朱茉莉，李怡霏，李珍珍，趙海燕，劉艷華，邱 月，萬光瑞，李 鵬

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種由于動(dòng)脈壁周圍脂質(zhì)堆積而導(dǎo)致動(dòng)脈壁增厚硬化、血管腔狹窄的病理狀態(tài),是多種心腦血管疾病的主要病因。動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷是AS的一種初始病理現(xiàn)象[1-4]。鈉氫交換蛋白1(sodium/hydrogen exchanger 1,NHE1)是一類存在于細(xì)胞膜表面的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,通過將細(xì)胞內(nèi)H+與細(xì)胞外Na+按照11的比例進(jìn)行交換來維持細(xì)胞內(nèi)酸堿平衡[5-6]。有研究表明,巨噬細(xì)胞中NHE1的活化會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡,進(jìn)而導(dǎo)致AS或其他心血管疾病的發(fā)生[7]。維生素B6(vitamin B6,VB6)可通過轉(zhuǎn)化為其活化形式磷酸吡哆醛來減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)改變[8-9]。但NHE1在VB6改善AS血管內(nèi)皮損傷中的作用尚不清楚?；诖?本研究通過建立AS模型來探討NHE1在VB6改善載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E gene knockout,ApoE-/-)小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞功能中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ApoE-/-小鼠36只,6～8周齡,購自北京Huafukang動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(雌雄各占50%)。小鼠飼養(yǎng)于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院無特定病原體級(jí)動(dòng)物房,溫度(23±1) ℃,濕度40%～60%,12 h光暗循環(huán),小鼠可自由獲取食物和水。

1.2 主要藥物、試劑與儀器

NHE1抑制劑LiCl、VB6、乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)、硝普鈉(sodium nitroprusside,SNP)購自美國Sigma Chemical Co公司;NHE1一抗購自美國Santa Cruz公司,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、一氧化氮(nitric oxide,NO)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;K-3型酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司,SMZ-800N體式顯微鏡購自日本Nikon公司,組織包埋機(jī)、RM-2125-RTS超聲振動(dòng)切片機(jī)購自德國Leica公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組、模型建立及各組干預(yù)措施

36只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為對照組、AS組、VB6組、AS+LiCl組、AS+VB6組和AS+VB6+LiCl組,每組6只。AS組、AS+LiCl組、AS+VB6組和AS+VB6+LiCl組小鼠給予高脂飲食(質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.15% 膽固醇和21.00%脂肪)12周建立AS模型;對照組和VB6組小鼠常規(guī)飲食、正常飲水12周。12周后,對照組小鼠常規(guī)飲食,每日給予與VB6組等體積的生理鹽水灌胃;VB6組小鼠常規(guī)飲食,每日灌胃給予VB6(50 mg·kg-1);AS+LiCl組小鼠繼續(xù)給予高脂飲食,每日灌胃給予LiCl(1 mg·kg-1);AS+VB6組小鼠繼續(xù)給予高脂飲食,每日灌胃給予VB6(50 mg·kg-1);AS+VB6+LiCl組小鼠繼續(xù)給予高脂飲食,每日灌胃給予VB6(50 mg·kg-1)和LiCl(1 mg·kg-1);6組小鼠均干預(yù)4周。

1.3.2 血清中MDA、NO水平和SOD活性檢測

給藥結(jié)束后,小鼠禁食禁水12 h,腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg·kg-1)麻醉大鼠。摘除眼球,采血1 mL 于抗凝管中,低溫離心機(jī)4 000 r·min-1離心10 min,取血清,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒測定血清中NO、MDA水平和SOD活性,其中血清中NO水平檢測采用微板法,血清中MDA水平檢測采用硫代巴比妥酸法,血清中SOD活性檢測采用水溶性四氮唑-8法,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.3 胸主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)觀察

