陳偉杰，程苕莼，劉一村，卞兆連

(1.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 南通 226000;2.南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院消化內(nèi)科,江蘇 南通 226000)

單核巨噬細(xì)胞為先天性免疫細(xì)胞,是多種器官的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞,參與多種生理、病理過(guò)程,包括全身代謝、血管生成和組織修復(fù)、再生、纖維化,以及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲等[1-2]。單核巨噬細(xì)胞具有多樣性和可塑性,可根據(jù)特定的生物信號(hào)轉(zhuǎn)化為不同的表型,稱(chēng)為巨噬細(xì)胞極化。巨噬細(xì)胞可極化為M1型巨噬細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞[3]。M1型巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子,通常由輔助性T細(xì)胞(helper T cell,Th)1型細(xì)胞因子誘導(dǎo)。M2型巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子,通常由Th2型細(xì)胞因子誘導(dǎo)。明確巨噬細(xì)胞向M1或M2型極化的機(jī)制可能為以巨噬細(xì)胞為中心的多種疾病診斷和治療策略的制定提供參考[4]。白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-34是一種細(xì)胞因子,在炎癥和多種自身免疫性疾病的進(jìn)展中起重要作用[5-7]。IL-34與集落刺激因子-1(colony stimulating factor-1,CSF-1)共用同一種受體集落刺激因子-1受體(colony stimulating factor-1 receptor,CSF-1R),IL-34與CSF-1在巨噬細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用[8]。有研究發(fā)現(xiàn),在人單核細(xì)胞中,CSF-1和IL-34可觸發(fā)單核細(xì)胞增殖并向巨噬細(xì)胞分化[9]?；诖?本研究旨在探討IL-34對(duì)體外培養(yǎng)的單核巨噬細(xì)胞極化和遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司,胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購(gòu)自美國(guó)Cell Science 公司,粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、IL-6、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)、IL-4、IL-13購(gòu)自英國(guó) PEPRO Tech 公司,淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自美國(guó)Cytiva公司,CD14-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)、 CD86PerCP-cy7和CD163-Alexa Fluor 647購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;CD14免疫磁珠分選試劑盒和磁極、流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司,臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Sigma 公司。

1.2 原代外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的分離和培養(yǎng)

在征得供體知情同意后,采集健康人新鮮外周血5 mL置于抗凝管中,1 500 r·min-1離心10 min,盡量吸棄血清,加入1 mL生理鹽水稀釋。吸取4 mL 淋巴細(xì)胞分離液置于15 mL離心管內(nèi),將稀釋的血液沿管壁緩慢加入分離液上,保持界面清楚。20 ℃梯度離心30 min后,液體分為3層,稀釋的血清層和分離液之間可見(jiàn)一個(gè)以單核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶。吸取云霧層液體置于15 mL離心管中,加入5 mL生理鹽水,20 ℃梯度離心10 min,倒掉上層生理鹽水,再加入5 mL生理鹽水,20 ℃梯度離心10 min,倒掉上層生理鹽水。加入3 mL含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基,用移液槍將底部沉淀吹打混勻,即獲得PBMC。

1.3 免疫磁珠法分選CD14+單核細(xì)胞

根據(jù)CD14免疫磁珠分選試劑盒說(shuō)明書(shū),每1×107個(gè)PBMC加入50 μL偶聯(lián)CD14 抗體的磁珠和800 μL分選緩沖液,室溫孵育30 min。將裝有細(xì)胞的試管放置于磁分離架上,孵育8 min,吸棄上清,再次加入1 mL分選緩沖液孵育并棄上清,重復(fù)3次。洗脫后的細(xì)胞即為CD14+單核細(xì)胞,用100 μL緩沖液重懸細(xì)胞,加入20 μL CD14-FITC抗體,避光孵育30 min,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD14+單核細(xì)胞純度。

