起到調(diào)節(jié)受體消化道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)的作用， 有針對性的糞菌移植可以用于預(yù)防腸道疾病，修護腸道屏障，降低使用抗生素帶來的危害。

4 結(jié)論

本試驗從健康、未腹瀉、未使用抗生素的成年豬 直 腸 中 分 離 出 SYgz1119、KNgz0128、HYgz0212、ZLgz1227 這四株菌， 分別歸屬于Lactobacillus agilis；Lactobacillus farciminis；Lactobacillus acidophilus；Lactobacillus johnsonii。 綜合各項指標的檢測結(jié)果，ZLgz1227 有更優(yōu)的性能，實際生產(chǎn)中可以考慮對其加以利用。