眼球取血后切開小鼠胸腔,分離胸主動(dòng)脈。取部分胸主動(dòng)脈組織于40 g·L-1多聚甲醛溶液中固定16 h,體積分?jǐn)?shù)70%乙醇浸泡 2 min,油紅O染色30 min,體積分?jǐn)?shù)70%乙醇漂洗組織至發(fā)白,體式顯微鏡拍照觀察染色結(jié)果。另取胸主動(dòng)脈組織進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和包埋等制備成石蠟切片,蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色后,使用連接QImaging Retiga CCD相機(jī)的顯微鏡觀察胸主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)并拍照。采用Image J軟件的IHC Profiler[10]插件處理圖片,并計(jì)算AS斑塊面積占血管總面積的百分比(每組血管斑塊所占面積/血管總面積×100%)。

1.3.4 離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)檢測胸主動(dòng)脈對Ach或SNP的舒張反應(yīng)

將胸主動(dòng)脈切成環(huán)狀(長3～4 mm),懸掛并固定在灌注pH值7.4 Krebs緩沖液的器官室中。緩沖液通入體積分?jǐn)?shù)95% O2和5% CO2,加入去氧腎上腺素(1 μmol·L-1)誘發(fā)胸主動(dòng)脈的收縮反應(yīng)。收縮前,給胸主動(dòng)脈環(huán)施加2.0～6.0 g張力 90 min。在此期間,每15 min更換1次Krebs緩沖液,共3次;將胸主動(dòng)脈環(huán)置于60 mmol·L-1KCl溶液中 30 min,然后用1 μmol·L-1去氧腎上腺素收縮血管環(huán),待收縮反應(yīng)達(dá)坪值后,再依濃度梯度加入Ach(0.003、0.030、0.300、3.000 μmol·L-1)或SNP(0.003、0.030、0.300 μmol·L-1),觀察血管環(huán)張力的變化,以藥物誘發(fā)血管舒張幅度與最大收縮幅度的比值作為血管舒張率[11]。

1.3.5 免疫組織化學(xué)法檢測胸主動(dòng)脈中NHE1蛋白的表達(dá)

將胸主動(dòng)脈石蠟切片脫蠟,用0.1 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液(pH=6.0)進(jìn)行熱修復(fù)(92～98 ℃,30 min),體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫室溫孵育5～10 min,體積分?jǐn)?shù)3%牛血清白蛋白封閉20 min,加NHE1一抗(滴度為1100),4 ℃過夜孵育。第2天用磷酸緩沖鹽溶液洗3 次,每次5 min,與相應(yīng)二抗在 37 ℃溫箱中孵育1 h, 3,3′-二氨基聯(lián)苯胺顯色,蘇木精復(fù)染,脫水,透明,封片。使用連接QImaging Retiga CCD相機(jī)的顯微鏡觀察切片中NHE1蛋白的表達(dá)并拍照(棕色部分為NHE1蛋白表達(dá))。采用Image J軟件的IHC Profiler[11]插件處理圖片,計(jì)算NHE1蛋白表達(dá)量百分比,NHE1蛋白表達(dá)量百分比=NHE1蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞的平均灰度值(染色強(qiáng)度)/陽性面積(染色面積)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 6組小鼠血清中NO、MDA水平和SOD活性比較

與對照組相比,AS組小鼠血清中NO水平和SOD活性顯著下降,MDA水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);VB6組與對照組小鼠血清中NO、MDA水平和SOD活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與AS組相比,AS+VB6組小鼠血清中NO水平和SOD活性顯著上升,MDA水平顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);AS+LiCl組、AS+VB6+LiCl組與AS組小鼠血清中NO、MDA水平和SOD活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與AS+VB6組相比, AS+VB6+LiCl組小鼠血清中NO水平和SOD活性顯著下降,MDA水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 6組小鼠血清中NO、MDA水平及SOD活性比較Tab.1 Comparison of serum NO,MDA levels and SOD activity of mice among the six groups