1.4 巨噬細(xì)胞極化及分組

用含體積分?jǐn)?shù)10%滅活FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整CD14+單核細(xì)胞密度為 3×109L-1,并接種于6孔板,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育9 d。將細(xì)胞分為M1型組、IL-34-M1型組、M2型組、IL-34-M2型組。M1型組和IL-34-M1型組細(xì)胞加入GM-CSF(20 μg·L-1)誘導(dǎo)5 d后,半量換液(吸棄一半舊培養(yǎng)基并加入一半新鮮的完全培養(yǎng)基),加入IFN-γ(20 μg·L-1)、LPS(100 μg·L-1)、IL-6(20 μg·L-1)和GM-CSF(20 μg·L-1)繼續(xù)誘導(dǎo) 4 d。M2型組和IL-34-M2型組細(xì)胞加入M-CSF(20 μg·L-1)誘導(dǎo)5 d,半量換液,加入M-CSF(20 μg·L-1)、IL-4(20 μg·L-1)、IL-6(20 μg·L-1) 和IL-13(20 μg·L-1)繼續(xù)誘導(dǎo)4 d。IL-34-M1型組和IL-34-M2型組細(xì)胞于誘導(dǎo)開(kāi)始和誘導(dǎo)第5天加入IL-34(100 μg·L-1)進(jìn)行共誘導(dǎo)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中M1、M2型巨噬細(xì)胞比例

于誘導(dǎo)第9天分別收集M1型組、IL-34-M1型組、M2型組、IL-34-M2型組細(xì)胞,M1型組和IL-34-M1型組細(xì)胞加入CD14-FITC、CD86 PerCP-cy7標(biāo)記,M2型組和IL-34-M2型組細(xì)胞加入CD14-FITC、CD163-Alexa Fluor 647 標(biāo)記。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞中CD14+CD86+細(xì)胞(M1型巨噬細(xì)胞)和CD14+CD163+細(xì)胞(M2型巨噬細(xì)胞)比例。

1.6 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)M2型組、IL-34-M2型組細(xì)胞遷移能力

于誘導(dǎo)第9天分別收集M2型組、IL-34-M2型組細(xì)胞,用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×108L-1,吸取200 μL加入到Transwell小室的上室,IL-34-M2型組下室加入含IL-34(100 μg·L-1)和體積分?jǐn)?shù)10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基,M2型組下室加入含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基,孵育36 h后取出小室,棄去培養(yǎng)液,棉簽小心擦去未穿過(guò)的細(xì)胞,磷酸鹽緩沖溶液洗滌3遍,加入多聚甲醛固定后進(jìn)行結(jié)晶紫染色,置于顯微鏡下觀察,隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù),取均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 單核細(xì)胞純度鑒定

通過(guò)磁珠分選法獲得了高純度的CD14+單核細(xì)胞,CD14陽(yáng)性率為(96.77±2.72)%,可用于巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo),結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 CD14+單核細(xì)胞純度Fig.1 Purity of CD14+ monocytes

2.2 各組巨噬細(xì)胞極化情況比較

M1型組、IL-34-M1型組中CD14+CD86+細(xì)胞比例分別為(43.20±7.59)%、(27.87±2.06)%,M2型組、IL-34-M2型組中CD14+CD163+細(xì)胞比例分別為(47.70±4.49)%、(58.95±3.65)%。IL-34-M1型組中CD14+CD86+細(xì)胞比例顯著低于M1型組,IL-34-M2型組中CD14+CD163+細(xì)胞比例顯著高于M2型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

A:M1型組;B:IL-34-M1型組;C:M2型組;D:IL-34-M2型組。

2.3 IL-34對(duì)M2型巨噬細(xì)胞遷移能力影響

M2型組、IL-34-M2型組巨噬細(xì)胞遷移數(shù)分別為(97.8±9.0)、(205.6±21.9)個(gè)。IL-34-M2型組巨噬細(xì)胞遷移數(shù)顯著多于M2型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 M2型組和IL-34-M2型組巨噬細(xì)胞遷移情況(結(jié)晶紫染色)Fig.3 Migration of macrophage in the M2 group and IL-34-M2 group (crystal violet staining)