2.2 6組小鼠AS斑塊面積占血管總面積的百分比比較

6組小鼠AS斑塊情況見圖1。對照組、AS組、VB6組、AS+LiCl組、AS+VB6組和AS+VB6+LiCl組小鼠AS斑塊面積占血管總面積的百分比分別為(1.70±0.60)%、(37.55±4.25)%、(1.55±0.39)%、(37.71±5.32)%、(15.41±5.32)%、(35.45±4.63)%。AS組小鼠AS斑塊面積占血管總面積的百分比顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);VB6組與對照組小鼠AS斑塊面積占血管總面積的百分比比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AS+VB6組小鼠斑塊面積占血管總面積的百分比顯著低于AS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);AS+LiCl組、AS+VB6+LiCl組與AS組小鼠AS斑塊面積占血管總面積的百分比比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AS+VB6+LiCl組小鼠AS斑塊面積占血管總面積的百分比顯著高于AS+VB6組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A:對照組;B:AS組;C:VB6組;D:AS+LiCl組;E:AS+VB6組;F:AS+VB6+LiCL組。

2.3 VB6對6組小鼠胸主動(dòng)脈組織形態(tài)的影響

對照組小鼠血管內(nèi)皮光滑平整,排列整齊有序;AS組、AS+LiCl組和AS+VB6+LiCl組小鼠的血管組織結(jié)構(gòu)紊亂,血管內(nèi)皮粗糙;VB6組和AS+VB6組小鼠的血管壁結(jié)構(gòu)正常,血管內(nèi)皮光滑,細(xì)胞排列有序;見圖2。

A:對照組;B:AS組;C:VB6組;D:AS+LiCl組;E:AS+VB6組;F:AS+VB6+LiCl組。

2.4 6組小鼠胸主動(dòng)脈對Ach、SNP的舒張反應(yīng)比較

AS組小鼠Ach誘導(dǎo)的胸主動(dòng)脈舒張率顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); VB6組與對照組小鼠Ach誘導(dǎo)的胸主動(dòng)脈舒張率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AS+VB6組小鼠Ach誘導(dǎo)的胸主動(dòng)脈舒張率顯著高于AS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);AS+LiCl組、AS+VB6+LiCl組與AS組小鼠Ach誘導(dǎo)的胸主動(dòng)脈舒張率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AS+VB6+LiCl組小鼠Ach誘導(dǎo)的胸主動(dòng)脈舒張率顯著高于AS+VB6組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組小鼠SNP誘導(dǎo)的胸主動(dòng)脈舒張率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表2。

表2 6組小鼠胸主動(dòng)脈舒張率比較Tab.2 Comparison of the vasodilatation rate of thoracic aorta of mice among the six groups

2.5 6組小鼠胸主動(dòng)脈中NHE1蛋白表達(dá)量百分比比較

6組小鼠胸主動(dòng)脈中NHE1蛋白表達(dá)結(jié)果見圖3。對照組、AS組、VB6組、AS+LiCl組、AS+VB6組和AS+VB6+LiCl組小鼠胸主動(dòng)脈中NHE1蛋白表達(dá)量百分比分別為(9.011±2.244)%、(85.870±2.706)%、(9.133±1.824)%、(69.180±4.701)%、(30.330±3.312)%、(85.280±2.284)%。 AS組小鼠胸主動(dòng)脈中NHE1蛋白表達(dá)量百分比顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);VB6組與對照組小鼠胸主動(dòng)脈中NHE1蛋白表達(dá)量百分比比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AS+VB6組小鼠胸主動(dòng)脈中NHE1蛋白表達(dá)量百分比顯著低于AS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);AS+LiCl組、AS+VB6+LiCl組與AS組小鼠胸主動(dòng)脈中NHE1蛋白表達(dá)量百分比比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AS+VB6+LiCl組小鼠胸主動(dòng)脈中NHE1蛋白表達(dá)量百分比顯著高于AS+VB6組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A:對照組;B:AS組;C:VB6組;D:AS+LiCl組;E:AS+VB6組;F:AS+VB6+LiCl組。