3 討論

單核巨噬細(xì)胞是先天免疫防御機(jī)制中的重要組成部分,同時(shí)也參與了促進(jìn)和維持機(jī)體適應(yīng)性免疫的過(guò)程[10]。巨噬細(xì)胞為動(dòng)態(tài)的異質(zhì)性細(xì)胞,可表達(dá)特定的細(xì)胞表面標(biāo)志物和分泌具有廣泛生物學(xué)功能的分子,并且能夠根據(jù)局部微環(huán)境的改變進(jìn)行表型和功能的極化改變。極化的巨噬細(xì)胞中,M1型巨噬細(xì)胞通常由IFN-γ和腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo),該表型的特征是表達(dá)高水平的促炎細(xì)胞因子,如IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23和腫瘤壞死因子-α,具有強(qiáng)大的殺傷微生物和殺傷腫瘤細(xì)胞活性,同時(shí)其可以介導(dǎo)活性氧誘導(dǎo)的組織損傷,不利于組織再生和傷口愈合[4,11]。M2型巨噬細(xì)胞主要由IL-4和IL-13誘導(dǎo),發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、清除凋亡細(xì)胞、促進(jìn)血管再生以及組織重塑和功能修復(fù)的作用[12]。此外,極化后的M1型和M2型巨噬細(xì)胞在體內(nèi)和體外均可逆轉(zhuǎn)表型。因此,識(shí)別與巨噬細(xì)胞極化動(dòng)態(tài)變化相關(guān)的分子對(duì)于調(diào)控巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的治療策略至關(guān)重要。

研究發(fā)現(xiàn),CSF-1可以結(jié)合CSF-1R,觸發(fā)級(jí)聯(lián)信號(hào)通路,從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞分化和增殖。IL-34與CSF-1共享受體CSF-1R,被證明具有相同的誘導(dǎo)人單核細(xì)胞分化的能力,但二者在誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化能力上可能存在差異[9]。IL-34在骨髓系細(xì)胞(單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞)的存活、增殖和分化中也發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。CD86為M1型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志因子,CD163為M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志因子。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),IL-34-M1型組中CD14+CD86+細(xì)胞比例顯著低于M1型組,IL-34-M2型組中CD14+CD163+細(xì)胞比例顯著高于M2型組;說(shuō)明,IL-34可抑制巨噬細(xì)胞向M1型極化,并促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化。有研究證實(shí),在包括炎癥和自身免疫性疾病如炎癥性腸病、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病和銀屑病關(guān)節(jié)炎等多種疾病中,IL-34在mRNA和蛋白水平上表達(dá)增強(qiáng)[7,13]。IL-34可作為治療靶點(diǎn)通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化抑制某些疾病的進(jìn)展。有研究表明,IL-34通過(guò)促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化和抑制炎癥反應(yīng)保護(hù)肝臟免受ConA介導(dǎo)的炎癥產(chǎn)生的影響[14]。另外,IL-34在一些感染性疾病、代謝性疾病、神經(jīng)疾病以及癌癥中表達(dá)均增強(qiáng)[15],其對(duì)疾病的影響是否與對(duì)巨噬細(xì)胞的作用有關(guān)仍待進(jìn)一步研究。

巨噬細(xì)胞遷移是許多炎癥性疾病、自身免疫性疾病和癌癥發(fā)生發(fā)展的影響因素,原因?yàn)榫奘杉?xì)胞遷移可促進(jìn)促炎因子的積聚、組織的破壞和腫瘤的發(fā)展。因此,巨噬細(xì)胞的遷移也被認(rèn)為是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)[16]。研究表明,M1型巨噬細(xì)胞在炎癥部位的聚集是由較強(qiáng)的黏附和較弱的遷移能力所介導(dǎo)的;M2型巨噬細(xì)胞的強(qiáng)大遷移特性使這些細(xì)胞更容易離開(kāi)組織[17]。因此,本研究主要觀察了IL-34對(duì)M2型巨噬細(xì)胞遷移能力的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),IL-34-M2型組巨噬細(xì)胞的遷移數(shù)顯著多于M2型組,表明IL-34可作為趨化因子增強(qiáng)M2型巨噬細(xì)胞的遷移能力。有研究表明,IL-34可通過(guò)自分泌和旁分泌促進(jìn)癌癥的發(fā)生[18];此外,癌細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境內(nèi)的M2型巨噬細(xì)胞之間的相互作用是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的原因[19]。IL-34對(duì)巨噬細(xì)胞的遷移能力的影響是否與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)仍需要進(jìn)一步研究來(lái)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

IL-34可抑制人單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞向M1型極化,促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化,并可增強(qiáng)M2型巨噬細(xì)胞的遷移能力。巨噬細(xì)胞的極化及遷移能力在炎癥性疾病、自身免疫性疾病和癌癥等眾多疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,未來(lái)將進(jìn)一步探討IL-34是否能夠通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞的生物學(xué)功能影響疾病的進(jìn)程,以期尋找新的治療靶點(diǎn)。