3 討論

AS是一種與脂質(zhì)代謝障礙有關(guān)的全身性疾病,主要病變?yōu)閯?dòng)脈內(nèi)膜中脂質(zhì)沉積、內(nèi)膜纖維化及粥樣斑塊形成等。NHE1通過使細(xì)胞內(nèi)H+和細(xì)胞外Na+交換來維持細(xì)胞內(nèi)pH值與Na+濃度的動(dòng)態(tài)平衡。NHE1活化可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)pH下降、Na+濃度增加,引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載進(jìn)而導(dǎo)致鈣蛋白酶活化[12-13],這一過程被認(rèn)為是導(dǎo)致糖尿病微小血管并發(fā)癥發(fā)生的關(guān)鍵因素[5]。有研究表明,血管鈣蛋白酶活性的增加可導(dǎo)致內(nèi)皮功能異常[14]。VB6參與糖類和脂肪的代謝,在人體中起著極其重要的作用[15]。WANG等[16]研究顯示,補(bǔ)充B族維生素可以提高大鼠血脂代謝酶的活性,從而調(diào)節(jié)血清中脂質(zhì)水平,對AS有一定的預(yù)防作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,AS組小鼠的AS斑塊明顯,血管內(nèi)皮損傷嚴(yán)重,Ach介導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)顯著降低,血清中NO水平和SOD活性顯著下降,MDA水平顯著升高;給予VB6治療后,以上各項(xiàng)指標(biāo)均得到明顯改善。上述結(jié)果說明,ApoE-/-AS小鼠補(bǔ)充VB6可以顯著縮小胸主動(dòng)脈斑塊面積,維持血管內(nèi)皮細(xì)胞功能,保持細(xì)胞形態(tài)完整、排列有序。為了進(jìn)一步探討VB6防治AS的機(jī)制,本研究檢測了胸主動(dòng)脈中NHE1的表達(dá),結(jié)果顯示,補(bǔ)充VB6后可顯著改善AS小鼠血管內(nèi)皮功能障礙,降低胸主動(dòng)脈中NHE1的表達(dá)水平。值得注意的是,本研究觀察到LiCl可逆轉(zhuǎn)VB6對AS小鼠的改善作用。上述結(jié)果說明,VB6可通過抑制NHE1的表達(dá)來改善AS小鼠的氧化應(yīng)激,改善內(nèi)皮舒張功能和血管內(nèi)皮的損傷。

VB6通過抑制NHE1而改善AS的具體機(jī)制有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來揭示。通過查閱大量相關(guān)文獻(xiàn)推測,作為內(nèi)皮細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)因子,多種信號(hào)通路相關(guān)因子可能在這一過程中發(fā)揮作用,如人蛋白激酶Cβ、環(huán)前列腺素合酶、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶、蛋白激酶B、活化磷酸腺苷蛋白激酶、血管緊張素 Ⅱ、內(nèi)皮素、微RNA (microRNA,miRNA)等[17-22]。其中,miRNA由小的非編碼RNA組成,與信使RNA的特定3′-非翻譯區(qū)域結(jié)合,抑制信使RNA翻譯或促進(jìn)信使RNA降解。有研究通過RNA深度測序,在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中鑒定出400多個(gè)miRNA,這些miRNA對于維持內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)是必不可少的。同時(shí),一些miRNA,如miR-130、miR-133a和miR-199a/b,在靜態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞中不存在,但在血管平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞中表達(dá)較多[23];病理生理?xiàng)l件下,它們在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)異常[24]。他汀類藥物或其他藥物可抑制這些miRNA,使糖尿病、高脂血癥等患者的血管內(nèi)皮功能正?；Ｒ虼?推斷VB6可能通過特異性miRNA 逆轉(zhuǎn)NHE1的表達(dá)來改善動(dòng)脈粥樣硬化,具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究來探討。

4 結(jié)論

VB6可通過抑制NHE1表達(dá)來改善ApoE-/-AS小鼠血管內(nèi)皮功能障礙。由于血管內(nèi)皮功能障礙是包括AS、糖尿病和高血壓在內(nèi)的多種心血管疾病進(jìn)展的一個(gè)普遍起始點(diǎn)[25-26],因此,這一發(fā)現(xiàn)可能在新藥開發(fā)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。而本研究為AS的防治提供了理論依據(jù),并為進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。